Method Article

تتبع التغييرات الناجمة عن المخدرات في مستقبلات بعد استيعاب الاتجار عن طريق تحليل Colocalizational

DOI:

10.3791/52824

⸱

July 3rd, 2015

 , 
1Department of Anesthesiology and Perioperative Care, University of California Irvine, 2Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 3Department of Pharmacology, University of California Irvine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاتجار مستقبلات الإشارات وينظم الخلايا على الاستجابة للجين وهو، في حد ذاته، استجابة لظروف الخلية، بما في ذلك الناجم عن يجند الإشارات. هنا، نحن تصف تقنية قوية ومرنة لتقييم كمي الاتجار مستقبلات المخدرات التي يسببها استخدام immunolabeling وتحليل colocalizational.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إن تهريب المستقبلات داخل الخلايا عبارة عن مجموعة من العمليات المعقدة وشديدة الخاضعة للرقابة. يعدل الاتجار بالمستقبلات الإشارات والاستجابة الإجمالية للخلية للروابط ويتأثر بحد ذاته بالظروف داخل الخلية وخارجها ، بما في ذلك الإشارات التي يسببها الترابط. يستخدم هذا البروتوكول ، المحسن للاستخدام مع الخلايا المستنبتة أحادية الطبقة ، ولكن يمكن تمديده إلى شرائح الأنسجة العائمة بحرية ، وضع العلامات المناعية والتحليل المشترك لتتبع التغيرات في تهريب المستقبلات داخل الخلايا بعد كل من التدخلات المزمنة / المطولة والحادة ، بما في ذلك العلاج بالعقاقير الخارجية. بعد العلاج بالعقاقير ، يتم تمييز الخلايا بمناعة مزدوجة للمستقبل وعلامات الأجزاء داخل الخلايا ذات الأهمية. ثم يتم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر المتسلسل لالتقاط صور مجهرية ثنائية القناة للخلايا الفردية ، والتي تخضع لتحليل محلي محوسب للحصول على درجات تحديد الموقع الكمي. يتم تطبيع هذه الدرجات للسماح بتجميع التكرارات المستقلة قبل التحليل الإحصائي. يمكن أيضا معالجة الصور المجهرية التمثيلية لتوليد أرقام توضيحية. هنا ، نصف تقنية قوية ومرنة لتقييم الاتجار المستحث بالمستقبلات كميا.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المستقبلات، خصوصا G البروتين إلى جانب مستقبلات (GPCRs)، يتم تهريب روتينية داخل الخلية، من وإلى سطح الخلية 1. هذه العمليات المدبرة التعقيد وتفرض رقابة مشددة يكمل مستقبلات المتاحة الخلايا وتنظيم النشاط مستقبلات الزمني، الحساسية، وresensitization 2-4. الأهم من ذلك، هذه العمليات التي تستجيب لبيئات الخلوية بما في ذلك نشاط مستقبلات المخدرات التي يسببها أو الخمول. وهذا هو، لا يمكن للأعمال بروابط في مستقبلات يغير الاتجار داخل الخلايا من تلك المستقبلات، وبالتالي تغيير استجابة الخلية. على هذا النحو، تمارس بروابط خارجية حتى الآن أكثر الآثار على وظيفة الخلية، وحتى أبعد الكلاسيكية رسول إلى المستجيب شلالات 5،6.

دراسة مثل هذه التغييرات في الاتجار مستقبلات يسببها أمر صعب. تتضمن كل التقنيات المتاحة القيود. وقد استخدمت المقايسات حماية البيوتين إلى مونيتور مستقبلات سطح السكان. والبيروكسيديز هذه المستقبلات ويتم تنفيذ timecourse من immunoprecipitations لقياس انخفاض مستقبلات المعقدة البيروكسيديز مع مرور الوقت. هذه التقنية ترصد أساسا تدهور تدريجي من الأولي، وصفت والسكان مستقبلات 7، ومفيد جدا في بناء دورات الزمني لهذه العملية. للأسف، هذا الاختبار غير قادر على رصد أي عملية أخرى من تدهور تجمع الأصلي من المستقبلات، مثل استيعاب وإعادة التدوير، أو مستقبلات جديدة. أيضا، إضافة إلى الأجسام المضادة في نطاق 150kDa إلى مستقبلات في نطاق 50kDa يمكن أن يغير الاتجار مستقبلات في 8،9، ويمكن أن يكون من الصعب استخدام مع مستقبلات منخفضة على مستوى التعبير هذه التقنية.

استخدام الإجراءات غيرها من وسائل مختلفة لتحديد الأجزاء الاتجار داخل الخلايا (على سبيل المثال، الإندوسومات، الخ)، وتقييم colocalization مع مستقبلات الفائدة. وهذا يشمل الولايات المتحدة(ه) من أنظمة مغاير معربا عن الفلورسنت البروتين الموسومة يبني خيالية من المستقبلات وعلامات مقصورة (GTPases على سبيل المثال، رب الأسرة). هذا يحتمل أن يتيح استخدام التصوير الخلية الحية، وإزالة القضايا المتعلقة تثبيت وpermeabilization. في حين قوية، تعاني هذه الاستراتيجية من نفس القيود المفروضة على أنظمة مغاير بشكل عام: العلامة ومستوى التعبير الآثار المترتبة على الاتجار السلوك وعدم التوافق مع أنواع الخلايا أكثر تمثيلا من الناحية الفسيولوجية. أكثر شعبيا، وتستخدم الأصباغ لتسمية بسهولة حجرات داخل الخلايا (مثل الجسيمات الحالة، ظاهريا) 10. الأصباغ، ومع ذلك، يمكن تفتقر إلى الدقة (جميع العضيات الحمضية في حالة من الأصباغ لالجسيمات الحالة) وليس لتقييم الاتجار بالبشر من خلال المقصورات الأخرى. ومع ذلك، هذه التقنيات تتيح سيطرة كبيرة على النظام والظروف التجريبية، ويمكن الاستفادة من طرق التحليل colocalization المقدمة هنا أدناه.

طريقة ثالبريد الحاضرين هنا تهذب تتبع الاتجار مستقبلات التي كتبها colocalization. باستخدام مناعية (ICC) لتسمية علامات المناسبة، فمن الممكن تحديد عدة حجرات داخل الخلايا متميزة. هذا أيضا يسمح باستخدام زراعة الخلايا الأولية من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة في مكان نظم مغاير. ويشمل هذا البروتوكول ICC تحديد خلايا الفائدة قبل وضع العلامات. هذا يسمح وضع العلامات في timepoint المحددة التالية العلاج من تعاطي المخدرات (ق). وهذا ينتج عنه 'لقطة' من الجمعيات مستقبلات مقصورة العالمية في ذلك timepoint. مع timepoints متعددة، timecourse التغيرات الاتجار يمكن أيضا أن يتم بناؤها.

لفترة وجيزة، والخلايا هي المخدرات المعالجة، وصفت لمستقبلات وحجرة داخل الخلايا من الفائدة، تصوير confocally، ويتم تحليل photomicrographs لتحديد رياضيا colocalization من مستقبلات والمقصورة 11. في استخدامنا، درسنا colocalization من مستقبلات مع رعB5، Rab11، والليزوزومية المرتبطة بروتين الغشاء 1 (LAMP1). هذه علامات تحديد الإندوسومات في وقت مبكر، الإندوسومات إعادة التدوير، والجسيمات الحالة، على التوالي. تعمل هذه التدابير colocalization كوكلاء للعمليات الشاملة للاستيعاب، وإعادة التدوير، وتدهور 12.

كما هو الحال مع جميع التقنيات، وينبغي النظر في بعض القيود. نظرا للحاجة إلى صورة حللت كل الخلايا العصبية الفردية، ويمكن هذا الأسلوب أصبح جدا كثيفة العمالة وفقا لعدد من الشروط وtimepoints المعنية. يجب على جميع immunolabeling أيضا يتعامل مع الآثار المترتبة على التركيب الدقيق الخلوية، وبروتين التعريب، وحاتمة الوصول الناجمة عن التثبيت وpermeabilization 13.

على الرغم الأمثل أصلا للاستخدام مع الثقافات الأولية من الخلايا العصبية الحسية الأولية، وهذا الأسلوب هو متوافق على نطاق واسع مع غيرها من نماذج الثقافة مطلي أحادي الطبقة.

استخدام قياس آثافة كميا رياضيا(ه) من colocalization هو، ولا سيما، أكثر بكثير منهجيا دقيقا من التقنيات السابقة المستخدمة لتقييم التغيرات الاتجار مستقبلات، والتي غالبا ما تعتمد على وتدابير غامضة غير موضوعية مثل تفقد البصر تراكب متعدد القنوات (14).

هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للتوافق واسع مع التدخلات في الجسم الحي (قبل جيل ثقافة الأساسي)، في المختبر التدخلات (خلال نمو ثقافة)، ومختلف العلامات تستهدف 15. على هذا النحو، فإنه يمكن تكييفها للعديد من الأسئلة البحثية المختلفة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: هذا البروتوكول هو متوافق على نطاق واسع مع مختلف النماذج مطلي أحادي الطبقة خلية / زراعة الأنسجة، نظم العلاج من تعاطي المخدرات، وأهداف وصفها. وهكذا في الاستخدام الفعلي، سوف تختلف بناء العديد من المعالم المحددة على التصميم التجريبي. هنا، يشير إلى هذه المعايير المعرفة هي عامة. شروط سبيل المثال، كما تستخدم للحصول على النتائج التمثيلية، وترد بخط مائل.

1. حلول

  1. يعد غسل العازلة عن طريق خلط 0.1M تريس مخزنة مفرط التوتر (300 ملم) المالحة و 0.05٪ بوليسوربات 20؛ الرقم الهيدروجيني 7.4 في RT.
  2. إعداد عازلة تمنع. إلى 0.05 M تريس مخزنة مفرط التوتر (300 ملم) المالحة إضافة 0.05٪ بوليسوربات 20، 3٪ مصل بقري الزلال (BSA) و 0.1٪ الأسماك الباردة الجيلاتين الجلد وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 في RT.
  3. إعداد الأجسام المضادة مخفف بإضافة 0.05٪ بوليسوربات 20، 1٪ BSA، 0.1٪ الأسماك الباردة الجيلاتين الجلد إلى 0.05 M تريس مخزنة مفرط التوتر (300 ملم) الملحية وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: الرقم الهيدروجيني للمخازن تريس هي التي تعتمد على درجة الحرارة. هذا هو، وتغير في درجة الحرارة تغيير الرقم الهيدروجيني للمحلول. من أجل التناسق، وينبغي أن تكون هذه المخازن دائما تعديل درجة الحموضة، في درجة الحرارة التي سيتم استخدامها.

2. خلية ثقافة

ملاحظة: تختلف البروتوكولات ثقافة الخلية المناسبة استنادا إلى نوع من الخلايا (ق) المستخدمة. يجب أن يكون الأمثل هذه الإجراءات بشكل منفصل. ومنهجيات زراعة الخلايا مفصلة متاحة بسهولة، بما في ذلك 16. تم استخدام إجراء مماثل للحصول على النتائج التمثيلية، مع اختلافات ملحوظة:

  1. ثقافة الظهرية الخلايا العصبية العقد الجذرية من الحيوانات الكبار كما وصفها 12. استخدام الكبار الخلايا العصبية المتوسطة النمو للثقافة الخلايا. تقليل كثافة الخلايا الدبقية التي كتبها preplating، بدلا من الغلوتامات. هذه النتائج في ثقافة العصبية الدبقية مختلطة نمت على coverslips الزجاج 12 جولة مع لا يقل عن 30-60 الخلايا العصبية في لوحة والمرافق الخلايا الدبقية نمت لapproximatاعل 40٪ confluency. تجدر الإشارة إلى أن الخلايا العصبية في ثقافة الأولية لن تكرر وسيتم دفع الخروج من لوحة كل مثقف شارك الدبقية إذا سمح الدبقية أن تنمو بشكل مفرط. من أجل تجنب التأثير على الخلايا العصبية، والحد المادي للأرقام الدبقية أفضل من الطرق الدوائية الكيميائية /.
    ملاحظة: لأغراض هذا البروتوكول، ونحن نفترض أن خلايا الفائدة تزرع لالمرجوة منها تجريبيا للدولة ومطلي أحادي الطبقة. نجد أن الطلاء على coverslips الزجاج 12 جولة في 24 لوحات جيدا ليكون الأكثر ملاءمة. كافة وحدات التخزين والإجراءات الموضحة مناسبة للساترة واحد في بئر واحدة من 24 لوحة جيدا.

3. العلاج من تعاطي المخدرات من الخلايا المستزرعة

ملاحظة: متتابعة متعددة، أو تداخل، العلاج بالعقاقير ممكنة. العقاقير، جرعات / تركيزات، وفترات التعرض المستخدمة سيعتمد على تجربة محددة.

  1. إزالة المتوسطة النمو الأصلي 16 واستبدالها المتوسط ​​تحتوي على المخدرات (ق) من الفائدة في تركيز المختار (ق). في هذه الحالة، استخدم 10 ميكرومتر من المورفين solubilized في المياه المالحة أو استخدام المياه المالحة عن السيطرة.
    ملاحظة: من المهم أن كل تكرار المستقلة (عموما ثقافة وحة 24 بئر واحدة) تحتوي على نفس حالة سيطرة مشتركة. هذا سوف يسمح تطبيع البيانات عبر مكررات، الذي يصحح للتقلب بين المحاكمة.
  2. احتضان الخلايا في ظروف النمو الأصلية 16 لمدة 48 ساعة.
  3. لعلاج المخدرات اللاحقة، كرر الخطوات من 3.1 و 3.2 مع Deltorphin 1 ميكرومتر، SNC80 1 ميكرومتر، أو مركبة واحتضان لمدة 60 دقيقة 12. إذابة deltorphin II في الماء وإذابة SNC80 في 10 ملي في 40 ميكرومتر حمض الهيدروكلوريك ويصوتن، المخفف إلى 1 مم في الماء.
    ملاحظة: هذا البروتوكول يفترض المخدرات (ق) قد تم solubilized بحيث أنها يمكن حله في تركيز المطلوب (ق) في وسط النمو الذي تم اختياره. الإجراءات المناسبة لوتختلف هذه الإذابة اعتمادا على المخدرات في مسألة ويجب أن يكون الأمثل على حدة.
  4. غسل الخلايا بلطف، ثلاث مرات، مع ~ 1 مل من غسل العازلة في غسل. تنفيذ كل غسل بلطف بواسطة الشفط السائل من البئر، ثم على الفور، وبلطف، وإعادة تعبئة بشكل جيد مع حل جديد، كما هو مطلوب (في هذه الحالة مع غسل العازلة).

4. التثبيت وسيتولوجية مناعية

ملاحظة: سوف يستهدف وضع العلامات المحددة تختلف من التجربة. في الاستخدام لدينا، وصفت دلتا مستقبلات المواد الأفيونية (DOR) وRab5، راب 11، وLAMP1، كما تمت مناقشته. الأجسام المضادة المحددة المستخدمة سيعتمد على تجربة محددة. شروط وضع العلامات المثلى تعتمد على الأجسام المضادة المحددة (المنشأ) المستخدمة. مناقشة أشمل بكثير من هذا الموضوع أدناه.

  1. إصلاح الخلايا عن طريق الغمر في ~ 300 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ في 0.1 M الفوسفات مخزنة المالحة لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: من المهم أن الفقرة 4٪الفورمالديهايد أن طازجة نظرا لتألق ذاتي الناجمة عن استخدام امتصاص العرق سابقا المجمدة.
  2. غسل الخلايا برفق، 3 مرات، مع ~ 1 مل من غسل العازلة في غسل، كما هو موضح في 3.3.
  3. احتضان الخلايا في 300 ميكرولتر العازلة حظر لمدة 2 ساعة على RT.
  4. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية في 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة مخفف لمدة 48 ساعة على 4 درجات مئوية. في استخدامنا، الأجسام المضادة الأولية ضد DOR (أرنب مكافحة DOR) واحدة من: Rab5 (الماوس مكافحة Rab5)، راب 11 (الماوس مكافحة Rab11)، وLAMP1 (الماعز المضادة للLAMP1).
  5. غسل الخلايا بلطف، ثلاث مرات، مع ~ 1 مل من غسل العازلة في غسل، كما هو موضح في 3.3.
  6. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق fluorophores مختلفة (انظر المناقشة أدناه) في 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة مخفف لمدة 1 ساعة على RT. في هذا، وجميع الخطوات اللاحقة، وحماية الخلايا من الضوء. للحصول على نتائج ممثلة، استخدم الخضراء التي ينبعث منها fluorophore مترافق المضادة للأرنب وإييثإيه انبعاث الأحمر-fluorophore مترافق المضادة للماوس أو انبعاث الأحمر-fluorophore مترافق مكافحة الماعز.
  7. غسل الخلايا برفق، 3 مرات، مع ~ 1 مل من غسل العازلة في غسل، كما هو موضح في 3.3.
  8. إزالة لل coverslips 12 جولة من 24 لوحات جيدة من خلال ترك ~ 1 مل من غسل العازلة في كل بئر، وعقد لوحة في ~ 45º، ورافعة ساترة من خارج الأرض جيدا باستخدام ملقط غرامة. وساترة يأتي للراحة ضد الجدار جيدا، من حيث أنه يمكن بسهولة إزالة باستخدام ملقط.
  9. جبل لل coverslips، خلية جنبا إلى أسفل، على المجهر الشرائح مع anti-يتلاشى تصاعد المتوسط.

5. إعدادات المجهر

  1. باستخدام الهدف تضخم عالية (100X)، حدد موقع أول خلية التمثيلية للتصوير باستخدام epifluorescence.
  2. تكوين إعدادات التقاط صورة لتسجيل 8 بت صور TIFF مضغوط من كل قناة المسمى (للكشف عن كل fluorophore المستخدمة على سبيل المثال، 488 نانومتر و 594 نانومتر)، لصورة كل بالتتابع قناة (إما عن طريق الإنترنت أو الإطار)، ومتوسط ​​4-6 مسح للصورة النهائية. ودقة وضوح الصورة الأمثل هو المجهر محددة، ولكن 1024 x 1024 عادة ما تعطي نتائج جيدة.
  3. التبديل إلى طريق التصوير متحد البؤر والتركيز على ض الطائرة من خلال مركز الخلية.
  4. تحسين الثقب (عادة 1 وحدة إيري)، قوة الليزر، وأنبوب مضخم الجهد (ربح) وتعويض لكل قناة. حفظ / تسجيل هذه الإعدادات. استخدام الإعدادات المجهر نفسها لتصوير كل الخلايا المسمى لأي زوج هدف معين في نفس تكرار.
    ملاحظة: هذه العملية سوف تؤدي عادة في photobleaching من كافية على أن هذه الخلية لا ينبغي أن تصوير لتحليلها.

6. التصوير

  1. باستخدام الهدف تضخم عالية (على سبيل المثال، 100X)، حدد موقع أول خلية للتصوير باستخدام epifluorescence.
  2. التبديل إلى طريق التصوير متحد البؤر والتركيز على ض الطائرة من خلال مركز الخلية. أناو متاح، واستخدام البرامج التكبير / المحاصيل لتقييد منطقة المسح الضوئي إلى الخلية من الفائدة.
  3. التقاط الصور لكل قناة المسمى باستخدام إعدادات إنشاء سابقا. كرر الخطوات من 6،1-6،3 لصورة 15 أو أكثر من الخلايا في حالة تكرار لكل لضمان عينة كافية.

7. تحليل Colocalization

  1. فتح زوج من الصور (على سبيل المثال، "الأخضر" و "الأحمر") من خلية في يماغيج. استخدام صورة> اللون> القنوات دمج ... الأمر لتوليد صورة RGB.
  2. رسم التحديد حول خلية من الفائدة. استخدام يماغيج المساعد "PSC Colocalization" (11؛ متاح من https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) لتحديد colocalization من الأهداف في الخلية المحددة.
  3. تسجيل التدبير colocalization المطلوب (عادة ص بيرسون 17). كرر الخطوات من 7،1-7،3 لكل خلية المصورة.

8. بيانات التطبيع

  1. حساب متوسط ​​القيم colocalization المسجلة للظروف سيطرة مشتركة من كل تكرار لكل حالة وصفها.
    ملاحظة: على سبيل المثال، متوسط ​​القيم colocalization من الخلايا العصبية في "السيارة لمدة 48 ساعة، 60-مين مركبة" حالة المخدرات في كل من 3 مكررات مستقلة في كل من 3 شروط وضع العلامات (مستقبلات وكل من 3 حجرات).
  2. مضاعفة الوسائل التي كتبها (-1) لانتاج الإزاحة لكل تكرار في كل حالة وصفها. إضافة الإزاحة لكل تكرار في كل حالة وضع العلامات على كل قيمة colocalization في ذلك تكرار.
    ملاحظة: هذا تطبيع البيانات مثل أن متوسط ​​قياس colocalization لحالة سيطرة مشتركة هو 0 في كل تكرار لكل حالة وصفها.
  3. تجميع البيانات من جميع مكررات لكل حالة وصفها.
    ملاحظة: يمكن الآن تحليل التغييرات في colocalization عبر مكررات. الشرج الإحصائيسوف يسيس تعتمد على التصميم التجريبي ولكن عادة ما تتضمن تحليل-التباين (ANOVA)، يليه الاختبارات المناسبة بعد خاصة (على سبيل المثال، توكي). على الموارد الإحصائية، انظر على سبيل المثال، 18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام هذه التقنية، فمن الممكن لقياس التغيرات في مستقبلات الاتجار بعد استيعاب التالية كلا المزمنة / لفترات طويلة وحادة العلاج بالعقاقير. بعد العلاج بالعقاقير، التثبيت، ووضع العلامات، ويتم التقاط عالية الدقة photomicrographs ثنائي القناة من كل خلية من الفائدة. ويمكن الجمع بين صور تمثيلية مع كاذبة اللون colocalization لتوليد الأرقام توضيحية (الشكل 1). تحليل colocalizational لاحق، كما وصفها، تسفر عن عشرات الكمية من colocalization المستهدفة الهدف (على سبيل المثا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد الأمثل هذا البروتوكول لتحليل الثقافات الأولية من الكبار الخلايا العصبية عقدة الجذر الظهري (الخلايا العصبية الحسية الأولية). ويمكن أيضا أن تستخدم، مع تعديل طفيف أو لا، لالخلايا المستزرعة مطلي أحادي الطبقة على نطاق واسع. تحليل colocalizational من الممكن أيضا في شرائح الأنسجة والاستعدادات أخرى من هذا القبيل 11، ومع ذلك فإن مكونات العلاج من تعاطي المخدرات وتثبيت الأنسجة / إعداد لا يكون مناسبا.

من الفائ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من خلال منحة من CIHR (MOP394808) وكرسي أبحاث كندا لCMCEWO كان المستفيد من منحة الدراسات العليا من NSERC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Trizma BaseSigma AldrichT1503-500G
كلوريد الصوديومSigma AldrichS9888-500G
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
حمض الهيدروكلوريكSigma Aldrich258148
الألبومين من مصل الأبقارSigma AldrichA7906-100G
الجيلاتين من أسماك الماء البارد الجلدسيجما ألدريتشG7041-100G
لوحات زراعة خلايا كورنينج كوستار: 24 بئرفيشر ساينتفيك720084
12 غطاء مجهر دائريزجاج فيشر ساینتفيك1254580
أكوا / بولي ماونتبولي ساينسز18606-20
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدةسيجما ألدريتشS9638-500G
الصوديوم الفوسفات ثنائي القاعدةسيجما ألدريتشS9763-500G
بارافورمالدهيدPolysciences00380-1
Dumont # 5 ملقط - أدوات العلوم الدقيقة القياسية / Dumoxel11251-30
الأرانب المضادة للجسم المضاد ل DORMyBioSourceMBS316175مستخدم في 1: 1،500
الفأر المضاد للجسم المضاد Rab5Sigma AldrichR7904مستخدم في 1: 750
الفأر المضاد للجسم المضاد Rab11Millipore05-853المستخدم في 1: 500
الماعز المضاد للجسم المضاد LAMP1سانتا كروزSC8098مستخدم في 1: 750
الحمار المضاد للأرانب Alexa 488 الجسم المضاد المترافقLife TechnologiesA-21206مستخدم في 1: 200 إلى 1: 2,000
الماعز المضاد للفأر Alexa 594 الجسم المضاد المترافقLife TechnologiesA-11005يستخدم في 1: 200 إلى 1: 2،000
الحمار المضاد للماعز Alexa 594 الأجسام المضادة المترافقةLife TechnologiesA-11058مستخدم في 1: 200 إلى 1: 2,000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Trafficking of G protein-coupled receptors. Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).
  2. Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).
  3. Hislop, J. N., von Zastrow, M. Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors. Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).
  4. Nagi, K., Piñeyro, G. Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance. Mol. Brain. 4 (1), 25(2011).
  5. Whistler, J. L., Enquist, J., et al. Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors. Science. 297 (5581), 615-620 (2002).
  6. Von Zastrow, M. Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications. Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).
  7. Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. Heteromerization of the µ- and δ-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters µ-receptor trafficking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).
  8. Wang, H. -B., Guan, J. -S., Bao, L., Zhang, X. Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells. Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).
  9. Scherrer, G., Tryoen-Tóth, P., et al. Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).
  10. He, S. -Q., Zhang, Z. -N., et al. Facilitation of µ-opioid receptor activity by preventing δ-opioid receptor-mediated codegradation. Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).
  11. French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells. Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).
  12. Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. Prolonged morphine treatment alters δ opioid receptor post-internalization trafficking. Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).
  13. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
  14. Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).
  15. Gupta, A., Mulder, J., et al. Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration. Sci. Signal. 3 (131), ra54(2010).
  16. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).
  17. Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
  18. Field, A., Miles, J., Field, Z. Discovering Statistics Using R. , SAGE Publications. Los Angeles, CA. (2012).
  19. Mattioli, T. -A. M., Milne, B., Cahill, C. M. Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats. Mol. Pain. 6, 22(2010).
  20. Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).
  21. The Molecular Probes Handbook. Johnson, I., Spence, M. , Life Technologies. Carlsbad, CA. (2010).
  22. Morris, T. J., Stanley, E. F. A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies. J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).
  23. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , Springer. New York, NY. (2006).
  24. North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  25. Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Receptor TraffickingColocalization AnalysisConfocal MicroscopyDrug TreatmentImmunolabelingIntracellular CompartmentsQuantitative AnalysisSequential ImagingDelta Opioid ReceptorRecycling Endosomes

Related Articles