أجهزة الورقية للعزل وتوصيف خارج الخلية الحويصلات

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جزيئات غشائية غير متجانسة يتراوح حجمها من 40 نانومتر إلى 5,000 نانومتر ويتم إطلاقها بنشاط بواسطة العديد من أنواع الخلايا عبر طرق التكوين الحيوي^{المختلفة من 1 إلى 9}. تحتوي على مجموعات فرعية فريدة ومختارة من الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتينات وعلامات السطح من الخلايا الأبوية. إن مشاركتهم في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية ، مثل الاتصال بين الخلايا¹⁰ ، وتعديل المناعة¹¹ ، وتكوين الأوعية^{الدموية 12} ، والورم الخبيث¹² ، والمقاومة^{الكيميائية 13} ، وتطور أمراض العيون⁹ ، معترف بها بشكل متزايد وقد أثارت اهتماما كبيرا بفائدتها في تطبيقات التشخيص والتنبؤات والعلاجية والبيولوجيا الأساسية.

يمكن تصنيف < p class = 'jove_content'>EVs بشكل كلاسيكي على أنها أجسام خارجية ، وحويصلات دقيقة ، وأجسام موت الخلايا المبرمج ، والأورام ، والجسيمات الخارجية ، والجسيمات الدقيقة ، والجسيمات عن بعد ، وجسيمات البروستاتوزيم ، وجسيمات القلب ، والمركبات ، وما إلى ذلك ، بناء على نشأتها الحيوية أو أصلها الخلوي. على سبيل المثال ، تتشكل الإكسوسومات في أجسام متعددة الحويصلات ، بينما تتولد الحويصلات الدقيقة عن طريق التبرعم مباشرة من غشاء البلازما والحويصلات موت الخلايا المبرمج من الخلايا المبرمجة أو النخرية. ومع ذلك ، لا تزال التسمية قيد التحسين ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الافتقار إلى الفهم الشامل وتوصيف المركبات الكهربائية. تم تطوير عدة طرق لتنقية المركبات الكهربائية ، بما في ذلك الطرد المركزي^{الفائق 14} ، والترشيح^{الفائق 15} ، والخرز المغناطيسي¹⁶ ، وهطول الأمطار البوليمرية^17-19 ، وتقنيات الموائع^{الدقيقة 20-22}. يتضمن الإجراء الأكثر شيوعا لتنقية المركبات الكهربائية سلسلة من أجهزة الطرد المركزي و / أو الترشيح لإزالة الحطام الكبير والملوثات الخلوية الأخرى ، متبوعا بعملية طرد مركزي فائق نهائية عالية السرعة ، وهي عملية باهظة الثمن ومملة وغير محددة^14،23،24. لسوء الحظ ، لم يتم تلبية الحاجة التكنولوجية لعزل سريع وموثوق للمركبات الكهربائية بنقاء وكفاءة مرضيين.

لقد قمنا بتطوير جهاز تقارب مناعي ورقي يوفر طريقة بسيطة وموفرة للوقت والتكلفة ولكنها فعالة لعزل وتوصيف مجموعات فرعية من المركبات^{الكهربائية 22}. يمكن ترتيب ورق السليلوز المقطوع في شكل محدد وتصفيحه باستخدام لوحين بلاستيكيين مع فتحات مسجلة. على عكس الإستراتيجية العامة لتحديد حدود السوائل في الأجهزة الورقية عن طريق طباعة الشمع أو البوليمرات الكارهة للماء^25-27 ، فإن أنماط الورق الرقائقي هذه مقاومة للعديد من السوائل العضوية ، بما في ذلك الإيثانول. يتم تعديل مناطق الاختبار الورقية كيميائيا لتوفير تغطية مستقرة وكثيفة لجزيئات الالتقاط (على سبيل المثال ، الأجسام المضادة الخاصة بالهدف) التي لها تقارب كبير مع علامات سطحية محددة في المجموعات الفرعية للمركبات الكهربائية. يمكن سحب العينات البيولوجية مباشرة على مناطق اختبار الورق، ويتم الاحتفاظ بالمركبات الكهربائية المنقاة بعد خطوات الشطف. يمكن إجراء توصيف المركبات الكهربائية المعزولة عن طريق SEM و ELISA والتحليل النسخي.

ويرد المخطط العام لإجراء عملية في الشكل 1. عن طريق الممارسات الأخلاقية، فإننا جمع عينات الدم من الأصحاء، والحصول على عينات الخلط المائي من المرضى من خلال تايتشونغ مستشفى المحاربين القدماء العام (TCVGH)، تايتشونغ، تايوان تحت افق IRB البروتوكولات ( IRB TCVGH رقم CF11213-1).

1. تصنيع أجهزة ورقة

1. قطع ورقة اللوني الى دوائر من 5 ملم في القطر لتوفير نفس التخطيط باعتباره وحة microtiter 96-جيدا. ساندويتش هذه القطع الورقية مع ورقة من البوليستيرين مع اثنين من المسجلين من خلال الثقوب، وصفح.
2. تعديل الأجهزة الورق باستخدام طريقة الاقتران الكيميائية موضح في الخطوات التالية ^28.
   1. علاج أجهزة رقة مع البلازما الأكسجين (100 ميغاواط، 1٪ أكسجين و 30 ثانية) في غرفة البلازما.
      تنبيه: يجب أن تؤخذ بحذر خاص عند العمل مع trimethoxysilane 3-mercaptopropyl وN--γ maleimidobutyryloxy succinimideاستر (GMBS)، لأنها على حد سواء الرطوبة حساسة وسامة. ارتداء القفازات الواقية وتجنب استنشاق أو ملامسة الجلد والعينين. إبقاء زجاجة الأسهم مغلقة بإحكام والسماح لها لكي تتوازن لRT قبل فتح لتجنب تكثيف الماء. بدلا من ذلك، فتح زجاجة الأسهم داخل كيس القفازات مليئة النيتروجين أو مربع. قسامة في قوارير صغيرة لتجنب افتتاح المتكرر لزجاجة الأسهم.
   2. على الفور احتضان تعامل الأجهزة الورق في 4٪ (ت / ت) حل 3-mercaptopropyl trimethoxysilane في الإيثانول (200 دليل) لمدة 30 دقيقة.
   3. شطف أجهزة رقة مع الايثانول واحتضان لهم مع 0.01 مكرومول / GMBS مل في الإيثانول لمدة 15 دقيقة.
   4. شطف مع الإيثانول (200 دليل)، واحتضان الأجهزة الورق مع 10 ميكروغرام / مل حل أفيدين في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. تخزينها في 4 ° C إذا لزم الأمر، واستخدام في غضون 4 أسابيع.
3. الرطب كل مناطق رقة الاختبار مع 10 ميكرولتر PBS تحتوي على 1٪ (ث / ت) ألبومين المصل البقري (BSA) لمدة 3 × 10 دقيقة قبل اكتشاف 10 ميكرولتر المعقدة البيروكسيديز جزيئات القبض لمدة 3 × 10 دقيقة. استخدام مكافحة CD63 الأجسام المضادة (20 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ (ث / ت) BSA وبنسبة 0.09٪ (ث / ت) أزيد الصوديوم) أو annexin V (1:20، / V V V في annexin العازلة ملزمة) كما جزيئات الالتقاط.
4. شطف غير منضم الأجسام المضادة أو annexin V مكافحة CD63 الجزيئات باستخدام 10 ميكرولتر المقابلة PBS تحتوي على 1٪ (ث / ت) BSA أو annexin V حلول العازلة ملزمة لمدة 3 × 1 دقيقة، على التوالي.

2. المصل ومائي فكاهة جمع العينات وتجهيز

1. جمع المصل.
   1. جمع 10 مل من الدم المحيطي من بزل الوريد في أنابيب فصل المصل وعكس بلطف أنبوب خمس مرات. تعيين أنبوب في وضع عمودي والانتظار لمدة 30 دقيقة.
   2. الطرد المركزي في 1،200 × ز لمدة 15 دقيقة. نقل المصل من الطبقة العليا إلى أنبوب نظيفة، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 3،000 × ز لمدة 30 دقيقة.
   3. تمرير طاف خلال 0.8 ميكرون سن الفيلثالثا. الحفاظ على عينة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. مائي جمع النكتة: جمع عينات من الخلط المائي من المرضى الذين شخصت من قبل طبيب عيون مباشرة من خلال الإجراءات وعينات متجر الغازية في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3. عزل خارج الخلية الحويصلات

1. عينات بقعة على كل منطقة اختبار الورق بمعدل 5 ميكرولتر / دقيقة.
2. شطف المركبات الكهربائية غير منضم مع 10 ميكرولتر المقابلة PBS تحتوي على 1٪ (ث / ت) BSA أو annexin V ملزمة حلول عازلة لمدة 3 × 1 دقيقة لأجهزة رقة بين functionalized مع مكافحة CD63 الأجسام المضادة أو annexin V الجزيئات، على التوالي. إجراء المقايسات المصب التالية.

4. المصب الفحص مثال 1: Electromicrographs الضوئي

1. إصلاح المركبات الكهربائية القبض على بين functionalized منطقة اختبار الورق باستخدام 10 ميكرولتر 0.5 × تثبيتي Karnovsky لمدة 10 دقيقة.
2. شطف العينات مع PBS واسعا ل2 × 5 دقائق.
3. يذوىالعينات مع احق الايثانول 35٪ لمدة 10 دقيقة، والإيثانول 50٪ لمدة 2 × 10 دقيقة، والإيثانول 70٪ لمدة 2 × 10 دقيقة، والإيثانول 95٪ لمدة 2 × 10 دقيقة، والإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 4 × 10 دقيقة.
4. تنتقد الجافة وتفل معطف العينات مع البلاديوم / الذهب، ودراسة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح تعمل في انخفاض تسارع الإلكترون الجهد (~ 5 كيلو فولت).

5. المصب الفحص مثال 2: ELISA الورقية

1. إضافة إلى حل 5 ميكرولتر تحتوي على مكافحة CD9 الأجسام المضادة الأولية في 1: 1،000 التخفيف في برنامج تلفزيوني على كل منطقة الاختبار التي تحتوي على المركبات الكهربائية التي تم التقاطها. انتظر 1 دقيقة.
2. شطف عينات مع 30 مل PBS اهتزت عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
3. إضافة 5 ميكرولتر محلول يحتوي الفجل البيروكسيديز (HRP) -linked الضد الثانوية في 1: 1،000 التخفيف في برنامج تلفزيوني وانتظر 1 دقيقة.
4. شطف عينات مع 30 مل PBS اهتزت عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
5. إضافة 5 ميكرولتر الركيزة اللونية التي تحتوي على نسبة 1: 1 حجم الهيدروجين بيروكسيد لد 3،3 '، 5،5'-tetramethylbenzidine (TMB) والمسح الضوئي باستخدام ماسحة سطح المكتب.

6. المصب الفحص مثال 3: عزل الحمض النووي الريبي

1. تزج العينات في 35 ميكرولتر من المساعدات العزلة RNA القائم على بوفيدون و 265 ميكرولتر من تحلل / العازلة ملزمة لليز المركبات الكهربائية التي تم التقاطها. دوامة بقوة.
2. إضافة 30 ميكرولتر جناسة المنصوص عليها في عدة العزلة إلى المحللة. دوامة بقوة وضعت على الجليد لمدة 10 دقيقة.
3. استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام حمض فصل الفينول كلوروفورم موضح في الخطوات التالية.
   1. تأخذ 330 ميكرولتر من الفينول كلوروفورم من الطبقة السفلى من القمقم وإضافة إلى جناسة / المحللة. دوامة بقوة.
   2. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 5 دقائق. نقل (العليا) المرحلة المائية لأنبوب نظيفة ونلاحظ حجم إزالتها.
4. ترسيب الحمض النووي الريبي مجموع مع الإيثانول بنسبة 100٪ من حجم هذا هو 1.25 أضعاف حجم المرحلة المائية إزالتها في الخطوة السابقة والتعاونllect الحمض النووي الريبي في حل شطف مسخن إلى 95 ° C.
5. التركيز ومواصلة تنقية RNA باستخدام طقم تنظيف RNA فقا لبروتوكول تصنيع.

قدرة الجهاز رقة لعزل مجموعات فرعية من المركبات الكهربائية تعتمد بكفاءة عند التحقق حساس ونوعي لها من علامات سطح EV. ويتحقق تعديل مستقر للألياف ورقية مع جزيئات التقاط باستخدام أفيدين-البيوتين الكيمياء كما هو موضح في أماكن أخرى 28-30. ويتم تقييم فعالية تصريف المواد الكيميائية وذلك من طريقة physisorption باستخدام قراءات القائم على مضان. يتم إعداد مناطق اختبار الورقة التالية الخطوة بروتوكول 1) باستثناء جزيء التقاط يتم استبدال مع جزيئات البيوتين 20 ميكروغرام / مل fluorophore R-فيكوإيريترين مترافق (PE-البيوتين) في الخطوة 1.3. ثم يتم شطفها المناطق رقة الاختبار مع PBS لإزالة جزيئات PE البيوتين غير منضم. في المقابل، 10 ميكرولتر 20 ميكروغرام / مل PE-البيوتين في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ (ث / ت) BSA وبنسبة 0.09٪ (ث / ت) ورصدت أزيد الصوديوم مباشرة على منطقة الاختبار ورقة لمدة 3 × 10 دقيقة، تليها PBS شطف لإجراء physisorption من-PE البيوتين جزيئات الصبغة. كيميائياأجهزة رقة معدلة ("ورقة + crosslinker + صبغ") جنبا إلى جنب مع الأجهزة رقة غير المجهزة ("ورقة")، وأجهزة رقة معدلة مع نفس البروتوكول دون تطبيق الجزيئات-PE البيوتين ("ورقة + crosslinker") والأجهزة الورق مع physisorbed يتم حفظ جزيئات البيوتين PE-("physisorbed صبغ") يتم فحص باستخدام نظام صورة الرقم القياسي ل540-560 نانومتر الإثارة، 575 الانبعاث نانومتر طويلة تمرير، والبيانات في شكل ملفات 16-بت وتحليلها باستخدام برنامج يماغيج. كما هو مبين في الشكل 2A، وكثافة مضان من مناطق اختبار بواسطة طريقة الاقتران الكيميائية أعدت أعلى بكثير بالمقارنة مع مناطق اختبار ورقة المغلفة جسديا (ع القيمة <0.0005، ن = 5، اختبار t الطالب). واسر من المركبات الكهربائية هو أيضا محددة كما يتضح في الشكل 2B، C، حيث يتم الاحتفاظ القليلة المركبات الكهربائية على الجهاز ورقة عندما يتم استبدال جزيئات أسر حل PBS.

المركبات الكهربائية غير متجانسة في سيZES، محتويات محددة، وطرق نشوء حيوي. لربط لهم، وأجهزة رقة المغلفة مع اثنين من جزيئات مختلفة التقاط EV، والأجسام المضادة لمكافحة CD63 وannexin V، تم إعداد. وأثرى CD63، وهو عضو في الأسرة tetraspanin (والذي يتضمن CD9، CD63، CD81 CD82 والجزيئات) على EV غشاء 31، وannexin V لديه تقارب قوي لفسفاتيديل (PS) 32،33. تبين أن يتم إطلاق المركبات الكهربائية جوهري خلال موت الخلايا المبرمج في وقت مبكر أو في ظل ظروف الإجهاد، والتي تفقد فيها عملية العادي خلية التماثل فوسفورية، مما يؤدي إلى زيادة التعرض للPS على النشرة الخارجية للغشاء EV. تحليلات من الصور SEM تبين أن حجم التوزيعات من CD63 + المركبات الكهربائية وPS + المركبات الكهربائية مختلفة، بأقطار يعني من 80 و 43 نانومتر، على التوالي (الشكل 3) يستخدم. وثنائي الطرف اختبار t الطالب لتحديد الإحصائية ف القيمة (ص القيمة <0.0001). والمثير للدهشة، تظهر CD63 + المركبات الكهربائية مستدير وأكبر من PS + المركبات الكهربائية في المتوسط، والذي البيولوجية تبقى أهمية إلى توضيح.

RNA من المركبات الكهربائية القبض على الجهاز ورقة يمكن استخراج. وأظهرت التحليلات مع bioanalyzer ملامح الشاملة مماثلة لمجموع الرنا المستخرجة من CD63 + وPS + المركبات الكهربائية (الشكل 4A). مقارنة مع كميات من الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام تقنيات ميكروفلويديك وتنبيذ فائق، على التوالي حوالي مرتين وتم استخراج 39 مرات أكثر الرنا لكل وحدة حجم من عينة مصل الدم باستخدام جهاز الورق، وإن كان ذلك باستخدام حجم العينة أصغر (الجدول 1). P-ELISA يمكن القيام بها للكشف عن السيارات الكهربائية. وتستخدم مضادة للCD9 الأجسام المضادة الأولية والثانوية الضد HRP-مترافق في هذه الدراسة. الشكل 4B يعرض التغيرات في القيمة الرمادية التي تنتجها رد فعل الأنزيمية من HRP للأجهزة رقة تطبيقها مع 10 ميكرولتر PBS، 50٪ مصل (مخفف مع PBS)، أو 100 مصل٪، على التوالي. قيمة الرمادية يزيد خطيا ضمن مجموعة من عينات المصل اختبارها.

> أجهزة ورقة هي مفيدة خصوصا عندما كمية عينة محدودة مثل في حالة من الخلط المائي، وعندما فقط <200 ميكرولتر / العين يمكن جمعها. وغالبا ما يحتاج عينات متعددة وتجمع معا إذا طرق عزل أخرى، على سبيل المثال، تنبيذ فائق، والمراد استخدامها. المركبات الكهربائية من المرضى عينات الخلط المائي معزولة مع أجهزة رقة المغلفة مع أضداد CD63 يمكن أن يرى في الصور SEM أظهرت كما في الشكل (5).

يتم قطع الشكل 1. الإجراء تصنيع وتشغيل المقايسات الورقية التي تهدف إلى عزل وتوصيف الحويصلات خارج الخلية. (A) تصفية الورق في الشكل المطلوب ومغلفة. يتم تعديل (B) على سطح الورق مع العلاج وجيزة من البلازما الأكسجين وكان رد فعل مع trimethoxysilane 3-mercaptopropyl، N </ م> -γ-maleimidobutyryloxy succinimide استر، وNeutrAvidin، في هذا النظام. الجزيئات المعقدة البيروكسيديز القبض، على سبيل المثال، والأجسام المضادة، ويمكن بعد ذلك ثبتوا عبر تقارب قوي بين البيوتين والجزيئات NeutrAvidin. (C) Biosamples يمكن أن تكون ماصة على الجهاز ورقة بين functionalized. الحويصلات خارج الخلية يمكن أن تكون معزولة. (D) المقايسات المصب، مثل SEM، Transcriptome على، وELISA (كما هو موضح)، لا يمكن أن يؤديها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. الحويصلات خارج الخلية (المركبات الكهربائية) يمكن التقاطها على أجهزة رقة بين functionalized مع خصوصية وحساسية جيدة. ويجمد للغاية (A) جزيئات البيوتين Fluorescently المسمى على ورقةالجهاز عن طريق عملية الاقتران الكيميائية ("ورقة + crosslinker + صبغ") وعلى النقيض من الامتزاز الفيزيائي ("physisorbed صبغ"). ورقة غير المجهزة ("ورقة") والجزيئات الاقتران ("ورقة + crosslinker") تساهم قليلا لشدة مضان. (ب) SEM صورة تمثيلية تظهر بعض المركبات الكهربائية يتم التقاطها على الجهاز ورقة غير تحديدا عندما يتم استبدال جزيئات أسر PBS تحتوي على 1٪ (ث / ت) BSA. يتم الاحتفاظ (C) العديد من المركبات الكهربائية على الأجهزة رقة المغلفة مع الأجسام المضادة لمكافحة CD63. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. المجموعات الفرعية من الحويصلات خارج الخلية (المركبات الكهربائية) يمكن أن يكون حجم التوزيعات المختلفة. (A)و (ب) هي صور SEM تمثيلية من المركبات الكهربائية استولت على أجهزة رقة المغلفة مع الأجسام المضادة لمكافحة CD63 والجزيئات annexin V، على التوالي. (C) CD63 + المركبات الكهربائية تبدو أكبر من PS + المركبات الكهربائية تحت الظروف التجريبية المستخدمة في هذه الدراسة (ع القيمة <0.0001، ن = 124 و 203، اختبار t الطالب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. Transcriptome على التكرير والتسويق وELISA المقايسات. (A) البيانات Bioanalyzer تبين شدة (المحور الصادي، في وحدات التعسفي) وحجم (محور س، في النيوكليوتيدات (NT)) توزيعات fluorescently المسمى الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من المركبات الكهربائية استولت على مكافحة CD63 المغلفة V-الأضداد أو annexin أوراق الترشيح. ذروة المهاجرة في ~ 25 يمثل الإقليم الشمالي معيار داخلي. (ب) التغيرات في القيمة رمادي ينتج عن تفاعل الأنزيمي من الفجل البيروكسيديز (HRP) في مقايسة P-ELISA لأجهزة رقة تطبيقها مع 10 عينات ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، 50٪ مصل (مخفف مع PBS) و 100 عينات٪ مصل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5. الحويصلات خارج الخلية (المركبات الكهربائية) في عينات الخلط المائي يمكن التقاطها على ورق الترشيح بين functionalized دون تجميع العينة. الصور SEM من CD63 + معزولة المركبات الكهربائية في عينات الخلط المائي من المرضى الذين يعانون من (A) المرتبطة بالعمر الضمور البقعي، (B) البقعي السكري وذمة، و (C) اعتلال وعائي المشيمية polypoidal، على التوالي.تحميل / 52722 / 52722fig5highres.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

طريقة العزلة	القبض على جزيء	المجلد المصل. (ميكرولتر)	متوسط ​​الحمض النووي الريبي المستخرج (نانوغرام)	متوسط ​​استخراج الحمض النووي الريبي / مصل (جزء من الغرام / ميكرولتر)	نسبة متوسط ​​RNA / مصل	المرجع
جهاز ميكروفلويديك	CD63 مكافحة الإنسان	400	4.14	10.4	20	20
جهاز الورق	CD63 مكافحة الإنسان	72	1.49 ± 0.08	20.7	39	22
جهاز الورق	annexin V	72	0.99 ± 0.26	13.8	26	22
تنبيذ فائق	-	2،000	1.06 ± 0.64	0.53	1
مصل الدم	-	72	1.23 ± 0.58	17	32	22

الجدول 1. مجموع الحمض النووي الريبي المستخرج من عينات الدم من المتطوعين الأصحاء تحليلها مع bioanalyzer (ن = 4 لجميع الظروف).

تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.