يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ما يفعل وما يترك في إعداد العضلات Cryosections للتحليل النسيجي

33.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52793

⸱

مايو 15, 2015

 ,  ,  , 
1Sargent College, Boston University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا نوضح أكثر الطرق فعالية لتجميد خزعات العضلات وتضمينها وتقطيعها بالتبريد وتلطيخها لتجنب تجميد القطع الأثرية.

الملخص

وقد خدم التقييم النسيجي للخزعة العضلات كأداة لا غنى عنها في فهم تطور وتقدم من أمراض الاضطرابات العصبية والعضلية. ومع ذلك، من أجل القيام بذلك، تحتاج الرعاية المناسبة الواجب اتخاذها عند استئصال والحفاظ على الأنسجة لتحقيق تلطيخ الأمثل. أسلوب واحد من الحفاظ على الأنسجة ينطوي على تحديد الأنسجة في الفورمالديهايد ومن ثم دمجها مع شمع البارافين. هذا الأسلوب يحفظ التشكل بشكل جيد ويسمح للتخزين طويل الأجل في RT لكن هو مرهق ويتطلب التعامل مع المواد الكيميائية السامة. وعلاوة على ذلك، النتائج الفورمالديهايد التثبيت في مستضد عبر ربط، وهو ما يتطلب بروتوكولات استرجاع مستضد لالمناعية فعالة. على العكس من ذلك، لا يتطلب باجتزاء المجمدة التثبيت وبالتالي يحتفظ البيولوجي التشكل المستضد. يوفر هذا الأسلوب أيضا ميزة واضحة بدوره سريعة حول الوقت، مما يجعلها مفيدة بشكل خاص في الحالات التي تحتاج إلى تقييم النسيجي سريع مثل intraoperaموانع الخزعات الجراحية. نحن هنا وصف الأسلوب الأكثر فعالية لإعداد خزعات العضلات التصور مع مختلف البقع النسيجية والمناعية.

المقدمة

فحص الأنسجة العضلية يلعب دورا حاسما في فهم أنواع مختلفة من الاضطرابات العصبية والعضلية 1-4. عندما جنبا إلى جنب مع تقنيات أخرى، فإنه يسمح للباحثين للحصول على فكرة أفضل عن مظاهر وتطور علم الأمراض، ويمكن أيضا أن يكون أساسيا لتقييم فعالية التدخل العلاجي 10/05. ومع ذلك، لتكون دقيقة، تحتاج الأنسجة الى الحفاظ عليها بطريقة سليمة وذلك للحفاظ على الحالة الفسيولوجية على الفور قبل الختان. وهذا يتطلب عناية كبيرة خلال إزالة والحفاظ عليها وباجتزاء، وتلطيخ.

الأنسجة يمكن إعداد بطريقتين مختلفتين للدراسة المجهرية الخفيفة. الطريقة الأولى، الفورمالين الثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ من (FFPE) أقسام، يتطلب الأنسجة لتكون ثابتة في 10٪ الفورمالديهايد مخزنة الطبيعي قبل أن يتم دمجهم مع شمع البارافين 11،12. الخطوة تثبيت تساعد على الحفاظ على التشكل أفضل ولكن أيضا عبر الروابط والعلاقات العامة المحليةoteins مما يستلزم إجراءات استرجاع مستضد المعقدة لالمناعية والقضاء على إمكانية الأنزيمية تلطيخ على هذه المقاطع 12. أقسام المجمدة، من ناحية أخرى، لا تحتاج إلى أن يكون ما قبل ثابتة أو معالجتها. لذلك، البروتينات هي قادرة على الاحتفاظ التشكل البيولوجية الأم 13،14. وعلاوة على ذلك، الأبواب المجمدة تسمح أيضا للمرة تحول سريع، وهو في أوقات الضرورة، على سبيل المثال في التشخيص أثناء العملية من الأورام اللحمية وخزعات جراحية أخرى 15. ومع ذلك، إذا لم ينفذ بشكل سليم، وهذا الأسلوب هو عرضة للتجميد الضرر الذي يدخل تغييرات على بنية العضلات مما يجعل الأجزاء غير صالحة للفحص النسيجي. وهذه الورقة تحدد الأسلوب الأكثر فعالية لإعداد الخزعات العضلية من أجل تحقيق تلطيخ الأمثل للفحص الصحيح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الأنسجة الحصاد وتجميد الأنسجة العضلية

  1. الموت ببطء الفأر مع جرعة زائدة من الأيزوفلورين (2-كلورو-2- (difluoromethoxy) -1،1،1-trifluoro-الإيثان). تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان واستخدام أسلوب الاحتواء الثانوي مثل مجفف أو جرة الجرس تحتوي على قطعة من القطن غارقة في الأيزوفلورين.
  2. تأكيد وفاة خلال الضغط بحزم قاطع الطريق. استخدام أسلوب الثانوية للقتل الرحيم مثل خلع عنق الرحم.
  3. الرطب الفراء مع الكحول 70٪ للحد من الخلاف من جدائل الشعر فضفاضة على العضلات. قشر الجلد قبالة الطرف باستخدام ملقط غرامة مثل # 5.
  4. فصل بعناية عضلة الفائدة (الظنبوبي الأمامي (TA) في هذه الحالة) من العظام تحتها، بدءا من وتر وإزالتها.
  5. استئصال العضلات، وتغطية ذلك في أكتوبر (قطع الأمثل درجة حرارة المركبة)، ووضع عليه شقة في قالب تجميد المتاح المسمى. تأكد من أن العضلات هي في توجهاته فيزيولوجية طبيعية (الرأس إلى تايل) دون التمدد. بدلا من ذلك، تجميد العضلات على الساحات الستايروفوم صغيرة ويعلقون عليه باستخدام دبابيس الحشرات لضمان طول الصحيح للعضلات.
  6. هدئ 2-methylbutane (isopentane) في كوب الصلب باستخدام النيتروجين السائل. هذا يستغرق في المتوسط ​​3-5 دقيقة. الحفاظ على اثارة بشكل متقطع حتى تبدأ الرواسب البيضاء التي تشكل في القاع وجدران الكأس.
    ملاحظة: عند حدوث ذلك، قد وصلت isopentane الأمثل درجة حرارة التجمد (-150 درجة مئوية)
  7. تراجع القوالب التي تحتوي على عضلات في برود 2-methylbutane. تجميد العضلات الصغيرة مثل إبهام اليد الحجاب الحاجز والباسطة للأصابع (EDL) ل6-12 ثانية، والعضلات الكبيرة مثل النعلية الساق (GS) وثلاثية الرؤوس لمدة 15 - 20 ثانية. لا تجميد العضلات لفترة طويلة جدا لأن هذا قد يؤدي إلى تكسير.
  8. نقل الأنسجة المجمدة إلى الثلج الجاف، والسماح للتتبخر isopentane (لاحظ أن هذه العملية تستغرق في المتوسط ​​حوالي 15-20 دقيقة). التفاف الأنسجة في رقائق الألومنيوم وتخزينها في شltra درجة حرارة منخفضة (-70 ° C إلى -80 درجة مئوية) حتى باجتزاء.

2. تضمين الأنسجة في أكتوبر لإعداد كتلة الأنسجة

  1. الأنسجة النقل على الجليد الجاف لcyrostat لمنع ذوبان الجليد. الأنسجة نقل إلى غرفة ناظم البرد (وضعت في -20 إلى -24 ° C لتجنب ذوبان كامل للأنسجة) والسماح لهم تتوازن لمدة 30 دقيقة.
  2. تحويل خليج بلتيير تبريد جرا. إذا لم يكن لديك ناظم البرد هذا التبريد، استخدم الهباء الجوي رذاذ التبريد لتجميد بسرعة أكتوبر لا تدع ذوبان العضلات في أي لحظة خلال التضمين وهذا يمكن أن يؤدي إلى تلف التجميد.
  3. إضافة طبقة رقيقة موحدة من أكتوبر على القرص العينة وندعه يبرد. عندما يتم تجميد أكثر من أكتوبر على الجزء السفلي في حين لا يزال السائل على الجزء العلوي، وإدراج الأنسجة في الاتجاه الصحيح (عمودي أكتوبر للقطاعات عرضية وبموازاة أكتوبر للالمقاطع الطولية). استخدام الهباء الجوي رذاذ التبريد لتجميد بسرعة أكتوبر تلمس الجزء unembeded من النسيج مع تحويلة الحرارةractor وانتظر لمدة 45 ثانية.
  4. إضافة طبقة رقيقة أخرى من أكتوبر حول العضلات، ورذاذ مع الهباء الجوي رذاذ التبريد واستخراج الحرارة كما في الخطوة السابقة.
  5. الحفاظ على إضافة أكتوبر بزيادات صغيرة وبسرعة تجميد أكتوبر باستخدام مزيج من الهباء الجوي رذاذ ومستخرج حرارة التبريد حتى يتم تغطية العضلات كلها.
  6. وضع مستخرج الحرارة في الجزء العلوي من كتلة الأنسجة والانتظار لمدة 5 دقائق.

3. إعداد إنشائية والتعرف على أقسام من منطقة منتصف البطن من العضلات

  1. جبل العينة على رأس العينة. تشديد مقبض الباب لتأمين القرص. تأكد من أن القرص العينة على اتصال جيد مع رئيس العينة.
  2. ضبط درجة حرارة الغرفة ما بين -21 و -24 ° C وانتظر حتى يتم تحقيق درجة الحرارة المحددة.
  3. ضبط إعدادات سمك (7 ميكرون)؛ تقليم الكتلة عن طريق دفع أو سحب كتلة باستخدام إعدادات الخشنة وغرامة.
  4. جمع المقاطعفي مرحلة ما قبل تحسنت-شرائح المجهر موجبة الشحنة عن طريق الضغط على الجزء العلوي من الشريحة على الأقسام، وذلك باستخدام التجاذب بين الشحنات المتضادة لتسهيل انضمام الأقسام خفض إلى الشريحة.
  5. التعرف على أقسام منتصف البطن عن طريق قياس مساحة المقطع العرضي (CSA) من الأقسام. القيام بذلك باستخدام برامج التصوير على الكمبيوتر متصلة المجهر.
    ملاحظة: يتم التقاط الصور المرحلة التباين ويتم قياس محيط العضلة بأكملها من خلال وظيفة البحث عن المفقودين على برنامج حاسوبي. هذا وسوف تسفر كل من وكالة الفضاء الكندية وكذلك الحد الأدنى قطر النمس (قياس حجم الألياف مستعرضة أن يتم التعبير عن أصغر مسافة بين اثنين من الظلال متوازية على طرفي نقيض من الجسيمات) القياسات. ملاحظة: عندما تبدأ القياسات CSA وقطر الحد الأدنى النمس إلى الهضبة، تم التوصل إلى منتصف البطن.
  6. جرد وأرشفة الشرائح في -80 درجة مئوية لمدة تلطيخ المستقبل.
    ملاحظة: أكتوبر لا تحتاج إلى إزالة قبل staininز الإجراءات. بمجرد coverslipped الشرائح، وأنهم على استعداد لتكون ملطخة على الفور.

4. تلطيخ

ملاحظة: في حين خطوة بخطوة الإجراءات التفصيلية ويمكن الاطلاع على ورقة بيانات المنتج وينبغي اتباع إجراءات تلطيخ، قد تكون هناك حاجة الأمثل الشخصية للحصول على تلطيخ الأمثل.

  1. بسبب تصاعد وسائل الإعلام (انظر الجدول) ليست غير قابلة للامتزاج مع الماء، ويذوى الشرائح من خلال درجات متزايدة من الكحول (2 دقيقة لكل منهما في 70٪، 95٪، و 100٪ من الإيثانول) واضحة لهم مع الزيلين (100٪ لمدة 5 دقائق) لضمان الشرائح لا تصبح مبهمة مع مرور الوقت.
  2. ساترة الأقسام والسماح لهم الجافة. صورة مع المجهر مجهزة برامج التصوير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويمكن رؤية مجموعة المتابعة للحصاد وتجميد الأنسجة في الشكل 1. يجب أن يتم تخزين الأنسجة رفعه على الشاش غارقة في برنامج تلفزيوني لتجنب تجفيف (الشكل 1A). عندما يتم اختيار الأنسجة ليتم استخدامها للتحليل النسيجي ينبغي أن تراجع في أكتوبر وضعت على البرد العفن في الاتجاه الصحيح وأقرب إلى طول الفسيولوجية ممكن لضمان التشكل دقيقة (الشكل 1B). لا يمكن أن يتحقق من الطين isopentane مناسبة لتجميد الأنسجة عن طريق isopentane التبريد في النيتروجين ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد استخدمت الأنسجة والمناعية كأدوات رئيسية في فهم مظاهر وتطور علم الأمراض في مختلف الاضطرابات العصبية والعضلية. تقليديا، كانت ثابتة الخزعات العضلية لأول مرة في الفورمالديهايد ثم جزءا لا يتجزأ من شمع البرافين. في حين الفورمالديهايد تثبيت يحافظ على بنية الأنسجة ويسمح تخزين الأنسجة والنقل في RT، فإنه يعطل أيضا الإنزيمات والبروتينات crosslinks يستلزم مزيدا من الخطوات لتحقيق المناعية دقيقة. يتم التخلص من هذه المشكلة مع استخدام الأبواب المجمدة ولكن يعرض هذا الأسلوب تحديات تقنية فريدة م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نود أن نشكر أليكس ميلر على مراجعات المخطوطة. تم دعم هذا العمل من خلال المنح البحثية الممنوحة ل M.G. من Cure CMD و Fight Against Mascular Strophy (SAM) و Expcular Dystrophy Association (218938).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
CryostatLeica CM 1850Leica Microsystems Inc.بوفالو جروف ، إلينوي 60089 الولايات المتحدة الأمريكية ، هاتف المكتب 1-800-248-0123
البديل: ريتشارد ألين ساینتفيك
مجهرنيكون اكليبس 50iنيكون إنسترومنتس، إنك.1300 طريق والت ويتمان ، ميلفيل ، نيويورك 11747-3064 الولايات المتحدة الأمريكية ، الهاتف: 1-631-547-8500
البديل: أوليمبوس
برنامج تحليل الصوربرنامج التصوير نيكون البحوث الأساسيةنيكون إنسترومنتس، إنك.1300 طريق والت ويتمان ، ميلفيل ، نيويورك 11747-3064 ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الهاتف: 1-631-547-8500
البدائل: الصورة J ، التحول
إيزوفلوران14043-220-05دينار أردني القسم الطبي المحدود.1923 شارع ويست بيوريا ، فينيكس ، أريزونا 85029 الولايات المتحدة الأمريكية
أكتوبر4583شركة ساكوراTorrence، CA 90501 الولايات المتحدة الأمريكية
المصدر البديل: Leica Microsystem
قم بتجميدها23-022524Thermofisher790 Memorial Dr ، كامبريدج ، ماساتشوستس ، 02139 الولايات المتحدة الأمريكية
المصدر البديل: قالب
الأنسجة القابل للتصرفScientific 22-363-554Thermofisher790 Memorial Dr ، Cambridge ، MA 02139 الولايات المتحدة الأمريكية
المصدر البديل: VWR Scientific
Colorfrost plus slides9991001Thermofisher790 Memorial Dr ، Cambridge ، MA 02139 الولايات المتحدة الأمريكية
المصدر البديل: VWR Scientific
Acetone650501-4LSigma-Aldrich3050 Spruce Street ، سانت لويس ، MO 63103 الولايات المتحدة الأمريكية
المصدر البديل: VWR Scientific
Ethyl الكحولHC-1300-1GLThermofisher790 Memorial Dr ، كامبريدج ، ماساتشوستس 02139 الولايات المتحدة الأمريكية
المصدر البديل: VWR Scientific
2-ميثيل البوتانM 32631-SLسيجما ألدريتش3050 شارع التنوب ، سانت لويس ، ميزوري 63103 الولايات المتحدة الأمريكية
المصدر البديل: VWR Scientific
XyleneHC-7001GAThermofisher790 Memorial Dr ، Cambridge ، MA 02139 الولايات المتحدة الأمريكية
المصدر البديل: VWR Scientific
Cytoseal 2808311-4Thermofisher790 Memorial Dr ، كامبريدج ، ماساتشوستس 02139 الولايات المتحدة الأمريكية
المصدر البديل: VWR Scientific
Hematoxylin Gill # 3CS402-1DThermofisher790 Memorial Dr ، كامبريدج ، ماساتشوستس 02139 الولايات المتحدة الأمريكية
المصدر البديل: VWR Scientific
Eosin6766007Thermofisher790 Memorial Dr ، كامبريدج ، ماساتشوستس 02139 الولايات المتحدة الأمريكية
المصدر البديل: VWR Scientific
VWR

المراجع

  1. Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
  2. Caughey, J. E., Pachomov, N. The diaphragm in dystrophia myotonica. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).
  3. Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings. AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).
  4. Platzer, A. C., Chase, W. H. Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy. The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).
  5. Mercuri, E., et al. Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine. Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).
  6. Tasca, G., et al. Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles. PloS one. 7, e38779(2012).
  7. Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy. The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).
  8. Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A. Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).
  9. Mehuron, T., et al. Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy. Skeletal muscle. 4, 14(2014).
  10. Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A. Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).
  11. Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy. Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).
  12. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).
  13. Maccarty, W. C. The Diagnostic Reliability of Frozen Sections. The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).
  14. Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).
  15. Turan, T., et al. Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

OCT
ما يفعل وما يترك في إعداد العضلات Cryosections للتحليل النسيجي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.