تتبع التغييرات الناجمة عن المخدرات في مستقبلات بعد استيعاب الاتجار عن طريق تحليل Colocalizational

Edmund Ong; Catherine Cahill

doi:10.3791/52824

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تتبع التغييرات الناجمة عن المخدرات في مستقبلات بعد استيعاب الاتجار عن طريق تحليل Colocalizational

8.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52824

⸱

يوليو 3, 2015

Edmund Ong¹^,² , Catherine Cahill¹^,²^,³

¹Department of Anesthesiology and Perioperative Care, University of California Irvine, ²Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, ³Department of Pharmacology, University of California Irvine

في هذه المقالة

ملخص

الاتجار مستقبلات الإشارات وينظم الخلايا على الاستجابة للجين وهو، في حد ذاته، استجابة لظروف الخلية، بما في ذلك الناجم عن يجند الإشارات. هنا، نحن تصف تقنية قوية ومرنة لتقييم كمي الاتجار مستقبلات المخدرات التي يسببها استخدام immunolabeling وتحليل colocalizational.

الملخص

إن تهريب المستقبلات داخل الخلايا عبارة عن مجموعة من العمليات المعقدة وشديدة الخاضعة للرقابة. يعدل الاتجار بالمستقبلات الإشارات والاستجابة الإجمالية للخلية للروابط ويتأثر بحد ذاته بالظروف داخل الخلية وخارجها ، بما في ذلك الإشارات التي يسببها الترابط. يستخدم هذا البروتوكول ، المحسن للاستخدام مع الخلايا المستنبتة أحادية الطبقة ، ولكن يمكن تمديده إلى شرائح الأنسجة العائمة بحرية ، وضع العلامات المناعية والتحليل المشترك لتتبع التغيرات في تهريب المستقبلات داخل الخلايا بعد كل من التدخلات المزمنة / المطولة والحادة ، بما في ذلك العلاج بالعقاقير الخارجية. بعد العلاج بالعقاقير ، يتم تمييز الخلايا بمناعة مزدوجة للمستقبل وعلامات الأجزاء داخل الخلايا ذات الأهمية. ثم يتم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر المتسلسل لالتقاط صور مجهرية ثنائية القناة للخلايا الفردية ، والتي تخضع لتحليل محلي محوسب للحصول على درجات تحديد الموقع الكمي. يتم تطبيع هذه الدرجات للسماح بتجميع التكرارات المستقلة قبل التحليل الإحصائي. يمكن أيضا معالجة الصور المجهرية التمثيلية لتوليد أرقام توضيحية. هنا ، نصف تقنية قوية ومرنة لتقييم الاتجار المستحث بالمستقبلات كميا.

المقدمة

المستقبلات، خصوصا G البروتين إلى جانب مستقبلات (GPCRs)، يتم تهريب روتينية داخل الخلية، من وإلى سطح الخلية ^1. هذه العمليات المدبرة التعقيد وتفرض رقابة مشددة يكمل مستقبلات المتاحة الخلايا وتنظيم النشاط مستقبلات الزمني، الحساسية، وresensitization ^2-4. الأهم من ذلك، هذه العمليات التي تستجيب لبيئات الخلوية بما في ذلك نشاط مستقبلات المخدرات التي يسببها أو الخمول. وهذا هو، لا يمكن للأعمال بروابط في مستقبلات يغير الاتجار داخل الخلايا من تلك المستقبلات، وبالتالي تغيير استجابة الخلية. على هذا النحو، تمارس بروابط خارجية حتى الآن أكثر الآثار على وظيفة الخلية، وحتى أبعد الكلاسيكية رسول إلى المستجيب شلالات ^5،6.