يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

العزلة ونشر تعميم الخلايا السرطانية من ماوس السرطان نموذج

12.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52861

⸱

أكتوبر 9, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College of The City University of New York, 2Departments of Biology and Biochemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 3Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine, University of Florida

في هذه المقالة

ملخص

< p class = 'jove_content'> ثبت أن الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) تلعب دورا مهما في ورم خبيث للورم. هنا ، يتم وصف طريقة لعزل وانتشار الخلايا السرطانية من الدم الكامل لنموذج ورم الفأر المتزابقي لورم خبيث لسرطان الخلايا الكبدية (HCC).

الملخص

ورم خبيث للسرطان هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان. أظهرت الدراسات الحديثة أن الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) مهمة في ورم خبيث سرطاني. في الواقع ، يرتبط عدد CTCs بحجم الورم. هنا ، يتم تقديم وصف مفصل لمنهجية عزل وانتشار الخلايا السرطانية من نموذج فأر متجانس لسرطان الخلايا الكبدية (HCC) والذي يسمح بتحليل المصب للآليات الجزيئية المهمة المحتملة لرم خبيث في الأعضاء الصلبة. هذه الطريقة فعالة وقابلة للتكرار. إنها تقنية غير جراحية ، وبالتالي ، لديها القدرة على استبدال الخزعة الغازية للأنسجة من البشر والتي قد تترافق مع مضاعفات. لذلك ، تسمح الطريقة التي تمت مناقشتها هنا بعزل وانتشار الخلايا السرطانية من عينات الدم الكاملة بحيث يمكن فحصها وتوصيفها. هذا لديه إمكانية للتكيف المستقبلي للتطبيقات السريرية مثل التشخيص والعلاج الموجه الشخصي.

المقدمة

عرف مجتمع أبحاث السرطان بوجود خلايا سرطانية منتشرة (CTCs) منذ أن لاحظه توماس أشوورث لأول مرة في عام 18691. منذ ذلك الحين ، ثبت أن الخلايا السرطانية السرطانية مهمة في ورم خبيث للورم وتطورالمرض 2-5. اليوم ، تعد الأورام الصلبة سببا رئيسيا للمراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. الخلايا السرطانية هي خلايا نادرة تنشأ من أورام أولية وتنتقل عبر مجرى الدم إلى أعضاء مختلفة يتطور جزء صغير منها في النهاية إلى ورم خبيث2-5. والجدير بالذكر أن هناك علاقة إيجابية بين حجم الورم ورقم CTC3،4.

يمكن أن يساهم فهم بيولوجيا CTC في البحث عن العلاج الموجه. علاوة على ذلك ، قد يكون لمراكز التحكم في الدم تطبيقات تشخيصية. لتحقيق هذه التطبيقات السريرية المحتملة ، يحتاج المرء إلى التغلب على بعض التحديات الحالية لدراسة CTCs. يرتبط أحد التحديات بحقيقة أن الخلايا السرطانية قد تكون موجودة كخلايا مفردة أو كمجموعات وقد تكون قادرة على تغيير نمطها الظاهري استجابة للبيئة الدقيقة للدم2. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون الكشف صعبا للغاية ، ويرجع ذلك جزئيا إلى انخفاض عدد الخلايا السرطانية (من بضعة إلى مئات لكل ملليلتر) بين مليار خلايا دموية لكل مليلتر في الدم6. ومع ذلك ، في السنوات الأخيرة ، تكثف البحث في التطبيقات السريرية المحتملة ل CTCs من سرطانات الأعضاء الصلبة.

على الرغم من هذه الجهود، لا تزال تحديات دراسة وفهم دور اللجان الشاملة قائمة بسبب ندرة اللجان المحورية وعدم كفاية الأدوات التكنولوجية المتاحة حاليا. على الرغم من هذه التحديات ، لا تزال الإمكانات الهائلة للتطبيقات السريرية تشكل حافزا لمتابعة البحث في دور CTCs في ورم خبيث للسرطان.

لقد نجحنا مؤخرا في عزل ونشر CTCs في زراعة الخلايا من نموذج فأر متجاني تقويمي لورم خبيث لسرطان الخلايا الكبدية (HCC)5. الغرض من هذه الورقة هو وصف جميع جوانب المنهجية الناجحة بالتفصيل. تكمن أهمية هذه المنهجية في حقيقة أنه يمكن تعديل هذا النهج من أجل عزل ونشر الخلايا السرطانية البشرية بنجاح في المزرعة ، وبالتالي تعزيز إمكانية إجراء دراسات في المختبر لبيولوجيا CTC.

هناك العديد من التطبيقات السريرية المحتملة لاستخدام CTCs. قد تكون CTCs مفيدة للتشخيص ومراقبة الاستجابة والفحص والمراقبة الديناميكية للتغيرات الجزيئية للورم والعلاج الشخصي4. لذلك ، فإن الفهم الأفضل لبيولوجيا الخلايا السرطانية له إمكانات عالية للتأثير السريري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بيان الأخلاق: تمت الموافقة على جميع الدراسات على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من كلية هنتر في جامعة مدينة نيويورك.

1. إجراءات ما قبل التجربة

  1. ولدى وصوله إلى منشأة الحيوان، إيواء البداية 3 BALB / ج الفئران إلى قفص مع كبار ورقائق الخشب الفراش تصفيتها. تأكد من أن الفئران لديها حرية الوصول إلى المواد الغذائية، بورينا طعام القوارض والمياه. يجب تغيير الفراش والطعام مرتين في الأسبوع، بينما يجب تنظيف الأقفاص مرة واحدة في الأسبوع.
  2. حمل التخدير العام في الفئران باستخدام المرذاذ الأيزوفلورين جنبا إلى جنب مع الأكسجين بمعدل تدفق ثابت من 1 L لكل دقيقة. هذا النظام هو الاعتماد على الذات ويشمل المرذاذ الدقة.
  3. الحيوان الموقف في مربع من البلاستيك الذي يحتوي على المرذاذ الدقة والغاز / نظام مخدر لأنها مرتبطة. حددت في البداية المرذاذ إلى 2.5 حتى الحيوان فاقد الوعي، وعند هذه النقطة خفض المرذاذ إلى 2.
  4. في ذلك الوقت، والتبديلخط صمام، وختم على مربع وفتحه للمخروط الأنف.
  5. نقل الحيوان إلى منطقة التحضير، مع مخروط الأنف وضعها بشكل صحيح ومتصل (للتخدير الصيانة).
  6. إعداد 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 خلايا فأر HCC لزرع في الماوس. BNL 1ME A.7R.1 يجب نموا في المتوسط ​​(10٪ الحرارة المعطل FBS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و2 مم L-الجلوتامين) تفرخ في طبق زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع الهواء و5٪ CO 2.
  7. مع حقنة ذات إبرة 20 G، زرع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 خلايا فأر سرطان الكبد في الفص من كبد BALB / ج الفئران لإنتاج الأورام الأولية. بعد الزرع، منزل BALB / ج الفئران في قفص مع متطلبات المنزل بنفس ما قبل الزرع.
  8. في نقطة النهاية التجريبية، الأدلة السريرية لسرطان الكبد يمكن ملاحظته كما خفض كبير في حالة الجسمتسجيل (الكشف عن عادة بعد 4 أسابيع). عند هذه النقطة، هناك احتمال أن الأورام الأولية قد وضعت في الكبد بينما شكلت ودائع المنتشر في الرئتين. بعد ذلك، تبدأ عملية عزل ونشر تعميم الخلايا السرطانية.

2. جمع الدم الكامل للاعارة ورم عزل الخلايا

ملاحظة: تطهير الوجه الصحيح في منطقة الجراحة والتأكد من أنها خالية من الفوضى. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية أو نقع في مطهر وفقا لتوصية الشركة الصانعة

  1. التضحية الفئران عن طريق القتل الرحيم إنسانية في التجريبية نقطة النهاية (الأدلة السريرية التنمية ورم). Euthanization من الفئران ينبغي أن تشمل CO 2 الاختناق. مراقبة الفئران بشكل صحيح لتأكيد التخدير يتم توزيعها بشكل صحيح. ينبغي الإفراج عن ثاني أكسيد الكربون ببطء في الغرفة على مدى فترة من 5-10 دقيقة، مما تسبب في توقف التنفس. متابعة من قبل استنزاف داخل القلب وcervicآل التفكك. 5
  2. استخدام إبرة 25 G تعلق على حقنة 1 مل لجمع الدم الكامل. Heparanize الحقنة مع 0.01 مل الهيبارين. ثقب الجلد على الفور مع إبرة أقل شأنا من xyphisternum في حوالي 45 درجة زاوية. دفع الإبرة ببطء لثقب في القلب، ومن ثم خفض زاوية الإبرة. عقد على نحو مطرد الإبر والمحاقن في المكان، واستخلاص 500 ميكرولتر - 1000 ميكرولتر من الدم الكامل من القلب.
  3. إزالة المحاقن والإبر ونقل الدم إلى 1.5 مل خالية من مولد الحمى أنبوب المسمى مسبقا. أجهزة الطرد المركزي الدم كله تم جمعها في 1.5 مل خالية من مولد الحمى الأنبوب في 1167 x ج لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: الطرد المركزي يفصل عينة دم كاملة إلى ثلاث طبقات: الطبقة السفلية أو الهيماتوكريت تتكون من خلايا الدم الحمراء، وهي طبقة رقيقة المتوسطة من معطف الشهباء، وطبقة البلازما أعلى.
  4. إزالة البلازما بعناية من قبل pipetting وجمع مثل هذه المعلومات في أنبوب الحرة مولد الحمى 1.5 مل منفصل لفورثتجارب إيه مثل الكشف عن خالية من الخلايا الأحماض النووية 7.
  5. لعزل تعميم الخلايا السرطانية (CTCs)، وجمع معطف الشهباء إلى منفصل 1.5 مل خالية من مولد الحمى أنبوب استعدادا لخلايا الدم الحمراء (RBC) تحلل. وهذا أمر ضروري لإزالة كرات الدم الحمراء المتبقية في طبقة معطف الشهباء.

3. وصفة لخلايا الدم الحمراء (RBC) الاحتياطي تحلل

  1. جعل حل 1 L من RBC تحلل العازلة.
  2. جعل 500 مل من كلوريد الأمونيوم و 500 مل من تريس. ثم تخلط لإيجاد حل 1 L من RBC تحلل العازلة مع تركيز النهائي من 155 ملم من كلوريد الأمونيوم و 10 ملي تريس.
  3. العازلة الحل لدرجة الحموضة من 7.5. تخزين العازلة تحلل RBC في 2-8 درجة مئوية، وتقديمهم إلى RT مباشرة قبل الاستعمال.

4. RBC تحلل من معطف بافي

  1. إضافة 1 مل من RBC تحلل العازلة للخالية من مولد الحمى العقيمة 1.5 مل أنبوب يحتوي على معطف الشهباء التي تم جمعها.
  2. خلط محتويات الأنبوب بواسطةعكس عدة مرات. احتضان محتويات مختلطة من الأنبوب لمدة 5 دقائق على RT على مقاعد البدلاء. أجهزة الطرد المركزي محتويات المختلطة لمدة 5 دقائق في 1167 ز س.
  3. بعد الطرد المركزي، وسيتم الحصول على بيليه بيضاء. تجاهل طاف المحمر ببطء وبعناية في المبيض بنسبة 10٪ دون أي تعطيل لبيليه. إذا كان بيليه ليست بيضاء، وإعادة افعل الخطوات 3،1-3،5. زيادة فترة حضانة في RBC العازلة تحلل إلى 10-15 دقيقة قد يكون من المفيد أيضا.
  4. التخلص الآمن من النفايات البيولوجية مرة واحدة إزالة التلوث من النفايات البيولوجية في التبييض 10٪ كاملة بعد 24 ساعة.

5. نشر في خلية الثقافة

ملاحظة: الخلايا السرطانية يتم عادة بسرعة تنمو الخلايا خلايا الدم البيضاء التي تنتشر بكثرة في المزيج الأصلي الخلايا المزروعة في طبق. بعد التغيير المتكرر للمتوسطة، والممرات لاحقة من CTCs، تتم إزالة كافة خلايا الدم البيضاء ويبقى السكان نقية نسبيا من CTCs.

  1. بعدالتخلص من طاف في التبييض 10٪، وغسل بيليه بيضاء في 1 المالحة الفوسفات مخزنة مل (PBS) مرة واحدة على الأقل، وresuspend في كامل مستنبت للنشر في ثقافة الخلية.
  2. بمجرد الانتهاء من غسل، إضافة 1 مل من BNL 1ME مستنبت A.7R.1 (10٪ الحرارة المعطل FBS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و2mm و L-الجلوتامين) إلى بيليه و resuspend بيليه في مستنبت.
  3. البذور مزيج معلق للخلايا في طبق ثقافة الخلية. احتضان طبق زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع الهواء و 5٪ CO 2.
  4. تغيير خلية ثقافة المتوسط ​​كل 2-3 أيام. بعد 5-7 أيام، وسوف CTCs انضمت إلى الطبق زراعة الخلايا والتي المتكاثرة. ستبقى هذه الخلايا قابلة للحياة إلى ما بعد 25 الممرات وبعد تكرار تجميد والذوبان دورات 5.

6. التحقق من سرطان الكبد تداول ورم خط الخلية

  1. أداء ا ف بolymerase سلسلة من ردود الفعل (PCR) طريقة المستندة إلى تضخيم جزء DNA معين واحد فقط من الجين الماوس β-غلوبين للتأكد من أن الرواية أنشأت خطوط الخلايا CTC هي خلايا فأر مثل الأصلي زرع خط BNL 1ME A.7R.1 HCC. وقد وصفت في الأصل طريقة والتصديق عليها من قبل Steube وآخرون 5،8
  2. أداء المناعية للعنصر استجابة الكبدية محددة علامة مخيم البروتين مثل 3 3 (CREB3L3) ملزمة باستخدام الأجسام المضادة المحددة. وهذا يؤكد أن الرواية CTCs المنشأة هي في الواقع خلايا الكبد مثل زرع خط الخلية BNL 1ME A.7R.1 الأصلي. 5

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد أظهرت المنهجية الموضحة هنا أن CTCs يمكن عزل. الموت الرحيم كانت الفئران معاملة إنسانية في التجريبية نقطة النهاية. الكربون الاختناق عملية المشاركة ثاني أكسيد، استنزاف داخل القلب، وخلع عنق الرحم. ويوضح التخطيطي من الخطوات الرئيسية لهذا الإجراء في الشكل 2. تم تجهيز عينات الدم الكامل التي جمعتها استنزاف داخل القلب باستخدام بروتوكول المذكورة أعلاه. وبعد ذلك، تم استخدام الطرد المركزي لتحديد طبقة معطف الشهباء التي تعرضت للتحلل RBC. ثم أعقب ذلك خطوة ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة ، تم وصف كيفية عزل ونشر سرطانات الكربون السرطانية من الدم الكامل لفأر متزامن مع سرطان الكبد الهدف من هذا العمل هو تعزيز الدراسات الجارية لآليات ورم خبيث سرطاني.

أحد العوامل التي تساهم في سوء التشخيص للعديد من أنواع السرطان هو عدم الكشف في الوقت المناسب وما يترتب على ذلك من انتشار واسع النطاقللورم الخبيث 3. تنشأ الخلايا السرطانية السرطانية من السرطانات الأولية وتنتشر عبر مجرى الدم إلى الأعضاء البعيدة. على هذا النحو ، تعتبر CTCs مهمة في ورم خبيث السرطاني ولديها إمكانية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يتم دعم العمل في مختبر الدكتور أوغونوبي من خلال منحة برنامج مراكز الأبحاث في مؤسسات الأقليات من المعهد الوطني لصحة الأقليات والتفاوتات الصحية (MD007599) التابع للمعاهد الوطنية للصحة. محتويات هذه المخطوطة هي مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية ل NIMHD أو المعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
هيبارين ملح الصوديوم 1 جمVWR89508-852
BTX أنبوب مايكرو 1.5 مل Clear NSVWR89511-2541.5 مل & nbsp; أنابيب إبندورف خالية من البيروجين
إبرة معقمة ديسك 25 جم × 1 بوصةVWRBD30512525 جم طرف إبرة
SLP SRNG 1 مل 200 لكل عبوةVWRBD3096591 مل طرف حقنة
حقنة 1 مل Leur lok Pk 100VWRBD3096281 مل حقنة
VWR ملقط مناديل 6VWR82027-446ملقط
Cyromold intrm 15 × 15 × 5 مم PK 100VWR25608-924Cyromold
Cryo-oct compund 4 ozVWR25608-930أكتوبر مركب
VWR Slide sprfrst 25 × 75 مم PK72VWR48311-703شرائح
غطاء VWR زجاجي # 2 22 × 50 ممVWR48-382-128غطاء زجاجي
VWR منزلق مربع حقيقي شمال FM بوVWR89140-278صندوق الشرائح
سوبر HT PAP القلمVWR89427-058قلم PAP
الماء RNASe و DNAse الحري 2 لترVWR101454-204Nuclease Free Water
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 gVWR97061-796Tris Buffer
Ammonium Chloride ACS Grade 2 ، 5 كجمVWR97062-048من كلوريد الأمونيوم
60 × 15 مم طبق زراعة الأنسجة 353002 البوليسترينVWR
مبيض كلوركس مبيد للجراثيم ، عاديVWR89501-620كلوركس مبيض
PBS ، 1x (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) بدون كالسيوم ومغنيسيوم (500 مل)ثيرمو فيشر Scientific21-040-CVPBS ، 1x
DMEM, 1x  مع 4.5 جم / لتر جلوكوز و L-الجلوتامين بدون بيروفات الصوديومThermo Fischer Scientific10-017-CVDMEM 1x وسائط لخلايا BNL 1ME A.7R.1
مصل الأبقار الجنينيThermo Fischer Scientific35-010-CVFBS
Penicillin Streptomycin Solution ، 100xThermo Fischer Scientific30-002-ClPenicillin Streptomycin
Sorvall Biofuge picoThermo Fischer Scientific75002411جهاز طرد مركزي 13,000 دورة في الدقيقة
طبق ثقافة الأنسجة

المراجع

  1. Ashworth, T. R. A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death. Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).
  2. van de Stolpe, A., den Toonder, J. Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future. Cancers. 6, 1195-1207 (2014).
  3. Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).
  4. George, T. J., Ogunwobi, O. O., Sheng, W., Fan, Z. H., Liu, C. "Tissue is the issue": circulating tumor cells in pancreatic cancer. Journal of gastrointestinal cancer. , (2014).
  5. Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS one. 8, e63765(2013).
  6. Cheng, B., et al. Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture. International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).
  7. Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).
  8. Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction. Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).
  9. Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. Cancer micrometastases. Nature reviews. Clinical oncology. 6, 339-351 (2009).
  10. Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).
  11. Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).
  12. De Giorgi, U., et al. Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).
  13. Eloubeidi, M. A., et al. Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications. The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).
  14. O'Toole, D., et al. Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration. Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

العزلة ونشر تعميم الخلايا السرطانية من ماوس السرطان نموذج
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.