يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس خارج الخلية ايون تدفقاتها باستخدام ايون انتقائية مسرى مكروي تقنية الرجوع الذاتي

13.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52782

⸱

مايو 3, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis, 2Departamento de Biologia, Centro de Biologia Molecular e Ambiental, Universidade do Minho, 3Department of Neurology and Center for Neuroscience, University of California, Davis Imaging of Dementia and Aging Laboratory, 4Department of Ophthalmology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis

في هذه المقالة

ملخص

تسمح الناقلات في أغشية الخلايا بالفصل التفاضلي للأيونات عبر أغشية الخلايا أو طبقات الخلايا وتلعب أدوارا حاسمة أثناء فسيولوجيا الأنسجة وإصلاحها وعلم الأمراض. نصف القطب الكهربائي الدقيق ذاتي المرجع الانتقائي للأيونات الذي يسمح بقياس تدفقات أيونية محددة في الخلايا والأنسجة المفردة في الجسم الحي.

الملخص

يتم تضمين الخلايا من الحيوانات والنباتات والخلايا واحدة بحاجز يسمى غشاء الخلية التي تفصل بين السيتوبلازم من الخارج. طبقات الخلية مثل ظهائر أيضا تشكيل الحاجز الذي يفصل بين الداخل من الخارج أو حجرات مختلفة من الكائنات المتعددة الخلايا. ومن السمات الرئيسية لهذه الحواجز هي توزيع الفرق الأيونات عبر أغشية الخلايا أو طبقات الخلية. خاصيتين تسمح هذا التوزيع: 1) الأغشية وظهائر عرض النفاذية الانتقائية للأيونات محددة؛ 2) يتم نقل الأيونات خلال مضخات عبر أغشية الخلايا وطبقات الخلية. هذه الخصائص تلعب دورا حاسما في الحفاظ على وظائف الأعضاء والأنسجة بمثابة إشارات العظة بعد الضرر، خلال إصلاح، أو في ظل حالة المرضية. إلى الرجوع النفس مسرى مكروي ايون الانتقائي يسمح قياسات لتدفقات معينة من أيونات مثل الكالسيوم والبوتاسيوم أو الصوديوم عند مستويات الخلايا والأنسجة واحدة. يحتوي على مسرى مكروي كوكتيل حامل الأيون الذي هوقابلة للاختراق بشكل انتقائي إلى أيون معين. الحل ملء داخلي يحتوي على تركيز مجموعة من الأيونات في المصالح. يتم تحديد الجهد الكهربائي من مسرى مكروي من التركيز الخارجي للأيون. كما يختلف تركيز أيون، وإمكانات مسرى مكروي التغييرات بوصفها وظيفة من سجل النشاط أيون. عندما انتقلت ذهابا وإيابا بالقرب من مصدر أو بالوعة للأيون (أي في التدرج تركيز بسبب تدفق أيون) إمكانية مسرى مكروي يتقلب في اتساع يتناسب مع تدفق أيون / التدرج. مكبر للصوت تضخيم الإشارة مسرى مكروي ويتم تسجيل الإخراج على جهاز الكمبيوتر. ومن ثم يمكن حساب تدفق الأيونات بالقانون فيك من نشر باستخدام تذبذب القطب المحتملين، ورحلة من مسرى مكروي، وغيرها من المعالم مثل حركة الايونات معين. في هذه الورقة، ونحن تصف بالتفصيل منهجية لقياس تدفقات أيون الخلية باستخدام-الرجوع النفس مسرى مكروي لايون انتقائيةد تقديم بعض النتائج التمثيلية.

المقدمة

ويحيط كل الخلايا الحيوانية التي كتبها طبقة ثنائية الغشاء الدهني الذي يفصل السيتوبلازم من البيئة الخارجية. تحتفظ الخلية إمكانات غشاء الكهربائية، سلبية في الداخل، عن طريق النقل النشط لأيونات 1. غشاء المحتملة هي مصدر الطاقة المخزونة التي الخلية يمكن الاستفادة لتشغيل الأجهزة الجزيئية المختلفة في غشاء 2. الخلايا العصبية والخلايا منفعل أخرى لديها إمكانات غشاء كبيرة. افتتاح السريع للقنوات الصوديوم ينهار غشاء المحتملة (الاستقطاب) وتنتج إمكانات العمل التي يتم نقلها على طول العصبون 2. وبصرف النظر عن هذه التغييرات الكهربائية السريعة، والعديد من الأنسجة والأعضاء تولد والحفاظ على إمكانات كبيرة الكهربائية على المدى الطويل. على سبيل المثال، والجلد وظهائر القرنية توليد والحفاظ على الإمكانات عبر الظهارية والتيارات الكهربائية خارج الخلية من خلال ضخ الاتجاه من الأيونات (أساسا الصوديوم وكلوريد) 3.

خيمة "> بينما قياسات الذاتية التيار الكهربائي خارج الخلية باستخدام مسبار تهتز 4-6 وقياسات غشاء أو عبر الظهارية إمكانات استخدام نظام مسرى مكروي 10/7 يتيح قياس المعلمات الكهربائية لأغشية الخلايا وطبقات الخلايا الظهارية، فإنها لا تعطي إشارة إلى الأنواع أيون المعنية.

يمكن الميكروية مع حامل الأيون انتقائية قياس تركيز أيون معين في الحل. يمكن قياس التدرجات أيون أو التمويه مع اثنين أو أكثر من الأقطاب الكهربائية في مواقع مختلفة. ومع ذلك، فإن الانجراف الجهد لا يتجزأ من كل مسبار تكون مختلفة، مما تسبب قياسات غير دقيقة أو حتى الكشف عن الانحدار الذي لم يكن موجودا. A القطب واحد المستخدمة في وضع "الرجوع إلى الذات" حيث أنه يتحرك في التردد المنخفض بين نقطتين يحل هذه المشكلة. الآن تدفق الأيونات يمكن أن ينظر إليه على خلفية الانجراف إشارة بطيئة وثابتة نسبيا (انظر الشكل 3B).

يستخدم نظام قياس حساسة ليثيوم-الميكروية الرجوع النفس ايون الانتقائي للكشف عن تدفقات خارج الخلية صغيرة من الأيونات قريبة من الأنسجة أو الخلايا وحيدة. ويتكون النظام من مكبر للصوت الذي يعالج الإشارة من مسرى مكروي والسائر المحركات الصغيرة والسائق للسيطرة على حركة مسرى مكروي. يتم توصيل مسرى مكروي ايون انتقائية والقطب المرجعية التي تغلق الدائرة إلى مكبر للصوت عن طريق headstage قبل مكبر للصوت (الشكل 1A). برامج الكمبيوتر يحدد معالم الحركة مسرى مكروي (تردد، وبعد المسافة) ويسجل أيضا إخراج مكبر للصوت. يتحكم المحرك السائر حركة مسرى مكروي عبر micropositioner ثلاثي الأبعاد. وقد تطورت A التردد المنخفض تهتز ايون انتقائية مسرى مكروي لأول مرة في 1990 لقياس تدفق الكالسيوم محددة 11. وكذلك الكالسيوم والكوكتيلات حامل الأيون الوصول تجاريا متاحة الآن لجعل ميكرoelectrodes حساسية للصوديوم وكلوريد البوتاسيوم والهيدروجين والمغنيسيوم، نترات الأمونيوم، الفلورايد، والليثيوم أو الزئبق.

في الأساس، وايون انتقائية تقنية مسرى مكروي-الرجوع النفس تحويل نشاط أيون معين المذاب في محلول إلى الجهد الكهربائي، والتي يمكن أن تقاس الفولتميتر. كوكتيل حامل الأيون هو السائل إمتزاج (العضوية، محبة للدهون) المرحلة مع خصائص التبادل الأيوني. على حامل الأيون مجمعات انتقائي (الربط) أيونات معينة عكسية ونقل لهم بين محلول مائي الواردة في مسرى مكروي (بالكهرباء) ومحلول مائي التي يتم مغمورة مسرى مكروي (1D الشكل). هذا نقل أيون يؤدي إلى التوازن الكهروكيميائية ويتم قياس الاختلاف من الجهد الكهربائي بين مسرى مكروي والقطب المرجعية من قبل الفولتميتر. الجهد يتناسب مع لوغاريتم النشاط أيون معين وفقا لنرنست هquation السماح للحساب تركيز أيون (الشكل 2A و B).

في الوقت الحاضر، العديد من النظم تسمح قياس تدفق الأيونات باستخدام مفهوم أو مبدأ مماثل. على سبيل المثال، القطب تقنية المسح الضوئي ايون انتقائية (SIET) 12،13 أو مسرى مكروي ايون الجريان تقدير (MIFE) تقنية وضعتها نيومان وShabala 14-16 متاحة تجاريا وتستخدم على نطاق واسع من قبل الأوساط البحثية من أجل تحديد أيون محدد الطلاءات التي تحدث في غشاء الخلايا والأنسجة عبر مجموعة متنوعة من الحيوانات والنباتات ونماذج خلية حية واحدة. وقد استخدمت الميكروية ايون انتقائية لقياس الهيدروجين والبوتاسيوم والكالسيوم تدفق عبر جذور النباتات 17، تدفق الكلوريد في الفئران الشرايين الدماغية 18 و 19 في أنابيب حبوب اللقاح، تدفق الهيدروجين في خلايا الشبكية تزلج 20، تدفق الكالسيوم في العظام بالنسبة للفئران 21، أيون مختلف الفيض في خيوط فطرية 22 و في صفي القرنية 23، وأخيرا تدفق الكالسيوم خلال الجرح خلية واحدة الشفاء 12،24. انظر أيضا الاستعراض التالي للحصول على معلومات مفصلة على الرجوع النفس الميكروية ايون الانتقائي 25.

تتناول المقالة التالية بالتفصيل كيفية إعداد وتنفيذ قياس الذاتية تدفقات أيون الخلية باستخدام-الرجوع النفس تقنية مسرى مكروي ايون انتقائية على مستوى خلية واحدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. ايون انتقائية إعداد مسرى مكروي-الرجوع الذاتي

  1. إعداد ايون انتقائية مسرى مكروي
    1. الحرارة سحب رقيقة الشعرية البورسليكات الجدران من دون خيوط (1.5 ملم القطر الخارجي، 1.12 مم القطر الداخلي) باستخدام مجتذب مسرى مكروي.
      ملاحظة: هذا يعطي نصائح 3-4 ميكرون في القطر. نصائح صغيرة لديها مقاومة أعلى مما يجعل الميكروية أكثر عرضة للضوضاء الإلكترونية، ويرتبط أيضا مع استجابة أبطأ إلى تغيير في تركيز أيون. ويمكن الاطلاع على معلومات مفيدة في ورقة نشرتها سميث وآخرون. 26.
    2. Silanize الأقطاب لجعل مسعور السطح الداخلي لمساعدة الإبقاء على كوكتيل حامل الأيون محبة للدهون. وضع الميكروية في رف معدني والحرارة O / N في الفرن على> 100 ° C لتجفيفها. رف هو لوحة معدنية مع ثقوب قطرها 2 ملم حفر جزء من طريق. وضع أقطاب كهربائية في ثقوب غيض صعودا مع 250 مل غرامدورق معشوقة عليها.
    3. في الصباح، وتحويل الفرن قبالة وبينما يرتدي قفازات عازلة، وإزالة بعناية رف معدني مع الأقطاب والكأس في المكان. إغلاق باب الفرن للاحتفاظ بالحرارة.
    4. ارتداء اللاتكس أو النتريل قفازات، معطف مختبر وحماية العين. مع البلاستيك ماصة باستير، ضع قطرة من silanization حل I عند قاعدة كل قطب كهربائي (الحفاظ على الكأس في المكان، واستخدام شفة صب للوصول ماصة). ويتبخر الحل silanization من قبل صفيحة ساخنة وsilanizes الداخل من الأقطاب الكهربائية. استخدام مستخرج الكيميائية غطاء الدخان لهذه المرحلة. وضع رف / كوب / أقطاب مرة أخرى في الفرن الساخن لبضع ساعات للسماح لأي حل silanization المتبقية لتتبخر.
      ملاحظة: لأسباب تتعلق بالسلامة، لا تتحول الفرن مرة أخرى. وضع ملصق على الفرن تشير إلى أنه لا يجب أن تكون في وضع التشغيل لأنها قد تحتوي على بخار الضار وقابلة للاشتعال.
    5. بعد التبريد، وتخزين الميكروية في تخزين مسرى مكروي جرة الإعلامييندي مجفف زجاجي مع 400 غرام من المجففة. الميكروية يمكن تخزينها وبالتالي لعدة أسابيع.
      ملاحظة: ووصف طريقة silanization بديل في سميث وآخرون 26.
    6. العودة ملء مسرى مكروي مع 50-100 ميكرولتر (يبلغ طوله حوالي 1 سم) من محلول يحتوي على 100 ​​ملي من أيون المراد قياسها (انظر الجدول 1 والشكل 1B). استخدام المتاح باستور البلاستيك ماصة للحرارة سحبت في موقد بنسن إلى خيوط على ما يرام. شطف ماصة في DH 2 O بعد ذلك لمنع انسداد.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، وضبط تركيز أيون من الحل الردم لتتناسب مع تركيز ايون في الحل الخارجي 27.
    7. مراقبة مسرى مكروي تشريح تحت المجهر للتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء.
      1. إذا فقاعات الصنبور الحالي مسرى مكروي باستخفاف مع عقلة الإصبع، في حين عقد القطب عموديا (نصيحة لأسفل) و / أو دفع فقاعةق من غيض من خلال تطبيق الضغط الخلفي باستخدام حقنة تعديل مع أنبوب السيليكون استبدال الإبرة.
    8. بلاغ ملء مسرى مكروي مع 15-20 NL (بطول 30-50 ميكرون) من أيون محددة حامل الأيون كوكتيل (انظر الجدول 1). وضع قطرة صغيرة من حامل الأيون كوكتيل على حافة قصيرة من شريحة المجهر. مراقبة طرف مسرى مكروي تحت المجهر تشريح وتحريكه نحو شريحة المجهر حتى يلمس طرف مسرى مكروي كوكتيل حامل الأيون فقط حوالي نصف ثانية. رسم كوكتيل حامل الأيون في مسرى مكروي الضغط الشعرية.
      ملاحظة: تجنب عمود طويل من حامل الأيون كوكتيل لأن ذلك يزيد من المقاومة الكهربائية لجنة التحقيق والتي يمكن أن تجعل من عرضة للتدخل الالكترونية (الضوضاء)، وكذلك يؤدي إلى إبطاء زمن الاستجابة.
    9. تركيب مسرى مكروي في حامل مسرى مكروي مستقيم مع الذهب 1 ملم موصل الذكور وأجكل (حج +) سلك (الشكل 1B).
    10. إرفاق حامل مسرى مكروي إلى مرحلة الرأس التي شنت على الكمبيوتر التي تسيطر عليها ثلاثي الأبعاد micropositioner الإلكترونية (الشكل 1A).
    11. ضع طرف مسرى مكروي في قياس مناسبا حل للعينة المراد قياسها (المالحة الفسيولوجية، مستنبت، الخ) للسماح للمسرى مكروي لتحقيق الاستقرار لساعة أو ساعتين، أو حتى بين عشية وضحاها.
  2. إعداد القطب المرجعية
    1. أقطاب المرجعية (الشكل 1C) هي نفس الشعيرات الدموية على النحو الوارد أعلاه. قطع الشعرية مع قلم رصاص الماس إلى 5 سم أطوال ومصقول إطلاق النار في نهاية كل مدة 1-2 ثانية في لهب بنسن.
    2. ملء هذه الأقطاب مع ~ 200 ميكرولتر من 3 M حل كلوريد الصوديوم، CH 3 CO 2 K (أسيتات البوتاسيوم) أو بوكل مع 2٪ الاغاروز. اختيار الحل تبعا لايون إلى أن تقاس (يجب أن لا يحتوي على القطب إشارة أيون يجري قياسه؛ انظر الجدول 1). مزيجالاغاروز والحل والحرارة إلى ما يقرب من الغليان في الميكروويف. يحرك المزيج حتى يذوب الاغاروز (الحل يذهب واضح).
    3. نعلق القطب الإشارة إلى البلاستيك ماصة باستير ورسم الحل الساخن في الشعيرات الدموية.
    4. إسقاط القطب البارد إلى 3 M كلوريد الصوديوم، CH 3 CO 2 K أو حل بوكل وتخزينها في هذا 3 M الحل في أنابيب مغلقة قبل استخدامها. تجاهل أي أقطاب المرجعية مع فقاعات الهواء.
    5. جبل القطب المرجعية في حامل مسرى مكروي على التوالي (ما قبل مليئة 3 M الحل) مع أجكل (حج +) بيليه داخل والذهب 2 مم موصل الذكور (الشكل 1C) ونعلق القطب وحامل على يدوي الصغرى مناور شنت على الوقوف المغناطيسي.

2. ايون انتقائية مسرى مكروي معايرة الرجوع الذاتي

  1. إعداد الحلول معايرة تحتوي على أيون ذات الاهتمام كما هو الحال في الحل المرجعية؛ انظر الجدول رقم 1 . القوس تركيز هذا هو في الحل سوف تكون العينة في (على سبيل المثال وسائل الإعلام والثقافة، والمالحة الفسيولوجية). وهذا هو، يجب أن يحتوي على محلول المعايرة واحدة أقل تركيز أيون مما كانت عليه في حل القياس، واحد أعلى.
    1. على سبيل المثال، استخدام المياه المالحة التي تحتوي على 1 ملم من K +. إلى قوس هذا التركيز، ويحل مسحوق بوكل في الماء منزوع الأيونات إلى تركيز من 10، 1 و 0.1 مم في التخفيفات التسلسلية. استخدام هذه الحلول المعايرة. بدلا من ذلك، استخدم اثنين على الأقل من هذه الحلول.
  2. تزج مسرى مكروي ايون انتقائية والقطب المرجعية في كل حل المعايرة والسماح للقيمة الجهد استقرار ل1-3 دقائق قبل ان يسجل الجهد المقابلة باستخدام برامج مخصصة (انظر الجدول 1).
  3. كما البرنامج يحفظ البيانات (خرج مكبر للصوت) كملف txt و نسخ البيانات إلى ملف جدول بيانات. مؤامرة إخراج مسرى مكروي (السيارات) ضد لوغاريتمتركيز أيون المولي (الشكل 2A).
  4. تطبيق الانحدار الخطي وحساب نرنست المنحدر، واعتراض R 2 قيمة. قبول مسرى مكروي إذا كان المنحدر نرنست 58 ± 11 فولت / العقد لأيونات الأحادي التكافؤ و 29 ± 11 فولت / العقد لأيونات ثنائي التكافؤ (لالكاتيونات، المنحدر نرنست هو إيجابي، لالأنيونات هو سلبي). بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون الميكروية جيدة ارتباط قوي الخطية (R 2> 0.9، الشكل 2B).
    ملاحظة: ناتج بالسيارات من مكبر للصوت تستخدم هنا يعطي بالسيارات القراءة مع زيادة عشرة أضعاف. القيم يجب أن تكون مقسمة من قبل عامل من عشر سنوات.
  5. استخدام صيغة الانحدار الخطي لتحويل الانتاج بالسيارات الخام من مسرى مكروي إلى تركيز أيون الفعلي (الشكل 2B).

3. التحقق من مسرى مكروي تقنية ايون انتقائية

  1. إعداد مصدر الاصطناعي
    1. الشعيرات الدموية مصدر الاصطناعية هي نفس الشعيرات الدموية كماأعلاه. الحرارة سحب الشعرية باستخدام مجتذب مسرى مكروي كما في الخطوة 1.1.1.
    2. الردم هذه الشعيرات مع 200 ميكرولتر من 1 M حل كلوريد الصوديوم، بوكل، CaCl 2 2 H 2 O أو الرقم الهيدروجيني 4 العازلة. اختيار الحل مصدر الاصطناعي تبعا لايون أن يقاس (انظر الجدول 1).
      ملاحظة: بدلا من ذلك، وسحب أقطاب مع أكبر قطر الحافة (~ 20 ميكرون)، وطرف ملء مع نفس الحلول ولكن تحتوي على 0.5-1٪ الاغاروز (الاغاروز سيمنع أي تدفق الجزء الأكبر من الحل).
    3. جبل الشعرية مصدر اصطناعية على micromanipulator وتزج به في حل المستخدمة لقياس تدفق الأيونات في العينات. ترك المصدر الاصطناعي في حل لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة للسماح للاستقرار التدرج.
  2. المصادقة على مسرى مكروي ايون انتقائية
    1. تزج مسرى مكروي ايون الانتقائي عن سنتيمتر واحد بعيدا عن الشعرية المصدر الاصطناعي في حل تستخدم لmeasuإعادة تدفق الأيونات على العينات وإغلاق الدائرة مع القطب المرجعية كما كان من قبل. السماح للقيمة الجهد استقرار ل1-3 دقائق قبل ان يسجل الجهد المقابلة باستخدام برامج مخصصة ل1-2 دقيقة. هذه القيمة يناظر قيمة عازلة (في الأدب يشار أيضا كمرجع، الخلفية أو قيمة فارغة).
    2. نقل مسرى مكروي ايون الانتقائي إلى حوالي 5 ميكرون من مصدر صناعي، والسماح للقيمة الجهد استقرار ل1-3 دقائق قبل ان يسجل الجهد المقابلة باستخدام برنامج ل1-2 دقيقة.
    3. كرر الإجراء أعلاه عن طريق وضع ايون مسرى مكروي انتقائية في 10، 20، 40، 80، 160، 320، 640 و 1280 ميكرون بعيدا عن الشعرية مصدر اصطناعية.
    4. استخراج البيانات على ملف txt ونسخ القيم في ملف البيانات.
  3. حساب تركيز أيون المقابلة لقيم بالسيارات في بنفس الطريقة التي لقيم المعايرة. رسم القيمة.
    لاالشركة المصرية للاتصالات: إذا كان تدفق الأيونات هو الحاضر، ومسرى مكروي بالكشف عن اختلاف في تركيز أيون بين الموقفين (الشكل 3B). إذا كان مصدر صناعي يحتوي على أكثر أيونات من الأنواع يقاس من الحل، يجب أن يكون التركيز أعلى بالقرب من مصدر من بعيد، التحقق من قدرة مسرى مكروي ايون الانتقائي للكشف بشكل صحيح اتجاه وتدفق أيون (في هذه الحالة هروب رأس المال؛ لبالوعة الاصطناعي، مع تركيز أيون أقل تحديدا من قياس المتوسطة، ينبغي أن يكون تدفق).
    1. حساب تدفق أيون باستخدام القانون فيك من نشر: J = ج μ (العاصمة / DX) حيث ج هي تركيز أيون في حل (مول سم -3)، μ هي حركة الايونات (مول سم N -1 ثانية -1) والعاصمة هي الفرق تركيز على DX مسافة (سم) (الشكل 2C). وعادة ما أظهرت البيانات تدفق الأيونات في بمول سم -2 ث-1 أو -2 نانومول سم ثانية -1.
      ملاحظة:. طريقة بديلة لحساب تدفق الأيونات التي وصفها سميث وآخرون 26 يمكن استخدامها. وتشمل الاختلافات الرئيسية استخدام معامل الانتشار بدلا من حركة الايونات والطرح من تدفق الأيونات الخلفية (أيضا الجهد الانجراف أو معامل التصحيح) تحسب من قياس تدفق الأيونات في محلول ملحي بدون العينة.
    2. رسم متوسط ​​تدفقات أيون كل خطوة ضد المسافة من المصدر (الشكل 2D). الابتعاد عن المصدر، نلاحظ انخفاضا هائلا من قيمة التدفق التحقق من قدرة مسرى مكروي ايون الانتقائي لاستشعار حجم مختلفة من تدفقات أيون.
    3. هل التحقق من صحة مصدر الاصطناعي مرة واحدة لكل أيون معين المراد تسجيلها من أجل التحقق من صحة اتجاه وحجم قياساته الصحيحة مع الإشارة إلى ن كبيرنسبة إيل دو فرانس.
      ملاحظة: ايون قياس تدفق المخزن المؤقت دون عينات تشير إلى مستوى خلفية أو الضوضاء. عادة، ويظهر قياس عازلة عدم حدوث تذبذب واضح للتركيز أيون مما أدى إلى تدفق صغير جدا التي تعرض الاتجاهات المتغيرة.

4. إعداد غرفة القياس

ملاحظة: قبل التجارب، والنظر في العينة إلى أن تقاس وكيف كانت العينة التي يتم تركيبها ويجمد لقياس مسرى مكروي.

  1. لالمورق القيطم القياسات بويضة قطع 1 سم مربع من 800 شبكة من النايلون ميكرون (شبكة nitex) والغراء قبل أن تتحول إلى البلاستيك طبق بتري (الشكل 1E).

5. ايون الجريان قياس

  1. قياس تركيز أيون الحالي في المنطقة العازلة المستخدمة لتنفيذ القياسات على عينة بالطريقة نفسها كما من أجل حل المعايرة. X. البويضات المورق تتطلب التعديل قارع الأجراس مارك (MMR). دissolve كلوريد الصوديوم، بوكل، CaCl، MgCl وHEPES في الماء منزوع الأيونات للوصول إلى تركيز النهائي من (ملم): 100 كلوريد الصوديوم، 2 بوكل، 2 CaCl، 1 MgCl و 5 HEPES. ضبط درجة الحموضة من المخزن المؤقت إلى 7.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم.
  2. وضع العينة في غرفة القياس وتقديم ايون انتقائية مسرى مكروي بالقرب من عينة (حوالي 10 ميكرون بعيدا) باستخدام micropositioner لتحديد موقف قريب من مسرى مكروي (الشكل 3A).
  3. بدء تشغيل التردد المنخفض (0.3 هرتز) رحلة (100 ميكرون) من مسرى مكروي بين الموقف الوثيق وموقف بعيدا عن العينة (بعيدة) باستخدام برامج مخصصة. تأكد من أن حركة مسرى مكروي هو عمودي على سطح العينة.
    ملاحظة: رحلة من مسرى مكروي يمكن تعيين على البرنامج. رحلة كبيرة يزيد من التدرج قراءة السماح للكشف عن أسهل من تدفقات صغيرة خلال بينما قياس يطيل الفترة أخذ العينات ويقلل من القرار الزماني. شاهد 3A الشكل على سبيل المثال.
  4. بدء التسجيل باستخدام البرنامج. مؤقتا مسرى مكروي في كل موقف ويتم تسجيل الجهد الكهربائي في بالسيارات على الكمبيوتر. الحصول على قياسات لمدة 2 دقيقة على الأقل، مما يتيح الاستقرار إشارة. لقصيرة التجارب مرور الزمن، والاختلافات المحتملة قياسية في موقف مصلحة للدورة طوال الوقت.
  5. استخراج البيانات على ملف txt ونسخ القيم في ملف البيانات.
  6. حساب تركيز أيون المقابلة لقيم بالسيارات في بنفس الطريقة التي لقيم المعايرة. رسم القيمة.
    ملاحظة: إذا كان تدفق الأيونات هو الحاضر، ومسرى مكروي بالكشف عن اختلاف في تركيز أيون بين الموقفين (الشكل 3B).
  7. حساب تدفق أيون باستخدام القانون فيك من نشرها كما كان من قبل (الخطوة 3.3.1).
  8. تكرار قياس المخزن المؤقت قبل قياس عينة جديدة وتكرار إجراء قياس التدفق وحساب لكل جديدةعينة.

6. التحليل الإحصائي وعرض البيانات

  1. اختبار الآثار، بمعزل عن الموقف و / أو الوقت على تدفقات أيون تحت شرط التحكم باستخدام نموذج ANCOVA مع آثار مختلطة 28.
    ملاحظة: تحليل التغاير ANCOVA، هو النموذج الخطي العام الذي يمزج ANOVA منتظم والانحدار من خلال السماح التدابير كلا الفئوية والمستمرة لاستخدامها كمتغيرات مستقلة. بالإضافة إلى ذلك، في ظل وجود أخطاء المترابطة الناجمة عن التدابير المتكررة في الآثار المتداخلة الفردية والنهائية، ويتم استخدام تأثير مختلطة نماذج لنموذج تقديرات دقيقة لكلا الآثار الثابتة والعشوائية.
  2. حساب مقارنات البشرى باستخدام طالب تي -test بين مستويات المجموعة مع تصحيح Bonferroni لعدة اختبار 28.
  3. توليد boxplots لتلخيص قياسات تدفق الأيونات وفقا لموقف والوقت. وتشمل القيم ص من ر طالب البشرى وصفهفوق (الشكل 3D) وتشير إلى المستويات أهمية القيم ص على النحو التالي: *: p <0.05. **: p <0.01. ***: P <0.001 29

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لقد أظهرنا سابقا أن تدفق الكالسيوم يظهر بعد خلية واحدة اصابة 24 اخرين. لذا سألنا عما إذا تدفقات ايون أخرى تحدث عند إصابة خلية واحدة. استخدمنا X. المورق البويضة، وهذا نموذج راسخة لخلية واحدة التئام الجروح 30-34 وتسجيل الكهربية 24،35-39. ومن المثير للاهتمام، أيونات البوتاسيوم هي أكثر تركيزا داخل X. المورق البويضات (حوالي 110 ملم) 40 منه في حل خارج الخلية المستخدمة (في MMR 1X: 1 ملم) مما يشير إلى هروب رأس المال من البوتاسي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخطوات الأكثر أهمية لقياس النجاح في تدفقات أيون الخلية في الجسم الحي هي: الحد من الضوضاء، وتلفيق الصحيح للالميكروية ايون انتقائية والمرجعية القطب، وتحديد المواقع من العينة وكل من الأقطاب الكهربائية.

من أجل الحد من الضوضاء، ويجب أن يكون نظام التسجيل في اختبأ (على الارض) قفص فاراداي ويفضل مع (عزل الاهتزاز) الجدول وتصدرت المعدن الذي اختبأ أيضا. بالإضافة إلى ذلك، كما ينبغي تأريض الهيكل المجهر. وتشمل مصادر ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المؤسسة الوطنية للعلوم MCB-0951199 ، وجزئيا من خلال EY01910 منحة المعاهد الوطنية للصحة ، ومنح معهد كاليفورنيا للطب التجديدي RB1-01417 ومنحة Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) SFRH / BD / 87256/2012.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
IonAmp   مركز أبحاث BioCurrents ، وودز هول ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةلا يوجدمكبر للصوت تم إنشاؤه بواسطة مركز أبحاث BioCurrents ، وودز هول ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ يمكن شراء نظام مماثل من " وظيفة XBL مهمة" (http://www.xuyue.org/) أو من " أصغرالولايات المتحدة الأمريكية" (http://www.youngerusa.com/) أو من الإلكترونيات المعمول بها (http://www.applicableelectronics.com/)
IonAmp32   ؛  مركز أبحاث BioCurrents ، وودز هول ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةلا يوجدبرنامج تم إنشاؤه بواسطة مركز أبحاث BioCurrents ، وودز هول ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ يمكن شراء نظام مماثل من " وظيفة XBL مهمة" (http://www.xuyue.org/) أو من " أصغرالولايات المتحدة الأمريكية" (http://www.youngerusa.com/) أو من الإلكترونيات المعمول بها (http://www.applicableelectronics.com/)
مضخم الصوت المسبق لمرحلة الرأس  ؛ مركز أبحاث التيارات الحيوية ، وودز هول ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةINA116BSR Voltage Follower INA116 ، الذي صممه مركز أبحاث BioCurrents ، وودز هول ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ يمكن شراء نظام مماثل من " وظيفة XBL مهمة" (http://www.xuyue.org/) أو من " أصغرالولايات المتحدة الأمريكية" (http://www.youngerusa.com/) أو من الإلكترونيات المعمول بها (http://www.applicableelectronics.com/)
MicroStep Driver  ؛ مركز أبحاث BioCurrents ، وودز هول ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية، لا يلزموجود ثلاثة محركات MicroStep لتحديد المواقع X و Y و Z ؛ تم إنشاؤه بواسطة مركز أبحاث BioCurrents ، وودز هول ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ يمكن شراء نظام مماثل من " وظيفة XBL مهمة" (http://www.xuyue.org/) أو من " أصغرالولايات المتحدة الأمريكية" (http://www.youngerusa.com/) أو من الإلكترونيات القابلة للتطبيق (http://www.applicableelectronics.com/)
جهاز تحديد المواقع الدقيقة اليدوي   ؛  الدقيقة العالمية نموذج KITE-Rيمكن شراء نظام مماثل من Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Magnetic stand     World PrecisionInstruments Model M10من Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Vibration Isolation Table   شركة نيوبورت          نموذج VW-3036-OPT-023040يمكن شراء نظام مماثل من الإلكترونيات القابلة للتطبيق(http://www.applicableelectronics.com/)
جزء من ثلاثة أجهزة تحديد المواقع الدقيقة الأبعاد الإضافية: قوس الزاوية ، 90 درجة ؛ الوجوه المشقوقةNewport Inc.   ؛        نموذج 360-90يتطلب تجميع جهاز تحديد المواقع الدقيقة الثلاثة dimantionnal أيضا ثلاثة محركات دوارة كهربائية للتحكم X و Y و Z وذراع تركيب MPH-1 مع عمود بزاوية قابلة للتعديل MCA-2 وموصلات ومسامير مختلفة من Newport لتثبيتها على طاولة الاهتزاز
جزء من ثلاثة أجهزة تحديد المواقع الدقيقة الثنائية: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 بوصة X TravelNewport Inc.   ؛        460PD-Xلا شيء
جزء من ثلاثة أجهزة تحديد المواقع المجهرية الأبعاد: المرحلة الخطية سريعة التركيب ، 0.5 بوصة XY TravelNewport Inc.460A-XYلا شيء
Kwik-Fil الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات رقيقة الجدران بدون خيوط  الدقيقة العالمية TW150-4لا شيء
مجتذب القطب الكهربائي Narishige  PC-10لا شيء
رف معدنيمصنوع في المنزللا شيءحامل قطب كهربائي معدني مصنوع في المنزل عن طريق حفر ثقوب بعرض 2 مم نصف سنتيمتر متباعدة في قاعدة مستطيلة 10 سم × 15 سم من فرن فولاذي
QLModel 10 Lab Ovenلا شيء
حل Silanization I & nbsp ؛Sigma-Aldrich85126Dangerousous, التعامل على النحو الموصى به من قبل المزود 
طبق بتري زجاجي PyrexFisher Scientific316060لا شيء
جرة تخزين القطب الكهربائي / الماصة الدقيقةالعالمية للأدوات الدقيقة  E215لا شيء
مجفف الزجاجفيشر Scientific08-595Eيحتوي على مجفف Drierite (WA Hammond Drierite Co. Ltd ، Xenia ، OH ، الولايات المتحدة الأمريكية). ضع الفازلين على الختم لجعله محكم الإغلاق.
ماصة باستور بلاستيكية فيشر ساينتفيك11597722لا شيء
موقد بنسنفيشر ScientificS97329لا شيء
شريحة مجهرSigma-AldrichS8902لا شيء
حامل قطب كهربائي دقيق مستقيمWarner InstrumentsQSW-A15Pمع موصل ذكر ذهبي 1 مم وسلك Ag / AgCl
حامل قطب كهربائي دقيق مستقيم   ؛World Precision InstrumentsMEH3Sمع بيليه AgCl (Ag+< / sup>) بالداخل وموصل ذكر ذهبي 2 مم   ؛
طبق بتري 6 سمVWR60872-306لا شيء
شبكة NitexDynamic Aqua-Supply Ltd.NTX750لا شيء
الغراء. لوكتايت الايبوكسيVWR500043-451امزج الغراء والمقسى في أجزاء متساوية في قارب وزن بلاستيكي واخلطه جيدا. يثبت بسرعة ولكن يترك في RT لمدة 24 ساعة للعلاج
الكامل للمياه منزوعة الأيونات  سيجما ألدريتش99053لا شيء
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتشS7653لا شيء
كلوريد البوتاسيومسيجما ألدريتشP9333لا شيء
كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتشC1016لا شيء
كلوريد المغنيسيومسيجما ألدريتشM8266لا شيء
هيبسسيجما ألدريتشH3375لا شيء
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتشS8045لا شيء
أسيتات البوتاسيومسيجما ألدريتشP1190لا شيء
أغاروزسيجما ألدريتشA9539لا شيء
الأدوات يمكن شراء نظام الأدوات

المراجع

  1. Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
  2. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
  3. Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
  4. Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
  5. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
  6. Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  7. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  8. Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
  9. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
  10. McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
  11. Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
  12. The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. , Springer-Verlag. 235-252 (1999).
  13. Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 109-137 (2006).
  14. Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
  15. Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
  16. Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
  17. Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
  18. Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
  19. Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
  20. Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
  21. Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
  22. Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
  23. Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411(2011).
  24. Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
  25. Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. H. , (2007).
  26. Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
  27. Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
  28. Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D. Ch. 48. Compstat. Momirović, K., Mildner, V. , Physica-Verlag HD. 317-321 (1990).
  29. Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. Graphical methods for data analysis. , Wadsworth & Brooks/Cole. (1983).
  30. Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
  31. Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
  32. Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
  33. Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
  34. Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
  35. Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
  36. Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
  37. Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. London, England, , 491-497 (1982).
  38. Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
  39. Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
  40. Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
  41. Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
  42. Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
  43. McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
  44. Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
  45. Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
  46. McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
  47. McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

قياس خارج الخلية ايون تدفقاتها باستخدام ايون انتقائية مسرى مكروي تقنية الرجوع الذاتي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.