يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الأوكسجين الجلوكوز الحرمان وعودة التأكسج باعتبارها

19.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52699

⸱

مايو 7, 2015

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Texas A&M University Health Science Center College of Medicine, 2Department of Surgery, Baylor Scott & White Health

في هذه المقالة

ملخص

< p class = 'jove_content'> ترتبط إصابة نقص التروية وإعادة التروية (IR) بمعدل مرتفع من المراضة والوفيات. الهدف من النموذج المختبري للحرمان من الأكسجين والجلوكوز وإعادة الأكسجين (OGD-R) الموصوف هنا هو تقييم آثار إصابة نقص التروية على مجموعة متنوعة من الخلايا ، لا سيما في الخلايا البطانية للحاجز الدموي الدماغي (BBB).

الملخص

ومن المعروف نقص التروية ضخه (IR) إصابة تسهم إسهاما كبيرا في معدلات الاعتلال والوفيات المرتبطة السكتات الدماغية الإقفارية. وتمثل الحوادث الوعائية الدماغية الإقفارية 80٪ من كل السكتات الدماغية. سبب شائع للإصابة IR هو التدفق السريع للسوائل بعد انسداد مزمن / حاد في الدم والمغذيات والأكسجين إلى الأنسجة مما ادى الى تكوين الجذور الحرة.

ويتبع السكتة الدماغية التي كتبها حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​اختلال وظيفي وعائية المنشأ وذمة الدماغ. هيكليا، منعطفات ضيقة (TJS) بين الخلايا البطانية تلعب دورا هاما في الحفاظ على سلامة حاجز الدم في الدماغ (BBB). إصابة IR هو ضرر الثانوية في وقت مبكر يؤدي إلى استجابة التهابية غير محددة. الأكسدة والإجهاد الأيضي التالية التهاب يؤدي تلف في الدماغ الثانوي بما في ذلك نفاذية BBB وتعطيل تقاطع ضيق (TJ) النزاهة.

بروتوكول لدينا ويعرض في المختبر </ م> مثال على الحرمان من الأكسجين الجلوكوز وعودة التأكسج (OGD-R) على الخلايا البطانية دماغ الفئران TJ النزاهة وتشكيل الألياف الإجهاد. حاليا، يتم استخدام عدة تجريبية في النماذج الحية لدراسة آثار الإصابة IR. ولكن لديهم العديد من القيود، مثل التحديات التقنية في أداء العمليات الجراحية، الجينات الجزيئية تعتمد التأثيرات وصعوبة في دراسة العلاقات الميكانيكية. ومع ذلك، قد تساعد في المختبر نماذج في التغلب على كثير من تلك القيود. بروتوكول المعروضة يمكن استخدامها لدراسة مختلف الآليات الجزيئية والعلاقات الآلية لتوفير الاستراتيجيات العلاجية المحتملة. ومع ذلك، فإن نتائج الدراسات في المختبر قد تختلف من مستوى الدراسات المجراة وينبغي تفسيرها بحذر.

المقدمة

تم العثور على نقص التروية ضخه (IR) إصابة أن يكون السبب كثرة من مختلف المضاعفات والوفيات الموهنة المرتبطة السكتة الدماغية، واحتشاء عضلة القلب، والصدمات النفسية، وأمراض الأوعية الدموية الطرفية وإصابات في الدماغ 1،2. إصابة IR في الأوعية الدماغية هو ضرر الثانوية في وقت مبكر مما يؤدي إلى الالتهاب و التورم 3. واحدة من المضاعفات الخطيرة التي تحدث نتيجة الأكسدة والإجهاد الأيضي التالية الالتهاب هو فقدان التوازن استتبابي مما يؤدي إلى تكوين الجذور الحرة، وتعديلات في حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​منعطفات ضيقة (TJS) والاوعية الدموية الدقيقة نفاذية 4،5.

حاليا، في النماذج الحية تستخدم لدراسة آثار إصابة IR على BBB تشمل وسط انسداد الشريان الدماغي (MCAO)، microembolism، وراثيا أو خروج المغلوب الحيوانات. ومع ذلك، كل له عيوبه والتقييدات التي ناقشها Hossmann 6. يستخدم MCAO نموذج لدراسة يالحظالخبر من التوتر الأكسدة والاختزال، والتغيرات في مجال الاتصالات صلي من BBB والتفاعل بين الدماغ والخلايا المناعية. ومع ذلك، فإنها تشكل تحديات تقنية مختلفة مثل الحاجة إلى إجراءات المجهرية الدقيقة والصعوبات فيها. Microembolism يكسر الفور أسفل BBB بينما استخدام المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب الحيوانات لدراسة نقص التروية الدماغية قد يكون تحديات مثل التأثيرات التي تعتمد على الجينات الجزيئية في تشكيل احتشاء، والتغيرات في تشريح الأوعية الدموية ومتفاوتة وزن الجسم 6. وبالتالي، في المختبر نماذج من نقص التروية وجدت تزايد الاهتمام في الآونة الأخيرة يرجع ذلك أساسا إلى تطبيقها في إجراء الدراسات الميكانيكية للمخدرات. ومع ذلك، فإن نتائج الدراسات في المختبر قد لا تمثل تماما في الدراسة المجراة ويجب أن تفسر بحذر 6.

وقد أثر معاكس تركيزات الأكسجين المنخفضة على الطبقات الوحيدة الخلية البطانية ونفاذية الاوعية الدموية الدقيقةيدرسها اوجاوا 7. واستخدمت الخلايا البطانية الفئران الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ (RBMECs) لتطوير في المختبر BBB. وقد تم تكييف الحرمان من الأكسجين الجلوكوز وعودة التأكسج (OGD-R) تقنية الواردة في هذا البروتوكول من الدراسات التي زولويتا وآخرون وتشو وآخرون 8،9. عرضنا الخلايا البطانية الدماغ لOGD-R عن طريق وضعها في غرفة نقص الأكسجة / نقص الأكسجين تحتوي على 0٪ O 2، 5٪ CO 2 و 95٪ N 2. تم تقييم الخلايا في وقت لاحق لإجراء تعديلات في TJ النزاهة والإجهاد تشكيل الألياف باستخدام توطين المناعي ووضع العلامات رودامين phalloidin على التوالي. يتم تنفيذ تلطيخ المناعي للنطيقة النطيقة-1 (ZO-1) لتحديد سلامة TJ، كما ZO-1 هو غشاء السقالات المهم المرتبط بالبروتين TJ. يحدد وضع العلامات رودامين Phalloidin الأكتين الخيطية (و -actin) في الهيكل الخلوي الخلية، وهو مؤشر واضح على أكتين تشكيل الألياف التوتر في الخلايا البطانية.

<ص الطبقة = "jove_content"> الهدف من هذه الطريقة هو توفير نظرة ثاقبة تطوير OGD-R كما في المختبر نموذج IR لدراسة BBB الخلايا البطانية TJ النزاهة وتشكيل الألياف الإجهاد و الأكتين. فإن النتائج توفر معلومات حول مصير البروتين TJ، ZO-1 وتشكيل الألياف الإجهاد التالية OGD-R. وفهم هذه العلاقات إتاحة الفرصة لتحديد الآليات الجزيئية الكامنة التي يتم تشغيلها بعد OGD-R وتطوير الاستراتيجيات العلاجية المحتملة لتعزيز تعطل BBB بعد العلاج OGD-R.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. البذر من الخلايا البطانية

  1. الحصول على الثقافات الأولية في RBMEC من الكبار الفئران سبراغ داولي (أو الحصول عليها تجاريا).
  2. زراعة RBMECs في 100 سم فبرونيكتين (50 ميكروغرام / مل) أطباق بتري المغلفة باستخدام الفئران الدماغ المتوسط ​​نمو الخلايا البطانية. تغيير المتوسطة كل يومين، حتى يتم التوصل confluency.
  3. على الوصول إلى 80-90٪ confluency، وغسل بلطف الخلايا في 5 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تدور. ثم يتم فصل الخلايا عن طريق تعريضهم ل1 مل باب الحارة 0.25٪ trypsin- حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) حل، معايرتها إلى 37 درجة مئوية.
  4. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق حتى يتم فصل الخلايا وتفرقوا.
    ملاحظة: اضغط على طبق ثقافة لفصل الخلايا. عرض الخلايا تحت المجهر للتأكد من مفرزة كاملة من الخلايا من سطح الطبق.
  5. إضافة وسائط 5 مل الكامل إلى طبق بتري من أجل تحييد التربسين.ماصة من المتوسط ​​تحتوي على خلايا منفصلة وأنه جمع في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. .
  6. أجهزة الطرد المركزي وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا البطانية في 220 x ج لمدة 5 دقائق.
  7. نضح طاف والحفاظ على بيليه تحتوي على cells.Suspend بيليه إلى 3-5 العذبة مل دماغ الفئران المتوسطة نمو الخلايا البطانية عن طريق خلط بلطف صعودا ونزولا مع خلايا ماصة سيتم ثم تحسب باستخدام عداد الخلية الآلي أو عدادة الكريات.
  8. نقل تعليق الخلية في فبرونيكتين (50 ميكروغرام / مل) المكسوة مسبقا والمحمولة 8 نظام الشرائح غرفة معقمة بشكل جيد، 0.7 سم 2 / جيد مع كثافة البذر تتراوح ما بين 10،000-15،000 الخلايا لكل بئر. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى يتم تحقيق التقاء
    ملاحظة: للحصول على أداء البقع الغربية أو تجارب أخرى، وخلايا يمكن زراعتها في 10 سم أطباق زراعة الخلايا أو أطباق خاصة حسب ما تقتضيه التجربة.

2. الأوكسجين والجلوكوز الحرمان عودة التأكسج في المختبرنموذج

ملاحظة: لقد تم تكييف البروتوكول التالي من زولويتا وآخرون. 1997؛ وقال تشو H وآخرون. 2012 8،9.

  1. استخدام نظام زراعة الخلايا نقص الأكسجة لدراسة آثار من OGD-R على RBMECs في (انظر الشكل 1). إعداد ومعايرة نظام زراعة الخلايا نقص الأكسجة قبل البدء في التجربة، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  2. إزالة الشرائح غرفة متموجة (الخطوة 1.8) من C حاضنة 37 درجة. استبدال المتوسطة كاملة في الشريحة الغرفة مع غير المؤكسج، لا الجلوكوز، معدلة المتوسطة النسر Dulbecco و(DMEM) ووضعها في غرفة نقص الأكسجة مع 95٪، N 2 و 5٪ CO 2 لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية، لتمثل حالة OGD.
  3. نقل الخلايا إلى حاضنة مع O 2، 5٪ CO 2 95٪ عند 37 درجة مئوية، وقدمت مع دماغ الفئران الخلايا البطانية المتوسطة كاملة الطازجة واحتضان لمدة ساعة 1 آخر عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: تمثل هذه الخطوة حالة عودة التأكسج.
  4. استخدام الشرائح الغرفة لتوطين المناعي ووضع العلامات رودامين phalloidin (انظر القسم 3).

3. المناعي توطين ZO-1 و F صفها -actin عن طريق الرودامين Phalloidin

  1. كشف الشرائح غرفة تحتوي على الطبقات الوحيدة RBMEC إلى 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام أوبتي-MEM / انخفاض المصل / جيد لمدة 1 ساعة. تغسل الشرائح الغرفة 3 مرات في 100 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7،0-7،2).
  2. إصلاح الخلايا باستخدام 100 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7،0-7،2) لمدة 15 دقيقة ويغسل الشرائح غرفة لمدة 3 مرات أكثر في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7،0-7،2).
  3. Permeabilize الخلايا باستخدام 100 ميكرولتر من 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني، (درجة الحموضة 7،0-7،2) لمدة 15 دقيقة أخرى. منع مع 100 ميكرولتر من 2٪ ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة. بعد هذه الخطوة إما خلايا وصمة عار / التسمية إما لZO-1 أو -و الأكتين.
    1. لالمناعي ستاining احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المضادة للأرنب ضد ZO-1 في 1: 150، الذي أعد في 2٪ BSA-PBS لO / N عند 4 درجات مئوية. غسل الخلايا 3 مرات في برنامج تلفزيوني، (درجة الحموضة 7،0-7،2). احتضان مع 100 ميكرولتر من فلوريسئين ثيوسيانات (FITC) -tagged المضادة للأرنب الضد الثانوية لمدة 1 ساعة على RT.
    2. لوضع العلامات رودامين Phalloidin، بعد حظر، كشف الخلايا إلى 100 ميكرولتر من رودامين phalloidin في 1:50 التخفيف، وأعد في 2٪ BSA-PBS، لمدة 20 دقيقة.
    3. غسل الخلايا من تلطيخ المناعي ووضع العلامات رودامين phalloidin في برنامج تلفزيوني، (درجة الحموضة 7،0-7،2). جبل الدوائر باستخدام وسائل الإعلام المتصاعدة التي تحتوي مكافحة تتلاشى كاشف مع دابي.
  4. تصور الخلايا باستخدام 60 X المياه عدسة غمر ويتم فحص الخلايا في طائرة البصرية واحدة تحت المجهر متحد البؤر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تعرض الخلايا المستزرعة على فبرونيكتين المكسوة مسبقا والمحمولة الشرائح غرفة نونك الثاني لOGD-R عن طريق وضع في نموذج 110 غرفة Biospherix ProOx. بعد إخضاع الخلايا لOGD-R، تم تجهيزها لZO-1 موصلي تلطيخ باستخدام تقنية المناعي كما هو مبين في الشكل (2) وتجميع هيكل الخلية مما يدل F-أكتين تشكيل الألياف الإجهاد باستخدام التسمية وصمة عار رودامين phalloidin كما هو مبين في الشكل (3). الخلايا التي كانت تحكم لم يتعرض OGD-R أظهرت سلامة صلي مستمرة بينما أظهرت الخلا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

OGD-R لتكون نموذجا في المختبر لإصابة نقص التروية ضخه تم راسخة لدراسة الخلايا العصبية 10،11. هناك أيضا الدراسات التي تبين تأثير OGD على الخلايا البطانية الدماغ وتغييرات في النفاذية وTJ سلامة 9. ومع ذلك، تظهر دراستنا تأثير OGD وكذلك عودة التأكسج، وهو تمثيل أقرب للإصابة ضخه الدماغية في الجسم الحي في الظروف التي تحدث بعد السكتة الدماغية.

ومن المعروف أن ظروف نقص الأوكسجين الدماغ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

ونحن نعترف سكوت وبرنامج المنح البحثية مستشفى الأبيض للحصول على الدعم المالي وتكساس A & M مركز العلوم الصحية كلية طب المختبرات المتكاملة التصوير لاستخدام المجهر ليزر متحد البؤر. ونحن نعترف السيد غلين كراير للمساعدة في تحرير مخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Proox model 110BiospherixModel 110
DMEM ، بدون جلوكوزGibco ، تقنيات Life11966-025
تقنيات Rhodamine PhalloidinLifeR415
ZO-1 Rabbit Polyclonal AntibodyLifeتقنيات الحياة 617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 & nbsp ؛ معقمة بشكل جيد ، زجاج   ؛ الشرائح الجسمالموسومة بالحرارة العلمي 177402
FITC  سانتا كروزsc-2090
DPBS 1XThermo ScientificSH 30028.03يمكن استخدام أي برنامج تلفزيوني آخر متاح
المضاد الثانوي المضاد للأرانب

المراجع

  1. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  2. Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
  3. Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
  4. Kaur, C., Ling, E. A. Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions. Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).
  5. Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).
  6. Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
  7. Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
  8. Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
  9. Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
  10. Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
  11. Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
  12. Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
  13. Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
  14. Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
  15. Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نموذج إعادة الأكسجةسلامة الموصلات المحكمةتكوين ألياف الإجهادالمجهر البؤريتلوين التألق المناعيغرفة نقص الأكسجةالخلايا البطانية في دماغ الجرذ
الأوكسجين الجلوكوز الحرمان وعودة التأكسج باعتبارها
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.