GABAergic الأسلاف عصبون القشرية تفريق وتطوير وsynaptically الاندماج في القشرة المضيف بعد الزرع. هذه الخلايا يمكن transduced بسهولة قبل الزرع لفي الدراسات المجراة السلائف GABAergic المعدلة وراثيا. هنا، وتبين لنا تقنيات وضع العلامات الفيروسية لاستهداف مجموعات فرعية عصبون محددة باستخدام خطوط جنة المساواة العرقية القائمة وصحفيين لجنة المساواة العرقية التي تعتمد على.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
وصفها والفيروسية بوساطة زرع الإنسي العقدية سماحة (MGE) خلايا ل
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
GABAergic interneurons القشرية، والمستمدة من الإنسي الجنينية والفضيلة العقدية الذيلية (MGE وفريق الخبراء الاستشاري)، وظيفيا ومتنوعة شكليا. من إحراز تقدم في فهم أدوار متميزة مجموعات فرعية عصبون القشرية، ومع ذلك، لا يزال هناك العديد من الآليات التي عملت بها التي قد تسهم في تطوير ونضوج أنواع مختلفة من الخلايا GABAergic. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تسهم تغيير GABAergic يشير إلى الظواهر التوحد والفصام والصرع. وقد بدأت لجنة المساواة العرقية خطوط سائق محددة للا يتجزأ من مهام فرعية عصبون فريدة من نوعها. وعلى الرغم من التقدم في نماذج الماوس، غالبا ما يكون من الصعب دراسة GABAergic الأسلاف عصبون القشرية بكفاءة مع النهج الجزيئية في الجسم الحي. أسلوب واحد الهامة المستخدمة لدراسة الخلية البرمجة مستقلة من هذه الخلايا هي زرع الخلايا MGE إلى القشور المضيف. هذه الخلايا المزروعة تهاجر على نطاق واسع، تمييز، وهوالثانية دمج وظيفيا. وبالإضافة إلى ذلك، وخلايا MGE يمكن transduced بكفاءة مع الفيروسة البطيئة السابقة على الفور لزراعة الأعضاء، مما يسمح للعديد من الأساليب الجزيئية. نحن هنا بالتفصيل بروتوكول لتنبيغ الخلايا MGE بكفاءة قبل زرع في الجسم الحي التحليل، وذلك باستخدام خطوط جنة المساواة العرقية سائق المتاحة وناقلات التعبير لجنة المساواة العرقية التي تعتمد على. هذا النهج هو مفيد لأنه يجمع بين التلاعب الجيني الدقيق مع قدرة هذه الخلايا لتفريق بعد الزرع، والسماح بمزيد من قرار معين الخلية من نوع في الجسم الحي.
المقدمة
تشمل GABAergic interneurons القشرية ~ 20-30٪ من الخلايا العصبية في القشرة المخية الحديثة الثدييات، في حين أن بقية تتوافق مع مثير، الخلايا العصبية الرئيسية glutamatergic. Interneurons ومتنوعة للغاية في الخصائص الكهربية، محور عصبي والتغصنات التشكل ومتشابك استهداف 1، وافترض الاختلالات في مثير لهجة / المثبطة لتكمن وراء بعض الظواهر من الاضطرابات العصبية والنفسية / العصبية بما في ذلك مرض التوحد والفصام والصرع 2. الهدف العام للبروتوكول الموصوفة هنا هو توفير وسيلة لتعديل بكفاءة وراثيا GABAergic الأسلاف عصبون القشرية قبل زرع في الجسم الحي التحليلات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
بيان الأخلاق: وقد تمت الموافقة على الإجراءات التالية لدينا من قبل المؤسسة والحيوان البروتوكول. تأكد من الحصول على موافقة لجميع الإجراءات التي تنطوي على عملية جراحية البقاء على قيد الحياة قبل بداية التجارب والتحقق من جميع البروتوكولات هي حتى الآن.
1. إعداد الفيروسة البطيئة (خطوة اختيارية)
- تقسيم ثلاثة 10 سم لوحات الخلايا HEK293T لكل الفيروسة البطيئة يتعين القيام بها، في ظل وجود 10 مل DMEM / 10٪ FBS، وتنمو إلى ~ 60-70٪ التقاء. تنمو الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
منذ خلايا MGE لديها قدرة فريدة على الهجرة والاندماج عندما زرعها في القشرة المخية الحديثة المضيف 16، لأنها توفر نظام نموذجا ممتازا للتلاعب الجيني قبل الدراسات في الجسم الحي. هنا، وتبين لنا كيف يمكن للمرء أن عزل الأنسجة MGE من أجنة E13.5 (الشكلان 1 و 2)، والتي يمكن بعد ذلك transduced مع lentiviruses سواء في المختبر أو بطريقة سريعة قبل الزرع للدراسات في الجسم الحي. وقد أجريت وضع العلامات MGE عبر lentiviruses قبل استخدام محسن القي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
استخدام GABAergic السلائف عصبون القشرية من الفضيلة العقدية الجنينية (غيس) للعلاجات الخلايا استنادا تبدو واعدة للعديد من الحالات 12 -1 4. وهناك حاجة إلى تقنيات جزيئية دقيقة لتتبع، والتعبير عن جينات الفائدة في مجموعات فرعية عصبون محددة. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لوصفها الخلايا الجنينية MGE مع lentiviruses قبل الزرع وإظهار كيف يمكن استخدام هذه التقنية للتعبير عن الجينات في المصالح في مجموعات فرعية محددة عصبون القشرية للتحليل في الجسم الحي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة لJLRR من: التوحد يتحدث، نينا ايرلندا، مؤسسة الملاذات ويستون، NIMH R01 MH081880، وNIMH R37 MH049428. وأيد PRW من قبل زمالة من مجلس العلوم الوطني لتايوان. وأيد SFS التي كتبها F32 (MH103003).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم
الشركة
رقم فهرسي
التعليقات
شركة Stoelting دوار مطلي المعدنية الأخرى < td colspan = "4" > الكواشف الاختيارية (لصنع فيروسات العدس)
| الكواشف والمعدات لزرع خلايا MGE | |||
| 1 مل حقنة | REF 309602 | BD و Becton Dickinson والشركة | |
|---|---|---|---|
| 30 1/2 G إبرة | 305106 | BD و Becton Dickinson وشركة | |
| Precision تحمل لتقديم 5 & مايكرو ؛ ل (يأتي مع مكبس) | 5-000-1005 | دروموند العلمية | |
| Parafilm | PM-999 | Polysciences، Inc. | |
| مجهر ستيريو مع ذراع الرافعة ** | MZ6 | Leica | |
| Digital فقط للفئران أداة تجسيمية ** | 51725D | شركة | |
| مناور دقيق دقيق هيدروليكي بالزيت أحادي المحور ** | MO-10 | Narishige | |
| شطف | بالماس مصنوع في المنزل | ||
| مجتذب ماصة إبرة | 730 | Kopf الأدوات | |
| الزيوت | أي صيدلية أو صيدلية | ||
| أي ماصة ونصائح يمكن أن تقم بقياس 1 & micro ؛ l من الحجم | |||
| ** هذه هي النماذج المعينة التي نستخدمها ، ولكن يجب أن تعمل العديد من الإعدادات | |||
| 25 مم ، 0.45 & micro ؛ مرشح m | 09-719B | فيشر Scientific | |
| أنابيب الطرد المركزي فائقة الوضوح (25 × 89 مم) | 344058 | بيكمان كولتر & ريج; | |
| ليبوفيكتامين 2000 < / sup> (حجم 1.5 مل) | 11668019 | Invitrogen | |
| الإمدادات الأخرى المتاحة تجاريا | |||
| pMDLg / pRRE بلازميد ترميز gag / pol | 12251 | ترميز البلازميد Addgene | |
| pRSV-Rev Rev Rev | 12253 | ترميز البلازميد Addgene | |
| pMD2.G VSVG | 12259 | Addgene | |
| pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene | |
المراجع
- Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices. Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).
- Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
