مقالة منهجية

تطبيق للDNA محددة وصمة عار الميثيل الأخضر في بطاقات المواد الفلورية الأجنة

DOI:

10.3791/52769

⸱

مايو 2, 2015

 ,  ,  , 
1Institut Pasteur de Montevideo, 2Sección Biología Celular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> تم وصف طريقة تلطيخ الفلورسنت للمواد البيولوجية الثابتة مع تسمية الحمض النووي المحددة ميثيل جرين. يستخدم الميثيل الأخضر في محلول مائي مخفف وهو مقاوم جدا للتبييض الضوئي. يسمح انبعاثها الأحمر البعيد بتصوير العينات العميقة ، مما يجعلها مناسبة بشكل خاص للأجنة الكاملة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> لطالما عرف الميثيل الأخضر بأنه بقعة نسيجية ذات تقارب محدد مع الحمض النووي ، على الرغم من أن خصائصه الفلورية ظلت غير مستكشفة حتى وقت قريب. في هذه المقالة ، نوضح طريقة تحضير محلول مخزون مائي أخضر ميثيل ، والذي عند تخفيفه يمكن استخدامه كملصق نووي فلوري مناسب للغاية للخلايا والأنسجة الثابتة. يتم تفصيل الإجراءات السهلة لتسمية أجنة الزرد والكتاكيت الكاملة ، ويتم عرض أمثلة على الصور التي تم الحصول عليها. الميثيل الأخضر متحمس إلى أقصى حد بالضوء الأحمر ، عند 633 نانومتر ، وينبعث طيف حاد نسبيا يبلغ ذروته عند 677 نانومتر. إنه غير مكلف للغاية وغير سام ومستقر للغاية في المحلول ومقاوم جدا للتبييض الضوئي عند ربطه بالحمض النووي. يسمح انبعاثه الأحمر بتصوير متحد البؤر للمسح الضوئي عالي الدقة دون تغيير للنوى في العينات السميكة. أخيرا ، يتوافق بروتوكول تلطيخ الميثيل الأخضر هذا مع إجراءات تلطيخ الخلايا الأخرى ، مثل وضع العلامات على الأجسام المضادة ، أو وضع العلامات على خيوط الأكتين باستخدام الفالويد المترافق بالفلوروفور.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم تلطيخ الحمض النووي الفلوري على نطاق واسع وروتيني في كل من البحث البيولوجي والتشخيص السريري ، إما للدراسة التفصيلية للبنية النووية والكروموسومية ، أو لمواجهة الأنسجة والخلايا ، أو لدراسة معلمات دورةالخلية 1. على الرغم من توفر العديد من بقع الحمض النووي ، إلا أن أكثرها استخداما كانت تلك التي تثيرها الأشعة فوق البنفسجية وتنبعث منها باللون الأزرق ، والتي تتناسب مع أنظمة المرشحات الثلاثة المعتادة المستخدمة في معظم مجاهر التألق التقليدية عند دمجها مع الفلوروفورات الباعثة للأخضر والبرتقالي والأحمر ، مثل البروتينات الفلورية أو الجزيئات الصغيرة المرتبطة بالأجسام المضادة. من بين بقع الحمض النووي الباعثة للماء ، الأكثر شيوعا هي عوامل ربط الأخدود الثانوية DAPI و Hoechst2،3. ومع ذلك ، فإن دمج مجموعة متنوعة من خطوط انبعاث الليزر والكشف الطيفي في مجاهر المسح بالليزر ، قد سمح للباحثين باختيار استخدام البقع النووية الباعثة من اللون الأحمر البعيد مثل يوديد البروبيديوم (PI) أو TO-PRO 34. تتمثل إحدى مزايا هذه البقع في أنها تتغلب على مشكلة التألق الذاتي الموجودة في العديد من الخلايا والأنسجة ، خاصة في الأجنة5 ، ولكن العديد منها يعاني من مشاكل مختلفة مثل وجود ملامح انبعاث واسعة أو كونها حساسة جدا للتبييض الضوئي6.

اكتشف الباحث السويسري فريدريك ميشر الحمض النووي في عام 1869 ، واستخرجه من نوى خلايا الدم البيضاء الموجودة في القيح. أطلق عليها اسم النوكلين ، وأظهر بعد بضع سنوات أنها شكلت رواسب مع وصمة عار جديدة نسبيا الميثيل الأخضر. يتكون الميثيل الأخضر من ثلاث حلقات أنيلين ، بدرجات مختلفة من المثيلة ، وله شحنتان موجبتان تسمحان له بالارتباط بقوة بالأخدود الرئيسي للحمض النووي7،8. تبين في وقت مبكر جدا أن تلطيخ الحمض النووي بواسطة الميثيل الأخضر محدد ، مما أدى إلى تطوير أونا وبابنهايم لصبغة مشتركة مع البيرونين ، والتي تسمي الحمض النووي الريبي على وجه التحديد. منذ ذلك الحين تم استخدام الميثيل الأخضر بيرونين على نطاق واسع في التقنية النسيجية الروتينية9.

حتى وقت قريب ، لم يكن يعرف سوى القليل جدا عن خصائص الفلورسنت للميثيل الأخضر. ومع ذلك ، فقد كشف عملنا السابق عن بعض المزايا الطيفية للميثيل الأخضر6 مثل إثارته عند 633 نانومتر ، وتحول ستوكس المريح ، وانبعاثه على الجزء القريب من الأشعة تحت الحمراء من الطيف الكهرومغناطيسي ، وثباتا ضوئيا أعلى من بقع الحمض النووي المتاحة تجاريا ذات الخصائص الطيفية المماثلة وبتكلفة منخفضة للغاية. هذا هو السبب في أننا قررنا اختباره لاستخدامه كعلامة فلورية عالية جدا وتقارب محدد للحمض النووي على الأنسجة الجنينية وفي الأجنة الكاملة. علاوة على ذلك ، حتى الآن تم إجراء تلطيخ الميثيل الأخضر النووي عند درجة حموضة منخفضة ، مما يجعل من الصعب الجمع بين تلطيخ الأجسام المضادة. الهدف من الطريقة المفصلة هنا هو الحصول على بروتوكول لتلوين الحمض النووي النووي الفلوري الذي يتغلب على الإزعاج المذكور أعلاه من خلال إجراء إجراء التلوين عند درجة الحموضة الفسيولوجية ، مما يجعله بقعة مناسبة للوضع المناعي على الأقسام والأنسجة الكاملة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تنقية للصبغ

  1. إعداد محلول مائي 4٪ من اللون الأخضر الميثيل عن طريق إذابة 0.4 غرام من مسحوق صمة عار في 10 مل من الماء المقطر. تخلط جيدا حتى يذوب تماما.
  2. تحت الدخان غطاء محرك السيارة، ومزجها مع لا يقل عن 2 أجزاء من الكلوروفورم. من المهم التحقق مسبقا ما إذا كانت الأنابيب هي مقاومة الكلوروفورم.
  3. تخلط جيدا وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 2000 x ج لتسريع مرحلة الانفصال.
  4. بعد الطرد المركزي، ويتم الحصول على مرحلة العليا المائية مع الأخضر الميثيل ومرحلة العضوية أقل مع الكلوروفورم والمعتاد الملوثات الكريستال البنفسجي.
  5. استرداد المرحلة العليا وكرر هذه الخطوة حتى تظهر المرحلة الدنيا خالية تماما من الكريستال البنفسجي.
  6. في النهاية، يتم استرداد المرحلة العليا والمخفف في الماء لتركيز النهائي من 2٪ الأخضر الميثيل. هذا المحلول مستقر على طاولة العمل لشهور وليس من الضروري أن تكون محمية من الضوء.

"jove_title"> 2. الفلورسنت تلطيخ النووية من الجامعة الزرد الأجنة باستخدام الميثيل الخضراء

  1. إصلاح الأجنة بين عشية وضحاها في 4٪ فورمالدهايد (من امتصاص العرق) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
    ملاحظة: هذا يمكن أن يستغرق من بضع ساعات ليلة وضحاها اعتمادا على سمك الأجنة. في المثال، فإننا الثابتة 48 ساعة بعد الإخصاب (HPF) الأجنة الزرد بين عشية وضحاها.
  2. غسل الأجنة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني-T (1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) لمدة 5 دقائق. تركيز مرتفع من المنظفات permeabilizes بشرة.
  3. إعداد 1: 5،000-1: 10،000 حل الأخضر الميثيل (من 2٪ محلول المخزون) في برنامج تلفزيوني-T. وجود المنظفات أثناء الحضانة مفيد لعينات سميكة، مثل الأجنة الزرد واليرقات.
  4. احتضان الأجنة في حل للا يقل عن 6 ساعة عند 4 درجات مئوية، مع هزاز لطيف. مرة أخرى، سمك الجنين المعلمة معايرة لمدة الحضانة.
  5. غسل الأجنة 3 تيموفاق مع برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة لإزالة الزائدة المنظفات. الميثيل مخضر واضح فقط عند منضمة إلى الحمض النووي، وبالتالي الخلفية من جزيء غير منضم لا يكاد يذكر.
  6. جبل على الشريحة حفرها أو غرفة محلية الصنع مع الحل تركيب (75٪ الجلسرين، 0.1 M تريس · حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8).
    ملاحظة: إذا كان تلطيخ النووي التي يتعين القيام بها بعد immunolabeling، يمكن إدراجها الأخضر الميثيل في حل المتصاعدة في تركيز العمل، دون الحاجة إلى غسله.
  7. مخزن في الثلاجة أو بدء التصوير مباشرة. أداء التصوير مع متحد البؤر المسح بالليزر (أو مضان آخر) المجهر مع الإثارة في 633 نانومتر، والانبعاثات مجموعة المرشحات للتسجيل في 650-750 نانومتر مع الأخذ بعين الاعتبار أن الميثيل تصل الانبعاثات الأخضر الحد الأقصى في 677 نانومتر.
    ملاحظة: ونحن نقدم البيانات المقاسة من الميثيل الشخصي الانبعاثات الأخضر، ليتم تحميلها في البرنامج الاستحواذ، كمواد إضافية.

3. نيون سانت النوويةaining من الجامعة الفرخ الأجنة باستخدام الميثيل الخضراء

  1. احتضان بيض الدجاج المخصب إلى مرحلة الاهتمام. إصلاح الأجنة بين عشية وضحاها في 4٪ فورمالدهايد (من امتصاص العرق) في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. غسل الأجنة 3 مرات في برنامج تلفزيوني-T لمدة 2 ساعة.
  2. إعداد 1: 5،000-1: 10،000 حل الأخضر الميثيل (من 2٪ محلول المخزون) في برنامج تلفزيوني-T. احتضان الأجنة في حل تلطيخ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. غسل الأجنة 3 مرات في برنامج تلفزيوني، 1 ساعة لكل منهما. جبل في غرفة مع 75٪ الجلسرين، 0.1 M تريس، ودرجة الحموضة 8.

4. التصوير Fluorescently المسمى النواة في الأجنة كامل محمولة

  1. إعداد غرفة التصوير من خلال إصرارها عدة طبقات من شريط كهربائي على شريحة المجهر وبعناية قطع حفرة في ذلك مع مشرط لوضع الأجنة داخل. وهذا يمنع الأجنة من سحق أثناء التصوير.
  2. نقل بعناية الأجنة إلى غرفة التصوير وملء الغرفة إلى الأعلى مع 75٪ الجلسرين، 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة = 8 لتشكيل فقاعة باطلة.
  3. مع تغطية # 0 ساترة تجنب أو القضاء تفيض المتوسط. ختم ذلك بطلاء الأظافر.
  4. الحصول على صور من العينة على المجهر مضان مجهزة تصفية 633 الإثارة أو خط ليزر.
    ملاحظة: يجب أن المرشحات الانبعاثات تغطية الحد الأقصى 677 انبعاث الأخضر الميثيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلطيخ النووي من عينات سميكة. بروتوكول الموصوفة هنا يسمح لتحقيق تلطيخ متجانس من البنى العميقة في أجنة كاملة. وصفت عدسة النوع النامية أنويتها 48 HPF الأجنة الزرد متجانس (الشكل 1).

الميثيل تلطيخ DNA الأخضر يسمح تمييز من دورة الخلية الاختلافات الشكلية التي تعتمد مثل التعرف على الأشكال الإنقسامية أو نوى أفكارك (الشكل 2A). هياكل النووية الدقيقة بدقة عالية واضحة أيضا كما هو مبين لنوى ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدى التطور التدريجي لتقنيات الفحص المجهري في العقود الماضية ، مع التركيز بشكل خاص على اختلافات الفحص المجهري الفلوري ، إلى إمكانية استكشاف ديناميكيات وهيكل عينات الأنسجة السليمة ، بما في ذلك الأجنة الكاملة10،11. ومع ذلك ، كان أحد القيود الرئيسية هو توافر الفلوروفورات عالية الجودة التي يمكن استخدامها لتلطيخ الهياكل تحت الخلوية بشكل مباشر وسريع.

بقع الحمض النووي الفلورية الأكثر استخداما ، مثل DAPI أو Hoechst ، متحمسة بضوء الأشعة فوق البنفسجية وتنبعث منها في المنطقة الزرقاء من الطيف ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يقدروا من Patxi Jaso لإنتاج الفيديو PEDECIBA و Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII) للتمويل الجزئي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الجلسرينسيجما ألدريتشG5516
الميثيل الأخضرالدكتور جي غرام ؛ اختبر blerأيضا 323829 Sigma-Aldrich ، وهو عبارة عن
158127
مجهري متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر Leica TCS-SP5Leica Microsystems
Phalloidin & ndash . رباعي ميثيل رودامين ب إيزوثيوسياناتسيجما ألدريتش< br / > P1951   ؛
كلوروفورمسيجما ألدريتش372978
الطرد المركزي 5810 Reppendorf5811 000.010   ؛  
شرائح المجهر زلاتغطاء D100004Deltalab
EscoالبصرياتR525025
فحص

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research. Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).
  2. Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).
  3. Latt, S. A., Stetten, G. Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis. The journal of histochemistry and cytochemistry. 24 (1), 24-33 (1976).
  4. Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
  5. Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes. Trends in genetics. 11 (1), 9(1995).
  6. Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green. Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).
  7. Kim, S. K., Nordén, B. Methyl green. A DNA major-groove binding drug. FEBS letters. 315 (1), 61-64 (1993).
  8. Nordén, B., Tjerneld, F. Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism. Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).
  9. Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes. The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).
  10. Amat, F., Keller, P. J. Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy. Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).
  11. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).
  12. Lenz, P. Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation. Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PBST

مقالات ذات صلة