في فيفو ديناميات الشبكية دبقية التنشيط خلال تنكس عصبي: متحد البؤر Ophthalmoscopic التصوير والقياس الشكلي خلية في الماوس الزرق

ملخص

تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وكثرة الدبيقيات استجابات الرئيسية لالتنكس العصبي المزمن. هنا، فإننا نقدم طرق لفي الجسم الحي، والتصور على المدى الطويل CX3CR1-GFP + الخلايا الدبقية الشبكية بواسطة تنظير العين متحد البؤر، وعتبة والمورفولوجية تحليل لتحديد وقياس تفعيلها. نحن نراقب التغيرات دبقية خلال المراحل المبكرة من الزرق المرتبطة بالتقدم في السن.

الملخص

الخلايا الدبقية الصغيرة، وهي الخلايا neuroimmune CNS المقيمة، وتحويل التشكل وحجمها استجابة لأضرار CNS، والتحول إلى حالة تنشيط وظائف متميزة وملامح التعبير الجيني. أدوار تفعيل دبقية في مجالات الصحة والاصابة والمرض لا تزال غير مفهومة تماما بسبب التنظيم الديناميكي والمعقد في استجابة للتغيرات في المكروية بهم. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان أن مراقبة غير جراحية وتحليل التغيرات في تفعيل دبقية مع مرور الوقت في الكائن الحي سليمة. في الجسم الحي تأخرت الدراسات تفعيل دبقية التي كتبها القيود التقنية لتتبع سلوك دبقية دون تغيير البيئة CNS. وقد كان هذا تحديا من نوع خاص خلال التنكس العصبي المزمن، حيث يجب أن تعقب التغييرات على المدى الطويل. شبكية العين، وهو جهاز العصبي المركزي قابلة للتصوير العيش غير الغازية، ويوفر نظام قوي لتصور وتميز ديناميات تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة خلال الاضطرابات المزمنة.

الحمار = "jove_content"> يعرض هذا البروتوكول الطرق على المدى الطويل، والتصوير في الجسم الحي من الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين، وذلك باستخدام تنظير العين متحد البؤر (cSLO) وCX3CR1 ^GFP الفئران ^{/ +} المراسل، لتصور الخلايا الدبقية الصغيرة لقرار الخلوية. أيضا، نحن تصف أساليب لقياس التغيرات الشهرية في تنشيط الخلايا وكثافة في مجموعات فرعية الخلايا الكبيرة (200-300 الخلايا في شبكية العين). نحن نؤكد استخدام منطقة somal كمقياس مفيدة لتتبع مباشر لتفعيل دبقية في شبكية العين من خلال تطبيق آلية تحليل المورفومترية القائم على عتبة في الجسم الحي الصور. نحن نستخدم هذه الحصول على الصور الحية ويحلل استراتيجيات لرصد التغيرات الديناميكية في تفعيل دبقية وكثرة الدبيقيات خلال المراحل المبكرة من التنكس العصبي في شبكية العين في نموذج الفأر من الزرق المزمن. وينبغي أن يكون هذا النهج مفيدا لمعرفة مدى مساهمة الخلايا الدبقية الصغيرة إلى انخفاض العصبية ومحور عصبي في اضطرابات الجهاز العصبي المركزي المزمنة التي تؤثر على شبكية العين والعصب البصري.

المقدمة

الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا neuroimmune الموجودة حصرا في الجهاز العصبي المركزي (CNS) منذ التطور الجنيني المبكرة وطوال فترة البلوغ. مجهزة ذخيرة معقدة من المستقبلات، وينظم النشاط دبقية وعدم التجانس الإقليمي من خلال تفاعلها ثنائي الاتجاه مع الخلايا العصبية المجاورة، الدبقية، حاجز الدم في الدماغ والخلايا التسلل neuroinflammatory ^1،2. تساهم ظائف دبقية القاعدية لصيانة وإصلاح الفسيولوجية، كما عينة أراضيها لاضطرابات في التوازن ^3،4. أثناء إصابة الجهاز العصبي المركزي أو المرض، والخلايا الدبقية الصغيرة هي أول المستجيبين للإشارات العصبية التي تؤدي ثم انتقالها إلى النمط الظاهري على رد الفعل، يسمى "تنشيط الخلايا ال....

البروتوكول

في الجسم الحي أن يتم التصوير في مرافق خالية من مسببات الأمراض باستخدام بروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة ولاية يوتا.
ملاحظة: يتم استخدام هذا البروتوكول التصوير بالنسبة للفئران مراسل فيه الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين والتسلل حيدات / الضامة تعبر عن الأخضر الفلورسنت البروتين (GFP) تحت سيطرة موضع fractalkine مستقبلات (CX3CR1).

1. في فيفو تصوير الشبكية GFP + الخلايا الدبقية الصغيرة التي متحد البؤر المسح بالليزر تنظير العين (cSLO)

النتائج

استخدمت لدينا مؤخرا في الدراسات المجراة هذه الحصول على الصور وتحليل أساليب العيش لتصور وتتبع حركية وأنماط ONH والتغيرات دبقية صغيرة في شبكية العين خلال المراحل المبكرة من الزرق المزمن وعلاقتها أواخر التنكس العصبي ^59. نحن هنا توضيح cSLO بروتوكول الحصول على الصور لتصور الخلايا الدبقية عبر منطقة واسعة من الشبكية المركزية في الفردية الشباب متخالف Cx3CR1-GFP DBA / 2J شبكية العين (الشكل 5). استنادا إلى قرار خلية عالية، ونحن نطبق صورة حية الع.......

المناقشة

رصد حي لعدد الخلايا دبقية وتفعيل الصرفي أثناء مرض الاعصاب يتطلب استخدام أساليب التصوير غير الغازية التي تسمح التصور التفصيلي من الميزات الخلية. بعد التصوير، والخلايا الدبقية يجب أن تكون معزولة (مجزأة) للتحليل المظهرية عن طريق استخدام الخطوات عتبة متعددة لتقييم حجم somal و / أو تعقيد العملية قراءات لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. في هذا البروتوكول، وصفنا طرق الحصول على الصور الحية باستخدام cSLO، والتحليل الكمي من تفعيل دبقية بناء على خلية متتابعة وسوما تجزئة. نحن نطبق هذه الاستراتي.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
فئران DBA / 2J و CX3CR1-GFP / + يتم تربية الفئران	في مختبر جاكسون وبار هاربور وME	000671 و 00582	في المنزل ، وإدخال مربين جدد كل 3-4 أجيال لمنع الانجراف الجيني.
30 & frac12 ؛ إبرة G و 1 مل حقنة توبركولين ذات طرف انزلاقي	BD ، إيست رذرفورد ، نيوجيرسي	305106 و 309659
2،2،2-ثلاثي بروموإيثانول ، كحول ثلاثي أميل 99٪ وأقراص محلول ملحي عازلة الفوسفات	Sigma-Aldrich و St. Louis و MO	T48402 و 152463 و P4417	يكون محلول Avertin (درجة الحموضة 7.3 ، مفلتر معقم) محلولا طازجا أو تخزينه عند 4 درجات ؛ C لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
العلاج الحراري T / Pump	Gaymar Industries ، Orchard Park ، NY	TP-650
أدوات تطبيق ذات رؤوس قطنية	فيشر Scientific ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا	23-400-100
تروبيكاميد 1٪	Bausch & amp العدسات اللاصقة Lomb ، Rochester ، NY	NDC 24208-585-64
PMMA ، منحنى قاعدة 1.70 ، قطر إجمالي 3.2 مم ، مركز بسمك 0.40 مم	Cantor & amp Nissel Ltd. ، نورثهامبتونشاير ، المملكة	المتحدة G003709	يتم شطف العدسات باستخدام PBS معقم وتخزينها في صناديق البولي بروبلين.
HRA / Spectralis منظار العين بالليزر المسح الضوئي متحد البؤر وبرنامج Eye Explorer	Heidelberg Engineering GmbH ، Carlsbad ، CA	الإصدار 1.7.1.0
PowerPoint	Microsoft ، Redmond ، WA	الإصدار 14.4.3
Adobe Photoshop	Adobe ، سان خوسيه ، كاليفورنيا	الإصدار CS3
FluoRender	معهد الحوسبة العلمية والتصوير ، جامعة يوتا	الإصدار 2.13	مجانية. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html< / a>
NIS-Elements C	Nikon ، Melville ، NY	الإصدار 4.30.01

يجب أن