يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقييم فعالية

7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52743

⸱

مايو 29, 2015

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Padua, 2Department of Medical Diagnostic Sciences & Special Therapies, University of Padua

في هذه المقالة

ملخص

هنا يتم وصف طريقة إنشاء نموذج فأر متجانس لورم المثانة التقويمي لتقييم الفعالية المضادة للورم للبروتين البكتيري HP-NAP.

الملخص

سرطان المثانة هو أحد أكثر الأورام الخبيثة شيوعا في الجهاز البولي التناسلي. الحقن داخل المثانة من Bacillus Calmette-Guérin (BCG) هو العلاج القياسي الذهبي لسرطان المثانة غير الغازي العضلي عالي الدرجة (NMIBC). ومع ذلك ، نظرا لأن الآثار الجانبية المرتبطة بالعلاج ذات صلة ، هناك حاجة إلى معدلات استجابة بيولوجية جديدة مع نسبة فائدة / آثار جانبية أفضل.

يمكن أن تؤثر البيئة المكروية للورم على كل من تطور الورم وفعالية العلاج. من أجل الحصول على نموذج جيد ، من المستحسن زرع الخلايا السرطانية في العضو الذي ينشأ منه السرطان.

في هذا البروتوكول ، نصف طريقة لإنشاء ورم في تجويف المثانة للإناث وتسليم العوامل العلاجية اللاحقة ؛ يتجلى هذا الأخير من خلال استخدامنا للبروتين المنشط للعدلات Helicobacter pylori (HP-NAP). يمكن الحرق الكيميائي الأولي للغشاء المخاطي ، متبوعا بحقن خط خلايا سرطان الظهارة البولية للفأر MB49 عن طريق قسطرة مجرى البول ، الخلايا من الالتصاق بالغشاء المخاطي للمثانة. بعد فترة ، مطلوبة للسماح بالتكاثر الأولي للخلايا ، يتم علاج الفئران باستخدام HP-NAP ، ويتم إعطاؤها مرة أخرى عن طريق القسطرة. يتم تقييم النشاط المضاد للورم ل HP-NAP مقارنة حجم الورم ومدى النخر ودرجة الأوعية الدموية بين المعالجة بالمركبات المعالجة ب HP-NAP.

المقدمة

سرطان المثانة هو واحد من أكثر أنواع السرطان شيوعا في الجهاز البولي التناسلي، مع ما يقرب من 75،000 حالة جديدة كل عام في الولايات المتحدة الأمريكية 1. تتطلب معدلات عالية من تكرار مدى الحياة المتابعة، مما يجعل سرطان المثانة واحدة من أغلى أنواع السرطان لعلاج. علاج الذهب القياسية لعالية الجودة NMIBC هو بتر عبر الإحليل، تليها العلاج المناعي إينترفسكل مع BCG. على الرغم من أن الآلية الدقيقة للنشاط المضادة للورم من BCG يبقى أن توضح تماما، ومن المتفق عليه أن تفعيل استجابة بوساطة الخلايا المناعية المخصب في T المساعد (ث) 1 والسامة للخلايا T (ح) 1 الخلايا هو أمر حاسم ل نجاح العلاج 2.

على الرغم من أن BCG يبقى العلاج الأمثل لNMIBC، وهي نسبة عالية من المرضى لا يستجيبون للعلاج. علاوة على ذلك، فإنه يمكن أن يسبب عددا من الآثار الجانبية: حوالي 70٪ من الأورام تعامل تتكرر بعد مرور بعض الوقت والتقدم ~ 15٪ إلى النموذج العضلات الغازية للالمرض. الآثار الجانبية الأخرى المرتبطة العلاج BCG تشمل عسر البول، التهاب المثانة والتهاب الكلى 3-6.

تطوير استراتيجيات علاجية جديدة يجب أن تأخذ في الاعتبار استخدام نماذج ما قبل السريرية، بعد الأولي في المختبر التقييم؛ هذا أهمية خاصة في الأورام التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير تنميتها والاستجابة للعلاج المكروية.

على مدى العقد الماضي، ونحن قد تناولت جوانب متعددة من النشاط تحوير المناعة من HP-NAP، وهو بروتين تنتجه بكتيريا هيليكوباكتر بيلوري، حدد في البداية بأنه قادر على تعزيز التصاق الخلايا البطانية النوى (PMNs) 7. هيكليا، HP-NAP ينتمي إلى البروتين لحماية الحمض النووي في ظل ظروف التجويع (DPS) الأسرة (8) ويتكون من 12 مفارز متطابقة مرتبة في قذيفة dodecameric.

لقد أثبتنا أن HP-NAP هومستقبلات تول مثل (TLR) 2 ناهض، مع نشاط تحوير المناعة القوي التي تقف وراء تمايز اللمفاويات التائية نحو النمط الظاهري TH1، سواء في المختبر والمجراة 10/09. في فضيلة لهذا النشاط، HP-NAP غير قادرة على توجيه الاستجابة المناعية TH2 في الاستجابة أكثر فائدة TH1 في نموذج الفئران من الربو التحسسي 11.

لتقييم القدرة المضادة للورم TH1 التي تعتمد من HP-NAP، اتخذنا الاستفادة من نموذج الفأر من سرطان المثانة وضعت قبل عدة سنوات من قبل أودونيل وزملاؤه (12) لتقييم أثر إدارة BCG.

مع هذا البروتوكول، علينا أن نبرهن على HP-NAP لديها امكانات المضادة للورم قوية ضد سرطان المثانة وأن فعالية إدارة HP-NAP يوازي تراكم كبير، داخل الورم والغدد الإقليمي العقد، كل من Th1 و TC1 الخلايا الليمفاوية إنتاج الانترفيرون ( IFN) -γ 13 . وأظهرت أورام معزولة من الفئران التي عولجت HP-NAP-مزيد من نخر والأوعية الدموية أقل من نظيره غير المعالجة.

يقدم هذا التقرير بروتوكول stepbystep، تفاصيل إعداد الحيوانات، قسطرة الإحليل، وحرق الكيميائية اللازمة لمرفق من الخلايا إلى الغشاء المخاطي المثانة، وحقن الخلايا السرطانية. نحن أيضا وصف الإدارة الموضعية من HP-NAP التي يمكن اعتبارها نموذجا أوليا من أي العوامل العلاجية المتقدمة لعلاج سرطان المثانة. الأدلة التي تم الحصول عليها عن طريق مقارنة أورام معزولة عن السيطرة وHP-المعالجة NAP الحيوانات ويؤكد ليس فقط حقيقة أن HP-NAP يمكن أن يكون مرشحا جيدا للعلاج مناعي سرطان المثانة، ولكن أيضا فعالية العامة للالتجريبية اقامة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد تمت الموافقة على جميع إجراءات التعامل مع الحيوانات من قبل وزارة الصحة الإيطالية (DM 204/2011-B).

1. الحيوانات

  1. تنمو C57BL6 / J الفئران الإناث إلى 8 أسابيع من العمر في أقفاص التهوية بشكل فردي مع مرشحات microisolation.
    ويفضل الإناث لأن التشكل التشريحي للجهاز-البولية التناسلية الخارجية لها يجعل قسطرة أسهل مما كانت عليه في الذكور: مذكرة.

2. خلية ثقافة

  1. الحفاظ على الماوس الظهارة البولية خط خلية سرطان MB49 في RPMI 1640 متوسطة تستكمل مع 10٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني و 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين على 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2.
  2. زراعة خلايا MB49 في T-75 قوارير إلى 80٪ التقاء. يعرض للتريبسين و resuspend عند 0.5 × 10 5-0،5 × 10 6 خلايا في 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني قبل الزرع في الفئران.

3. إينترفسكل الأورام زراعة

  1. تخدير الفئران باستخدام مزيج من zoletil التخدير وxylor (33 ملغ / كغ و 20 ملغم / كغم، على التوالي)، حقن داخل الصفاق.
  2. وضع الحيوانات في موقف ضعيف وإصلاح رجليه الخلفيتين الى منصة مع الاسكتلندي. الكفوف وإلى أن يفصل بما فيه الكفاية لجعل الصماخ الإحليل مرئية بشكل جيد ويمكن الوصول إليها بسهولة لإدخال القسطرة.
  3. ملاحظة: بالنسبة للقسطرة، 24 G القسطرة الوريدية للأطفال هي مناسبة للفئران 8-10 أسابيع من العمر. اختيار القسطرة مهم للغاية من أجل تجنب تسرب السائل بين الجدار مجرى البول والقسطرة. يجب استخدام القسطرة تجويف أكبر للفئران أكبر أو كبار السن.
  4. باستخدام كلاب صغيرة، قرصة حافة واحدة من الجزء الخارجي من مجرى البول وتطويعه بلطف شديد نحو "نهاية الرأس" من الفئران. هذا العمل يعرض الصماخ الإحليل.
  5. إزالة الإبرة الداخلية للالقسطرة وتضاف هذه الأخيرة في مجرى البول في زاوية من 45 درجة مئوية، موجهة قليلانحو "ذيل" من الفئران. لا قوة مدخل القسطرة. في حالة المقاومة، مجرد تحريف القسطرة بلطف شديد، حتى أنه ينزلق داخل مجرى البول. عندما حول 0،5-0،8 سم من القسطرة في مجرى البول، ضع بعناية بالتوازي القسطرة إلى ذيل الفئران وأدخله تماما.
  6. باستخدام حقنة 1 مل، الإبرة التي لابد من إدراجها في القسطرة، وغسل المثانة من البول المتبقي عن طريق حقن 200-300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة ونضح كل السائل من المثانة.
  7. ملاحظة: عندما حقن PBS، فإن المثانة تملأ وسوف تورم تكون واضحة بين رجليه الخلفيتين من الفئران. هذا يؤكد أن القسطرة هي الصحيحة. معظم القسطرة لديها حجم القتلى التي يجب أخذها في الاعتبار عند حساب حجم الحقن.
  8. باستخدام معقمة 1 مل حقنة، وضخ 200 ميكرولتر من 0.1 N حمض الهيدروكلوريك. ملء المثانة من أجل حرق الجدار بأكمله. بعد 10 ثانية، وإزالة جميع الحامض وneutrali فورازي عن طريق حقن 200 ميكرولتر من 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم مع محقنة معقمة. في حالة حقن أكبر عدد من الخلايا (0.5 × 10 6)، ولا يشترط الخطوة التحميض.
  9. نضح كل السائل المتبقي وعلى الفور بمسح تجويف مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة.
  10. إفراغ المثانة بواسطة الشفط، وحقن 150 ميكرولتر من PBS تحتوي على خلايا MB49 (المدى 0.5 × 10 5-0،5 × 10 6) في المثانة. ترك الحقنة تجميعها لالقسطرة لتجنب تسرب الخلايا. فمن الأفضل لتأمين حقنة عن طريق تحديد إلى لوحة مع الاسكتلندي.
  11. بعد 1 ساعة، واستخراج بلطف القسطرة من مجرى البول، ووضع الفئران في قفص تحت مصباح وهاج حتى مستيقظا: هذا يحدث عادة بين 1 و 2 ساعة بعد نهاية العلاج.

4. التسليم إينترفسكل من HP-NAP

  1. ملاحظة: لا يقل عن 3 أيام بعد تقطير الخلية، فمن الممكن أن يبدأالعلاج.
  2. يقثطر كما هو موضح في الخطوات 3،1-3،4. في هذه المرحلة، فإنه ليس من الضروري لحرق جدار المثانة مع حمض الهيدروكلوريك.
  3. باستخدام حقنة 1 مل، وغسل المثانة من البول المتبقي عن طريق حقن 200-300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة ونضح كل السائل من المثانة.
  4. حقن 50 ميكروغرام من HP-NAP في 150 PBS ميكرولتر في المثانة. ترك الحقنة التي تعلق على القسطرة لتجنب تسرب من الحل البروتين. تأمين حقنة عن طريق تحديد إلى لوحة مع الاسكتلندي.
  5. بعد 1 ساعة، واستخراج بلطف القسطرة من مجرى البول ووضع الفئران في قفص تحت مصباح وهاج، حتى يستيقظ.

5. الأورام إإكسبلنتس وتحليل النسيجي

  1. في نهاية العلاج، والتضحية الحيوانات، ووضعها في مواقف مستلق وإصلاح رجليه الخلفيتين الى منصة مع الاسكتلندي.
  2. باستخدام مشرط جراحي، وجعل شق عمودي عن 1.52 سم من خلال الجلد والبريتوني، بدأت للتو فوق الأعضاء التناسلية الخارجية إلى "نهاية الرأس" من الفئران. للحد من مخاطر الإضرار المثانة، إيلاء اهتمام خاص لعمق القطع.
  3. سيتم وضع المثانة في يسار الوسط لقطع وسوف الورم تكون واضحة كما مظلمة كتلة الوردي / البنفسجي. على الختان لها، ضع المثانة بالكامل في قفص النسيجي وإصلاح في 10٪ من الفورمالين مخزنة قبل التضمين في البارافين.
  4. لالنسيجية وتحليل النسيجية المناعي، وإعداد أقسام المسلسل من المثانة (46 سماكة ميكرون) باستخدام مشراح القياسية.
  5. وصمة عار على المقاطع مع haematoxylin / يوزين والمضي قدما في حساب حجم الورم (D XD 2) وتحديد نسبة نخر في منطقة مستعرضة باستخدام بمساعدة الكمبيوتر محلل الصورة.
  6. لسفينة العد، المضي قدما في طريق تلطيخ أقسام للعلامة البطانية CD31 / PECAM، وذلك باستخدام تقنية المناعي القياسية. مسح المقاطع لر طاقة منخفضة (4 ×) لتحديد منطقة أعلى كثافة الأوعية الدموية. داخل هذه المنطقة، عد microvessels الفردية في خمسة حقول عشوائية منفصلة في قوة عالية (20 ×).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويبين الشكل (1) وتقنية القسطرة. ومقسطر الماوس وتغرس مع 0.5 × 10 6 MB49 الخلايا. بدأ العلاج مع HP-NAP 3 أيام بعد حقن الخلايا السرطانية، لتمكينهم من تعلقها على جدار المثانة وتتكاثر. كل الحيوانات التي تنتمي إلى مجموعة مراقبة تطور الورم. البعض منهم قد يموتون قبل نهاية فترة 13 يوما بسبب انسداد مجرى البول.

بعد الحقنة الأولى مع HP-NAP، يتم التعامل مع الحيوانات كل ثلاثة أيام، ليصبح المجموع أرب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

معظم السلف في علاج السرطان تتطلب اختبارات في النماذج الحيوانية قبل بدء التجارب السريرية. إمكانية دراسة بيولوجية الورم في الجسم الحي، والاستفادة من النماذج الحيوانية، يمثل أداة حاسمة للباحثين التحقيق التسبب بالسرطان، مما يتيح تقييم أساليب علاجية مختلفة. لا تزال نماذج مثلي معيار الذهب 14-15، وذلك بسبب كمية هائلة من خطوط الخلايا المتاحة لإعداد نموذج الورم، ولأنها تحاكي البيئة الورم طبيعيا 16.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل ASSOCIAZIONE الإيطالية في لا يسر كل من Ricerca سول Cancro، الوزارة الإيطالية للجامعة والبحوث والمشاريع نسخ م وPROGETTI دي يسر كل من Ricerca دي أتينيو، منح N ° CPDA137871، FONDAZIONE Cariplo، منح N ° 2011-0485 إلى MDB، وFinanziamento جيوفاني Studiosi، جامعة بادوا، لغايا Codolo.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المواد
C57BL / 6J إناث الفئرانهارلان إيطاليا (أودين ، إيطاليا)
خلاياالتي تم الحصول عليها من البروفيسور أودونيل ، كلية الطب بجامعة أيوا كارفر ، أيوا ، الولايات المتحدة الأمريكية
RPMISigma-Aldrich (سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية)R8758
FBSSigma-AldrichF7524
PBSSigma-AldrichD140810X ، ليتم تخفيفه في قارورة مائية لكسر الوراثة
Becton Dickinson (Franklin Lakes ، نيو جيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية)353135
حقنة 1 ملBecton Dickinson301358
TrypsinLife Technologies (Waltham ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية)
GentamycinLife Technologies15710-049
XilorBio 98 s.r.l. (ميلانو ، إيطاليا)2٪ زيلازين
زوليتيلفيرباك (كاروس ، فرنسا)3597133019925٪ زولازيبام + 5٪ قسطرة تيلتامين
24 جرامتيرومو (روما ، إيطاليا)SR + DM2419PX
هيدروكلوريككواشف كارلو إربا (ميلانو ، إيطاليا)403871سائل
هيدروكسيد الصوديومJT بيكر (سنتر فالي ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)10095011مسحوق
مشرط جراحيألبيون جراحية محدودة (شيفيلد ، إنجلترا) Microtome
Leica Microsystem (Wetzlar ، ألمانيا)RM2235
Microscope SlidesVWR International (Radnor ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)631-0108
محلل الصورZeiss (جينا ، ألمانيا)نظام
MB49 < td colspan = "4" > معدات Cyres

المراجع

  1. Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Cancerstatistics Jemal, A. CA Cancer J Clin. 64, 9-29 (2014).
  2. Saint, F., et al. Prognostic value of a T helper 1 urinary cytokine response after intravesical bacillus Calmette-Guerin treatment for superficial bladder cancer. J Urol. 167, 364-367 (2002).
  3. Shahin, O., Thalmann, G. N., Rentsch, C., Mazzucchelli, L., Studer, U. E. A retrospective analysis of 153 patients treated with or without intravesical bacillus Calmette-Guerin for primary stage T1 grade 3 bladder cancer: recurrence, progression and survival. J Urol. 169, 96-100 (2003).
  4. Lamm, D. L. Complications of bacillus Calmette-Guerin immunotherapy. Urol Clin North Am. 19, 565-572 (1992).
  5. De Jager, R., et al. Long-term complete remission in bladder carcinoma in situ with intravesical TICE bacillus Calmette Guerin. Overview analysis of six phase II clinical trials. Urology. 38, 507-513 (1991).
  6. Dovedi, S. J., Davies, B. R. Emerging targeted therapies for bladder cancer: a disease waiting for a drug. Cancer Metastasis Rev. 28, 355-367 (2009).
  7. Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect Immun. 63, 2213-2220 (1995).
  8. Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat Struct Biol. 5, 294-303 (1998).
  9. Amedei, A., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori promotes Th1 immune responses. J Clin Invest. 116, 1092-1101 (2006).
  10. Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe. Toxicon. 56, 1186-1192 (2010).
  11. Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori down-modulates Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell Microbiol. 10, 2355-2363 (2008).
  12. Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
  13. Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol Immunother. 61, 31-40 (2012).
  14. Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
  15. Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J Cell Biochem. 56, 4-8 (1994).
  16. Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55, 547-555 (2011).
  17. Miyazaki, K., et al. Preconditioning methods influence tumor property in an orthotopic bladder urothelial carcinoma rat model. Mol Clin Oncol. 2, 65-70 (2014).
  18. Horiguchi, Y., et al. Establishment of orthotopic mouse superficial bladder tumor model for studies on intravesical treatments. Hum Cell. 21, 57-63 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

نموذج سرطان المثانةعلاج HP-NAPالخط الخلوي MB49قسطرة الإحليلالتحليل النسيجيالتحليل الكيميائي النسيجي المناعيقياس حجم الورمتقييم التوعي الدمويتقييم النخر
تقييم فعالية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.