Method Article

أجهزة الورقية للعزل وتوصيف خارج الخلية الحويصلات

DOI:

10.3791/52722

⸱

April 3rd, 2015

 ,  ,  , 
1Institute of Nanoengineering and Microsystems, National Tsing Hua University, 2Taichung Veterans General Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول تفاصيل طريقة لعزل الحويصلات خارج الخلية (المركبات الكهربائية)، والجسيمات غشائي صغيرة أطلق سراحهم من الخلايا، من اقل من 10 عينات مصل ميكرولتر. هذا النهج تلتف الحاجة إلى تنبيذ فائق، لا يتطلب سوى بضع دقائق من الوقت الفحص، وتمكن من عزل المركبات الكهربائية من عينات من وحدات التخزين محدودة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحويصلات خارج الخلية (المركبات الكهربائية)، والجسيمات غشائي المفرج عنهم من أنواع مختلفة من الخلايا، عقد إمكانات كبيرة للتطبيقات السريرية. أنها تحتوي على حمض النووي والبروتين البضائع ويتم الاعتراف بشكل متزايد كوسيلة للتواصل بين الخلايا التي يستخدمها كلا حقيقي النواة والخلايا بدائيات النوى. ولكن نظرا لصغر حجمها، والبروتوكولات الحالية لعزل المركبات الكهربائية وغالبا ما تكون مضيعة للوقت، مرهقة، وتتطلب كميات عينة كبيرة ومعدات باهظة الثمن، مثل نابذة فائقة السرعة. لمعالجة هذه القيود، قمنا بتطوير منصة immunoaffinity الورقية لفصل مجموعات فرعية من المركبات الكهربائية التي هي سهلة وفعالة، ويتطلب كميات عينة منخفضة تصل إلى 10 ميكرولتر. عينات بيولوجية يمكن pipetted مباشرة على مناطق رقة الاختبار التي تم تعديلها كيميائيا مع جزيئات القبض التي لديها قابلية عالية لعلامات محددة سطح EV. ونحن تحقق من صحة الفحص باستخدام المجهر الإلكتروني (SEM)، الورقية انزيم مرتبط immunosorbenر المقايسات (P-ELISA)، وتحليل Transcriptome على. ستمكن هذه الأجهزة الورقية دراسة المركبات الكهربائية في العيادة وإعداد البحوث للمساعدة في دفع فهمنا من وظائف EV في الصحة والمرض.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جزيئات غشائية غير متجانسة يتراوح حجمها من 40 نانومتر إلى 5,000 نانومتر ويتم إطلاقها بنشاط بواسطة العديد من أنواع الخلايا عبر طرق التكوين الحيويالمختلفة من 1 إلى 9. تحتوي على مجموعات فرعية فريدة ومختارة من الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتينات وعلامات السطح من الخلايا الأبوية. إن مشاركتهم في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية ، مثل الاتصال بين الخلايا10 ، وتعديل المناعة11 ، وتكوين الأوعيةالدموية 12 ، والورم الخبيث12 ، والمقاومةالكيميائية 13 ، وتطور أمراض العيون9 ، معترف بها بشكل متزايد وقد أثارت اهتماما كبيرا بفائدتها في تطبيقات التشخيص والتنبؤات والعلاجية والبيولوجيا الأساسية.

يمكن تصنيف < p class = 'jove_content'>EVs بشكل كلاسيكي على أنها أجسام خارجية ، وحويصلات دقيقة ، وأجسام موت الخلايا المبرمج ، والأورام ، والجسيمات الخارجية ، والجسيمات الدقيقة ، والجسيمات عن بعد ، وجسيمات البروستاتوزيم ، وجسيمات القلب ، والمركبات ، وما إلى ذلك ، بناء على نشأتها الحيوية أو أصلها الخلوي. على سبيل المثال ، تتشكل الإكسوسومات في أجسام متعددة الحويصلات ، بينما تتولد الحويصلات الدقيقة عن طريق التبرعم مباشرة من غشاء البلازما والحويصلات موت الخلايا المبرمج من الخلايا المبرمجة أو النخرية. ومع ذلك ، لا تزال التسمية قيد التحسين ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الافتقار إلى الفهم الشامل وتوصيف المركبات الكهربائية. تم تطوير عدة طرق لتنقية المركبات الكهربائية ، بما في ذلك الطرد المركزيالفائق 14 ، والترشيحالفائق 15 ، والخرز المغناطيسي16 ، وهطول الأمطار البوليمرية17-19 ، وتقنيات الموائعالدقيقة 20-22. يتضمن الإجراء الأكثر شيوعا لتنقية المركبات الكهربائية سلسلة من أجهزة الطرد المركزي و / أو الترشيح لإزالة الحطام الكبير والملوثات الخلوية الأخرى ، متبوعا بعملية طرد مركزي فائق نهائية عالية السرعة ، وهي عملية باهظة الثمن ومملة وغير محددة14،23،24. لسوء الحظ ، لم يتم تلبية الحاجة التكنولوجية لعزل سريع وموثوق للمركبات الكهربائية بنقاء وكفاءة مرضيين.

لقد قمنا بتطوير جهاز تقارب مناعي ورقي يوفر طريقة بسيطة وموفرة للوقت والتكلفة ولكنها فعالة لعزل وتوصيف مجموعات فرعية من المركباتالكهربائية 22. يمكن ترتيب ورق السليلوز المقطوع في شكل محدد وتصفيحه باستخدام لوحين بلاستيكيين مع فتحات مسجلة. على عكس الإستراتيجية العامة لتحديد حدود السوائل في الأجهزة الورقية عن طريق طباعة الشمع أو البوليمرات الكارهة للماء25-27 ، فإن أنماط الورق الرقائقي هذه مقاومة للعديد من السوائل العضوية ، بما في ذلك الإيثانول. يتم تعديل مناطق الاختبار الورقية كيميائيا لتوفير تغطية مستقرة وكثيفة لجزيئات الالتقاط (على سبيل المثال ، الأجسام المضادة الخاصة بالهدف) التي لها تقارب كبير مع علامات سطحية محددة في المجموعات الفرعية للمركبات الكهربائية. يمكن سحب العينات البيولوجية مباشرة على مناطق اختبار الورق، ويتم الاحتفاظ بالمركبات الكهربائية المنقاة بعد خطوات الشطف. يمكن إجراء توصيف المركبات الكهربائية المعزولة عن طريق SEM و ELISA والتحليل النسخي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد المخطط العام لإجراء عملية في الشكل 1. عن طريق الممارسات الأخلاقية، فإننا جمع عينات الدم من الأصحاء، والحصول على عينات الخلط المائي من المرضى من خلال تايتشونغ مستشفى المحاربين القدماء العام (TCVGH)، تايتشونغ، تايوان تحت افق IRB البروتوكولات ( IRB TCVGH رقم CF11213-1).

1. تصنيع أجهزة ورقة

  1. قطع ورقة اللوني الى دوائر من 5 ملم في القطر لتوفير نفس التخطيط باعتباره وحة microtiter 96-جيدا. ساندويتش هذه القطع الورقية مع ورقة من البوليستيرين مع اثنين من المسجلين من خلال الثقوب، وصفح.
  2. تعديل الأجهزة الورق باستخدام طريقة الاقتران الكيميائية موضح في الخطوات التالية 28.
    1. علاج أجهزة رقة مع البلازما الأكسجين (100 ميغاواط، 1٪ أكسجين و 30 ثانية) في غرفة البلازما.
      تنبيه: يجب أن تؤخذ بحذر خاص عند العمل مع trimethoxysilane 3-mercaptopropyl وN--γ maleimidobutyryloxy succinimideاستر (GMBS)، لأنها على حد سواء الرطوبة حساسة وسامة. ارتداء القفازات الواقية وتجنب استنشاق أو ملامسة الجلد والعينين. إبقاء زجاجة الأسهم مغلقة بإحكام والسماح لها لكي تتوازن لRT قبل فتح لتجنب تكثيف الماء. بدلا من ذلك، فتح زجاجة الأسهم داخل كيس القفازات مليئة النيتروجين أو مربع. قسامة في قوارير صغيرة لتجنب افتتاح المتكرر لزجاجة الأسهم.
    2. على الفور احتضان تعامل الأجهزة الورق في 4٪ (ت / ت) حل 3-mercaptopropyl trimethoxysilane في الإيثانول (200 دليل) لمدة 30 دقيقة.
    3. شطف أجهزة رقة مع الايثانول واحتضان لهم مع 0.01 مكرومول / GMBS مل في الإيثانول لمدة 15 دقيقة.
    4. شطف مع الإيثانول (200 دليل)، واحتضان الأجهزة الورق مع 10 ميكروغرام / مل حل أفيدين في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. تخزينها في 4 ° C إذا لزم الأمر، واستخدام في غضون 4 أسابيع.
  3. الرطب كل مناطق رقة الاختبار مع 10 ميكرولتر PBS تحتوي على 1٪ (ث / ت) ألبومين المصل البقري (BSA) لمدة 3 × 10 دقيقة قبل اكتشاف 10 ميكرولتر المعقدة البيروكسيديز جزيئات القبض لمدة 3 × 10 دقيقة. استخدام مكافحة CD63 الأجسام المضادة (20 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ (ث / ت) BSA وبنسبة 0.09٪ (ث / ت) أزيد الصوديوم) أو annexin V (1:20، / V V V في annexin العازلة ملزمة) كما جزيئات الالتقاط.
  4. شطف غير منضم الأجسام المضادة أو annexin V مكافحة CD63 الجزيئات باستخدام 10 ميكرولتر المقابلة PBS تحتوي على 1٪ (ث / ت) BSA أو annexin V حلول العازلة ملزمة لمدة 3 × 1 دقيقة، على التوالي.

2. المصل ومائي فكاهة جمع العينات وتجهيز

  1. جمع المصل.
    1. جمع 10 مل من الدم المحيطي من بزل الوريد في أنابيب فصل المصل وعكس بلطف أنبوب خمس مرات. تعيين أنبوب في وضع عمودي والانتظار لمدة 30 دقيقة.
    2. الطرد المركزي في 1،200 × ز لمدة 15 دقيقة. نقل المصل من الطبقة العليا إلى أنبوب نظيفة، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 3،000 × ز لمدة 30 دقيقة.
    3. تمرير طاف خلال 0.8 ميكرون سن الفيلثالثا. الحفاظ على عينة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. مائي جمع النكتة: جمع عينات من الخلط المائي من المرضى الذين شخصت من قبل طبيب عيون مباشرة من خلال الإجراءات وعينات متجر الغازية في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3. عزل خارج الخلية الحويصلات

  1. عينات بقعة على كل منطقة اختبار الورق بمعدل 5 ميكرولتر / دقيقة.
  2. شطف المركبات الكهربائية غير منضم مع 10 ميكرولتر المقابلة PBS تحتوي على 1٪ (ث / ت) BSA أو annexin V ملزمة حلول عازلة لمدة 3 × 1 دقيقة لأجهزة رقة بين functionalized مع مكافحة CD63 الأجسام المضادة أو annexin V الجزيئات، على التوالي. إجراء المقايسات المصب التالية.

4. المصب الفحص مثال 1: Electromicrographs الضوئي

  1. إصلاح المركبات الكهربائية القبض على بين functionalized منطقة اختبار الورق باستخدام 10 ميكرولتر 0.5 × تثبيتي Karnovsky لمدة 10 دقيقة.
  2. شطف العينات مع PBS واسعا ل2 × 5 دقائق.
  3. يذوىالعينات مع احق الايثانول 35٪ لمدة 10 دقيقة، والإيثانول 50٪ لمدة 2 × 10 دقيقة، والإيثانول 70٪ لمدة 2 × 10 دقيقة، والإيثانول 95٪ لمدة 2 × 10 دقيقة، والإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 4 × 10 دقيقة.
  4. تنتقد الجافة وتفل معطف العينات مع البلاديوم / الذهب، ودراسة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح تعمل في انخفاض تسارع الإلكترون الجهد (~ 5 كيلو فولت).

5. المصب الفحص مثال 2: ELISA الورقية

  1. إضافة إلى حل 5 ميكرولتر تحتوي على مكافحة CD9 الأجسام المضادة الأولية في 1: 1،000 التخفيف في برنامج تلفزيوني على كل منطقة الاختبار التي تحتوي على المركبات الكهربائية التي تم التقاطها. انتظر 1 دقيقة.
  2. شطف عينات مع 30 مل PBS اهتزت عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
  3. إضافة 5 ميكرولتر محلول يحتوي الفجل البيروكسيديز (HRP) -linked الضد الثانوية في 1: 1،000 التخفيف في برنامج تلفزيوني وانتظر 1 دقيقة.
  4. شطف عينات مع 30 مل PBS اهتزت عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
  5. إضافة 5 ميكرولتر الركيزة اللونية التي تحتوي على نسبة 1: 1 حجم الهيدروجين بيروكسيد لد 3،3 '، 5،5'-tetramethylbenzidine (TMB) والمسح الضوئي باستخدام ماسحة سطح المكتب.

6. المصب الفحص مثال 3: عزل الحمض النووي الريبي

  1. تزج العينات في 35 ميكرولتر من المساعدات العزلة RNA القائم على بوفيدون و 265 ميكرولتر من تحلل / العازلة ملزمة لليز المركبات الكهربائية التي تم التقاطها. دوامة بقوة.
  2. إضافة 30 ميكرولتر جناسة المنصوص عليها في عدة العزلة إلى المحللة. دوامة بقوة وضعت على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  3. استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام حمض فصل الفينول كلوروفورم موضح في الخطوات التالية.
    1. تأخذ 330 ميكرولتر من الفينول كلوروفورم من الطبقة السفلى من القمقم وإضافة إلى جناسة / المحللة. دوامة بقوة.
    2. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 5 دقائق. نقل (العليا) المرحلة المائية لأنبوب نظيفة ونلاحظ حجم إزالتها.
  4. ترسيب الحمض النووي الريبي مجموع مع الإيثانول بنسبة 100٪ من حجم هذا هو 1.25 أضعاف حجم المرحلة المائية إزالتها في الخطوة السابقة والتعاونllect الحمض النووي الريبي في حل شطف مسخن إلى 95 ° C.
  5. التركيز ومواصلة تنقية RNA باستخدام طقم تنظيف RNA فقا لبروتوكول تصنيع.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدرة الجهاز رقة لعزل مجموعات فرعية من المركبات الكهربائية تعتمد بكفاءة عند التحقق حساس ونوعي لها من علامات سطح EV. ويتحقق تعديل مستقر للألياف ورقية مع جزيئات التقاط باستخدام أفيدين-البيوتين الكيمياء كما هو موضح في أماكن أخرى 28-30. ويتم تقييم فعالية تصريف المواد الكيميائية وذلك من طريقة physisorption باستخدام قراءات القائم على مضان. يتم إعداد مناطق اختبار الورقة التالية الخطوة بروتوكول 1) باستثناء جزيء التقاط يتم استبدال مع جزيئات البيوتين 20 ميكروغرام / مل fluorophore ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الأكثر أهمية لعزل الناجحة لمجموعات فرعية من الحويصلات خارج الخلية هي: 1) اختيار جيد من الورق. 2) تغطية مستقرة وعالية من جزيئات القبض على السطح من ألياف ورقية. 3) التعامل الصحيح مع العينات. و4) ممارسة النظافة المختبر العام.

وقد تم استخدام مواد مسامية في العديد من المقايسات غير مكلفة وخالية من المعدات. قد يكون لديهم الانضباطي حجم المسام، وظائف متعددة، وانخفاض التكلفة، وارتفاع نسبة السطح إلى الحجم السماح فتل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل في جزء من المجلس الوطني للعلوم تايوان grants- NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) وNSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC)، والمحاربين القدامى عامة المستشفيات ونظام جامعة تايوان برنامج البحوث المشتركة (CC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ورقة الكروماتوغرافياGE علوم الحياة للرعاية الصحية3001-861Whatman & reg; ورق السليلوز من الدرجة 1
(3-Mercaptopropyl) TrimethoxysilaneSigma Aldrich175617تتفاعل هذه المادة الكيميائية مع الماء والرطوبة ويجب وضعها داخل كيس قفازات مملوء بالنيتروجين. تجنب ملامسة العين والجلد. لا تتنفس الأبخرة أو تستنشق الأبخرة.
الإيثانولفيشر العلميBP2818المطلق ، 200 دليل ، درجة البيولوجيا الجزيئية
ألبومين مصل الأبقار (BSA)BioShop Canada Inc.ALB001غالبا ما يشار إليه باسم كسر كوهن V.
N< / em> - &# 947 ؛ -maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS)Pierce Biotechnology22309GMBS عبارة عن رابط متشابك من أمين إلى سلفهيدريل. GMBS حساس للرطوبة.
يحتوي AvidinPierce Biotechnology31000NeutrAvidin على 4 مواقع ربط للبيوتين وقيمة pI هي 6.3 ، وهو أكثر حيادية من الفأر الأصلي avidin
Biotinylated المضاد للإنسان المضاد ل CD63Ancell215-030استنساخ AHN16.1 / 46-4-5
ملحق البيوتينيل V BDBiosciences556418Annxin V لديه تقارب عال للفوسفاتيديل سيرين (PS)
المضاد الأولي ل CD9 والثانوي نظام الأجسام المضادةBiosciencesEXOAB-CD9A-1الجسم المضاد الثانوي هو أنابيب فصل المصل المترافق ببيروكسيديز
الفجل الحار BD Biosciences367991منشط الجلطة والجل لفصل المصل
Annexin V ملزمةعازلة BD Biosciences55645410x ؛ تخفيفها إلى 1x قبل الاستخدام.
مجموعة كاشف الركيزة TMBBD Biosciences555214تحتوي المجموعة على بيروكسيد الهيدروجين و 3،3 '، 5،5'-tetramethylbenzidine (TMB)
[header]
طقم عزل الحمض النووي الريبيLife TechnologiesAM1560طقم عزل الحمض النووي الريبي MirVana
عزل الحمض النووي الريبي القائم على PolyvinylpyrrolidoneLife TechnologiesAM9690يحتوي مساعد عزل الحمض النووي الريبي النباتي على بولي فينيل بيروليدون (PVP) الذي يرتبط بالسكريات.
مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبيQiagen Inc.تمتصميم مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي 74004 MinElute لتنقية ما يصل إلى 45   ؛ مو ز الحمض النووي الريبي.
غرفة البلازمامارس إنسترومنتسPX-250
مجهر إلكتروني ماسحهيتاشي المحدودة.S-4300
Hewlett-PackardPhotosmart B110صور ملونة 8 بت. يمكن أيضا استخدام الكاميرات والهواتف الذكية.
نظام تسجيل الصورJ& تم التقاط صور H Technology CoGeneSys G: BOX Chemi-XX816 بت. يمكن أيضا استخدام مجاهر Fluroscence.
مساعد تم التقاط الماسح الضوئي لسطح المكتب شركة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
  2. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9(2011).
  3. Raj, D. A. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81, 1263-1272 (2012).
  4. Wiggins, R. C., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., Brukman, J. Procoagulant activity in normal human-urine associated with subcellular particles. Kidney Int. 29, 591-597 (1986).
  5. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  6. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W. G., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. 9, 86(2011).
  7. Asea, A., et al. Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids. J. Reprod. Immunol. 79, 12-17 (2008).
  8. Bard, M. P., et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 31, 114-121 (2004).
  9. Perkumas, K. M., Hoffman, E. A., McKay, B. S., Allingham, R. R., Stamer, W. D. Myocilin-associated exosomes in human ocular samples. Exp. Eye Res. 84, 209-212 (2007).
  10. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Lab. Invest. 90, 1549-1557 (2010).
  11. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, 756-766 (2012).
  12. Grange, C., et al. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche. Cancer Res. 71, 5346-5356 (2011).
  13. Jaiswal, R., et al. Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer. Faseb. J. 26, 420-429 (2012).
  14. Thery, C., Clayton, A., Amigorena, S., Raposo, G. Current protocols in cell biology. Morgan, K. K. (UNIT 3.22), John Wiley. New York, NY. (2006).
  15. Rood, I. M., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
  16. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110, 13-21 (2008).
  17. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracellular Vesicles. 2, 20360(2013).
  18. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney Int. 77, 736-742 (2010).
  19. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Ravi, R. K., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. 82, 1024-1032 (2012).
  20. Chen, C., et al. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab. Chip. 10, 505-511 (2010).
  21. Davies, R. T., et al. Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood. Lab. Chip. 12, 5202-5210 (2012).
  22. Chen, C., et al. Paper-based immunoaffinity devices for accessible isolation and characterization of extracellular vesicles. Microfluid. Nanofluid. 16, 849-856 (2014).
  23. Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J. Immunol. Methods. 270, 211-226 (2002).
  24. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: Purification of both vesicles from cell-free supernatants. J. Immunol. Methods. 338, 21-30 (2008).
  25. Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 7091-7095 (2009).
  26. Dungchai, W., Chailapakul, O., Henry, C. S. Electrochemical detection for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 5821-5826 (2009).
  27. Glavan, A. C., et al. Omniphobic 'R-F paper' produced by silanization of paper with fluoroalkyltrichlorosilanes. Adv. Funct. Mater. 24, 60-70 (2014).
  28. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y. H., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear-stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
  29. Murthy, S. K., Sin, A., Tompkins, R. G., Toner, M. Effect of flow and surface conditions on human lymphocyte isolation using microfluidic chambers. Langmuir. 20, 11649-11655 (2004).
  30. Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosens. Bioelectron. 14, 683-688 (1999).
  31. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat. Rev. Immunol. 2, 569-579 (2002).
  32. Scanu, A., et al. Stimulated T cells generate microparticles, which mimic cellular contact activation of human monocytes: differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine production by high-density lipoproteins. J. Leukocyte Biol. 83, 921-927 (2008).
  33. Inal, J. M., et al. Microvesicles in health and disease. Arch. Immunol. Ther. Ex. 60, 107-121 (2012).
  34. Fridley, G. E., Holstein, C. A., Oza, S. B., Yager, P. The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays. Mrs Bull. 38, 326-330 (2013).
  35. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  36. Missoum, K., Belgacem, M. N., Bras, J. Nanofibrillated cellulose surface modification: a review. Materials. 6, 1745-1766 (2013).
  37. Kalia, S., Boufi, S., Celli, A., Kango, S. Nanofibrillated cellulose: surface modification and potential applications. Colloid Polym. Sci. 292, 5-31 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular VesiclesPaper based DeviceImmunoaffinity IsolationScanning Electron MicroscopyP ELISATranscriptome AnalysisCD63 AntibodyAqueous HumorSerum ProcessingRNA Extraction

Related Articles