يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل الكريات البيضاء من واجهة الإنسان الأم والجنين

15.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52863

⸱

مايو 21, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Michigan, 3Department of Epidemiology and Biostatistics, Michigan State University, 4Department of Molecular Obstetrics and Genetics, Wayne State University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 6Department of Immunology and Microbiology, Wayne State University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

الموصوف هنا هو بروتوكول لعزل ودراسة الكريات البيض المتسللة للقرعة القاعدية و decidua parietalis - واجهة الأم والجنين البشرية. يحافظ هذا البروتوكول على سلامة علامات سطح الخلية وينتج خلايا قابلة للحياة كافية للتطبيقات النهائية كما ثبت من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي.

الملخص

يتميز الحمل عن طريق تسلل الكريات البيض في الأنسجة التناسلية وعلى واجهة الأم والجنين (القاعدي الساقط والساقط الجداري). هذه الواجهة هو الموقع التشريحي للاتصال بين الأم وأنسجة الجنين. وبالتالي، فإنه هو موقع المناعية للعمل خلال فترة الحمل. التسلل الكريات البيض في واجهة الأم والجنين دورا أساسيا في غرس والصيانة الحمل، وتوقيت التسليم. ولذلك، فإن الأوصاف المظهرية والوظيفية لهذه الكريات البيض توفر نظرة ثاقبة الآليات التي تؤدي إلى اضطرابات الحمل. وقد وصفت عدة بروتوكولات من أجل عزل التسلل الكريات البيض من القاعدي الساقط والجدارية الساقط. ومع ذلك، فإن عدم الاتساق في الكواشف، والإنزيمات، ومرات من الحضانة يجعل من الصعب مقارنة هذه النتائج. الموصوفة هنا هو نهج الرواية التي تجمع بين استخدام ديس الميكانيكية والأنزيمية لطيفتقنيات ociation للحفاظ على سلامة ونزاهة علامات خارج الخلية والخلايا في الكريات البيض معزولة عن الأنسجة البشرية في واجهة الأم والجنين. وبصرف النظر عن المناعي، زراعة الخلايا، والفرز الخلية، والتطبيقات المستقبلية من هذا البروتوكول عديدة ومتنوعة. بعد هذا البروتوكول، والكريات البيض معزولة يمكن استخدامها لتحديد الحامض النووي والتعبير عن الجينات المستهدفة، في وظائف المختبر الكريات البيض (أي البلعمة، سمية الخلايا وانتشار الخلايا التائية، واللدونة، وما إلى ذلك)، وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية في واجهة الأم والجنين. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام بروتوكول وصفها، لقد كان هذا المختبر قادرة على وصف الكريات البيض جديدة ونادرة في واجهة الأم والجنين.

المقدمة

يتميز الحمل عن طريق ثلاث مراحل متميزة المناعية: 1) غرس والمشيمة المبكرة المرتبطة استجابة الموالية للالتهابات (أي زرع يشبه "جرح مفتوح ')؛ 2) الثلث الثاني من الحمل وأكثر من الثلث الثالث من الحمل عندما يتم تحقيق توازن المناعة من خلال دولة في الغالب مضادة للالتهابات في واجهة الأم والجنين. و3) الولادة، دولة الموالية للالتهابات 1-7. الخلايا المناعية تلعب دورا هاما في تنظيم الاستجابة الالتهابية في واجهة الأم والجنين حيث وفرة والتغيير توطين طوال فترة الحمل 6-9.

في البشر، واجهة الأم والجنين تمثل مساحة الاتصال المباشر بين الأم (الساقط) والجنين (المشيمه أو الأرومة الغاذية) الأنسجة. هذه الواجهة تشمل ما يلي: 1) الجدارية والساقط الذي يبطن تجويف الرحم لم تتم تغطيتها عن طريق المشيمة وهي في تجاورلأجرد المشيمه. و2) القاعدي الساقط، وتقع في لوحة القاعدية من المشيمة حيث غزت من قبل trophoblasts فراغي 10 (الشكل 1). العلاقة الحميمة من هذه المناطق للاتصال تخلق الظروف لتعرض الجنين الأنتيجين إلى الأمهات الجهاز المناعي 11-13. ليس من المستغرب أن الكريات البيض يشكلون ما يقرب من 30-40٪ من الخلايا الساقطية 8،9،14،15 بالإضافة إلى خلايا انسجة من نوع نموذجية والخلايا الغدية 8،14،16. دور الكريات البيض في واجهة الأم والجنين يشمل العمليات المتعددة التي تشمل الحد من الأرومة الغاذية الغزو 17، وتدبير الشرايين دوامة 18،19، والحفاظ على التسامح الأمهات 12،20، والشروع في العمل 21-26. الكريات البيض من كل من التكيف وأطرافه الفطرية في الجهاز المناعي، أي خلايا T، الضامة، وقد تم تحديد العدلات، والخلايا B والخلايا الجذعية، والخلايا القاتلة الطبيعية، في الأنسجة الساقطية، وعلىوقد ثبت النسب وحالة التنشيط تختلف مكانيا وزمانيا طوال فترة الحمل 6-10،12،14،24،27-30. وترتبط اضطرابات في عدد الكريات البيض و / أو وظيفة مع الإجهاض العفوي 31، تسمم الحمل 32، وزن الولادة 32،33، والخدج العمل 7،24. ولذلك، فإن دراسة الصفات المظهرية وظيفة الكريات البيض في واجهة الأم والجنين البشري تسهيل توضيح من مسارات المناعية dysregulated في اضطرابات الحمل.

واحدة من أقوى الأدوات المستخدمة لتحديد النمط الظاهري وخصائص وظيفية من الكريات البيض والتدفق الخلوي والتكنولوجيا التي تسمح للتحليل الكمي للمعلمات متعددة في وقت واحد 34-36. لتحليل الكريات البيضاء التي التدفق الخلوي، مطلوب عزل الكريات البيض في تعليق وحيد الخلية. لذلك، وهي طريقة لفصل التسلل ليووهناك حاجة kocytes من واجهة الأم والجنين لدراسة المظهرية وخصائصها الوظيفية.

وقد وصفت عدة طرق لعزل الكريات البيض من واجهة الأم والجنين البشري 10،14،25،27،37-39. في حين أن بعض تطبيق تصنيف الميكانيكية 10،25،27،38، والبعض الآخر يستخدم الهضم الأنزيمي 37،40 لتفكك الأنسجة. لأن تفصيل الميكانيكية تنتج العائد أقل وانخفاض الجدوى 41، وتفارق الأنزيمية يمكن أن تؤثر على سلامة وسطح الخلية الاحتفاظ علامة 42، الأسلوب هو موضح هنا يجمع بين التفكك الميكانيكية لطيف مع الأنزيمية ما قبل المعالجة لزيادة الغلة من الكريات البيض معزولة دون المساس بقاء الخلية. وقد تجلى مزيج مماثل من الطرق لتكون فعالة في عزل الكريات البيض من أنسجة الساقطية في واجهة الأم والجنين 39. ولذلك، فإن بروتوكول الموصوفة هنا ينطوي ميكاتصنيف nical مع dissociator الأنسجة التلقائي الذي يزيد من الاتساق مع توفير الوقت والعمل بالمقارنة مع تنميق التقليدي مع معارضة المشارط، شفرات الحلاقة، أو مقص جراحي 10،28. كان الإنزيم الذي تم اختياره لتفكك النسيج Accutase. على عكس كولاجيناز تستخدم عادة 43، dispase 44، والتربسين 45، Accutase (حل مفرزة الخلية) يجمع بين بروتين العام وأنشطة حال الكولاجين التي تسهم في كفاءة تفارق بعد لطيف 46،47. بعد التفكك، وإثراء الكريات البيض من مجموع السكان من الخلايا الساقطية التي كتبها التدرج الكثافة الطرد المركزي. وقد وسائل الإعلام المختلفة الكثافة التدرج تستخدم في السابق، والأكثر شيوعا منها Percoll (تعليق جسيمات السيليكا الغروية) 48 و Ficoll (البوليمر من السكروز مع ارتفاع الوزن الجزيئي الاصطناعية) 49. وكانت كفاءة متفوقة من العزلة التي فرضها البوليمر السكروز previoأظهرت usly 50، والبروتوكول وصفها أيضا هنا يثبت أن هذه الوسائط التدرج الكثافة تنتج نقاء عالية بما فيه الكفاية من الكريات البيض وحيدات النوى.

وبالتالي، فإن بروتوكول الموصوفة هنا يجمع بين تصنيف الأنسجة الميكانيكية مع dissociator التلقائي الأنسجة، والهضم الأنزيمي مع حل مفرزة الخلية، وفصل الكريات البيض مع وسائل الإعلام التدرج الكثافة (1.077 + 0.001 غ / مل) لعزل الكريات البيض من أنسجة الساقطية الإنسان. وقد ثبت هذا البروتوكول للحفاظ على مستضدات سطح الخلية مع بقاء الخلية. الكريات البيض معزولة يمكن استخدامها لتطبيقات متعددة تشمل المناعي مع التدفق الخلوي والدراسات الفنية في المختبر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

هذا البروتوكول هو المناسب لالكريات البيض بمعزل عن القاعدي الساقط والجدارية الساقط استعدادا لالمناعي التدفق الخلوي. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا المعزولة يمكن استخدامها لفرز الخلايا، زراعة الخلايا، والعزلة RNA، وعلم الخلايا. قبل العمل مع العينات المشار إليها في هذا البروتوكول، يجب الحصول على الموافقة الأخلاقية الإنسان من لجنة أخلاقيات البحوث المحلية ومجالس المراجعة المؤسسية. تمت الموافقة على جمع واستخدام العينات البشرية لأغراض البحث من قبل مجالس المراجعة المؤسسية للمعهد الوطني يونيس كينيدي شرايفر لصحة الطفل والتنمية البشرية (معاهد الصحة القومية) والمعاهد الوطنية للصحة (NIH)، وزارة الصحة والخدمات البشرية (DHHS في بيثيسدا، MD، الولايات المتحدة الأمريكية) وجامعة ولاية واين (MI ديترويت، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على موافقة خطية من علم جميع النساء الحوامل قبل مجموعة من عينات الأنسجة.
ملاحظة: بينما كان يعمل مع دم الحيوانات، والخلايا، أو مخاطروكلاء الأوس كما هو مذكور في هذا البروتوكول، فمن الضروري أن السلامة الأحيائية المناسبة والإجراءات الواجب اتباعها سلامة المختبرات.

1. تشريح لساقطي الأنسجة البشرية

ملاحظة: لوحة القاعدية هي قاعدة تحت وتعلق على المشيمة وتمثل سطح الأمهات. وتشمل الأغشية chorioamniotic السلى والمشيمه. تتضمن لوحة القاعدية والقاعدي الساقط ويتضمن المشيمه في الجدارية الساقط (الشكل 1).

  1. الساقط القاعدي
    1. تشريح قطعة من لوحة القاعدية من فلقة واحدة من المشيمة (أرقام 1A و 1B).
    2. وضعه على لوح التقطيع العقيمة مع الزغابات المشيمية التي تواجه التصاعدي. الجانب تظهر الزغابات المشيمية عادة الدموية الحمراء مع النسيج شعر في المظهر. لوحة القاعدية على نحو سلس وشاحب اللون الأحمر.
    3. استخدام حادة، ومقص غرامة نقطة وملقط لإزالة VILLالأنسجة والأوعية الدموية الأوس. الحفاظ على الأنسجة غارقة في برنامج تلفزيوني 1X (كا 2+ - والمغنيسيوم 2+ - مجانا) أثناء عملية (الشكل 1C). جمع 2-3 من هذه القطع وشطف لهم بدقة مع 1X PBS لإزالة الدم (1D الشكل).
  2. الساقط الجداري
    1. تشريح قطعة من الأغشية chorioamniotic (حوالي 10 سم x 10 سم، الشكل 1E). وضعه على متن الطائرة مع المشيمه تواجه التصاعدي. ويتضمن الجانب المشيمي الجلطات الدموية وعادة ما يكون ضوء مصفر اللون.
    2. استخدام ملقط غرامة نقطة لإزالة أكبر عدد ممكن من جلطات الدم ممكن (الشكل 1E). شطف الغشاء في العقيمة برنامج تلفزيوني 1X لتنظيف الدم الزائد من الغشاء حتى يدير برنامج تلفزيوني 1X واضح.
    3. استخدام مكشطة الخلية معقمة المتاح لكشط بلطف طبقة الساقطية من الغشاء. تطبيق العقيمة 1X PBS على ذاكرةالغشاء حين الانتهاء من هذه العملية (الشكل 1F). جمع الأنسجة الساقطية ووضعها في أنبوب بلاستيكي 50 مل العقيمة مع برنامج تلفزيوني 1X (الشكل 1G).

2. الميكانيكية تصنيفها والأنزيمية الهضم

  1. غسل تشريح الأنسجة من القاعدي الساقط (من الخطوة 1.1.3) أو الجدارية الساقط (من الخطوة 1.2.3) مع العقيمة برنامج تلفزيوني 1X في أنبوب بلاستيكي 50 مل. جمع الكريات الأنسجة عن طريق الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
  2. نضح طاف تقع فوق بيليه الأنسجة بعناية من دون إزعاج بيليه.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، الكريات هي فضفاضة جدا لأنها تحتوي على خلايا الدم الحمراء. إذا كان حجم الكرية حوالي أو أقل من 3 مل، وإعادة تعليق بيليه في 6 مل من محلول مفرزة الخلية قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية. إذا كان بيليه هو أكبر من 3 مل من حجم، إضافة المزيد من حل مفرزة الخلية (إضافة حوالي 2 مرات عشرحجم (ه) من عينات الأنسجة).
  3. نقل الأنسجة المتجانس (القاعدي الساقط + انفصال الخلايا حل أو الساقط الجداري + حل مفرزة الخلية) إلى أنبوب C.
  4. وضع أنبوب C في dissociator التلقائي وتشغيل البرنامج المقابل.
    ملاحظة: البرنامج لالقاعدي الساقط يعمل لمدة 17 ثانية مع 668 مجموع طلقة في التشغيل. برنامج للالجدارية الساقط يعمل لمدة 37 ثانية مع 235 مجموع طلقة في التشغيل. وقد تم تخصيص هذه البرامج لعزل الكريات البيض من القاعدي الساقط أو الجدارية الساقط مع العائد الجيد وبقاء الخلية.
  5. بعد تصنيف الميكانيكية للأنسجة، هضم الأنسجة مع متوفرة تجاريا حل مفرزة الخلية مثل accutase. (كوكتيل يحتوي على بروتين وأنزيمات حال الكولاجين) لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الإثارة لطيف.

3. عزل الكريات البيضاء

  1. بعد الحضانة، إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى digestion خليط وتمريرها من خلال خلية مصفاة 100 ميكرون إلى 50 مل أنبوب بلاستيكي. اعتمادا على التصاق الخليط الهضم، واحدة قد تحتاج إلى استخدام عدة مصافى خلية للخليط واحد.
  2. ملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني 1X وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT. إزالة برنامج تلفزيوني 1X فوق الكريات خلية بعناية واعادة تعليق الكريات مع 5 مل من الجليد الباردة FACS العازلة.
    ملاحظة: لدراسة النوى وحيدات النوى الكريات البيض معا، انتقل إلى الخطوة 6.1. لدراسة الكريات البيض وحيدات النوى، انتقل إلى الخطوة 3.3.
  3. إضافة 5 مل من 20٪ سائل الإعلام التدرج الكثافة (1.077 + 0.001 غ / مل) إلى 15 مل أنبوب بلاستيكي وتراكب ببطء تعليق الخلية على رأس وسائل الإعلام التدرج الكثافة. في حين طبقات العينة، فمن المهم عدم خلط وسائل الإعلام التدرج الكثافة مع تعليق الخلية.
  4. أجهزة الطرد المركزي مع الدوار سوينغ بها في 500 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 مئوية دون فرامل. من المهم جدا لإيقاف الفرامل لتجنب الخلط الخلايا ولosing التدرج. ويمكن الاطلاع على الكريات البيض في واجهة بين وسائل الإعلام كثافة التدرج وعازلة FACS.
  5. إزالة الطبقة العليا التي تحتوي على FACS العازلة والخلايا الحطام بعناية فائقة باستخدام ماصة. الفرقة في واجهة تحتوي الخلايا وحيدة النواة الساقطية وجزء من الكريات البيض النوى.
  6. نقل الخلايا في واجهة تماما إلى 15 مل جديد أنبوب من البلاستيك. إضافة على الأقل 3 مرات أكثر حجم العازلة FACS.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق لبلتيز الخلايا. نضح طاف وغسل الخلايا مع العازلة FACS. بلتيز الخلايا مع الطرد المركزي أخرى في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
    ملاحظة: لإجراء زراعة الخلايا، انظر الخطوة 4. لإجراء فرز الخلايا، انظر الخطوة 5. لأداء المناعي، انظر الخطوة 6.

4. تطبيقات - خلية ثقافة

  1. إعادة تعليق الخلايا من الخطوة 3.7 في 1 مل من RPMI مستنبت 1640. عد خلايا قابلة للحياة باليودنانوغرام عداد الخلايا التلقائي أو عدادة الكريات وحل التريبان الأزرق 0.4٪.
  2. تضيف ما يصل مقدار RPMI مستنبت لجعل تركيز خلية من 1 × 10 6 خلية / مل. الخلايا هي الآن جاهزة للثقافة.

5. تطبيقات - عزل الضامة للثقافة الخلية الأولية

  1. عزل CD14 + الخلايا مغناطيسيا تسمية الخلايا من الخطوة 3.7 مع بلي CD14 (20 حبات ميكرولتر في 10 7 الخلايا)، واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 ج، وCD14 منفصل + خلايا من أنواع أخرى من الخلايا من خلال تطبيق مجال مغناطيسي. بعد 2 يغسل مع MACS العازلة وإزالة الحقل المغناطيسي للأرض، أزل CD14 + الخلايا الاحتفاظ مغناطيسيا مع العازلة MACS.
  2. بعد الطرد المركزي، إعادة تعليق الكريات خلية في RPMI مستنبت 1640. الخلايا جاهزة للطلاء (الشكل 2).

6. تطبيقات - المناعي الظاهري

  1. استخدام الخلايا للimmunophenotyping، اعادة تعليق الخلايا من الخطوة 3.7 في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X. عد خلايا قابلة للحياة باستخدام عداد الخلية التلقائي أو عدادة الكريات وحل التريبان الأزرق 0.4٪.
  2. تسمية الخلايا مع صبغة الجدوى قابل للتثبيت (الشكل 3). غسل الخلايا مرتين مع العازلة FACS واعادة تعليق الخلايا في المخزن وصمة عار. احتضان مع مانع FCR لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  3. إضافة الأجسام المضادة الخلية مترافق إلى fluorochromes. على سبيل المثال، في هذا البروتوكول، استخدم مكافحة CD3، ومكافحة CD19، ومكافحة CD14، ومكافحة CD15، ومكافحة CD56 الأجسام المضادة (الجدول 1). احتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
  4. بعد 2 يغسل مع برنامج تلفزيوني 1X، وسيتم تحليل الخلايا في 500 ميكرولتر من العازلة وصمة عار باستخدام قياس التدفق الخلوي. ويرد تمثيل استراتيجية النابضة المستخدمة لتحليل الفرعية من السكان الكريات البيض الموجودة في الأنسجة الساقطية في الشكل (4).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

. يظهر تشريح الأنسجة البشرية في واجهة الأم والجنين (القاعدي الساقط والساقط الجداري) في الشكل رقم 1 ويشمل هذا الإجراء تشريح لوحة القاعدية، والذي يتضمن القاعدي الساقط (الشكل 1A - D). يتم الحصول على القاعدي الساقط عن طريق إزالة الزغب المشيمي (الجانب الجنين) من لوحة القاعدية (الشكل 1C). يتم جمع الجدارية الساقط عن طريق كشط بلطف الغشاء المشيمي (الشكل 1E - F). يبين الشكل 2

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

توصيف الخصائص الفنية والمظهرية لالتسلل الكريات البيض في واجهة الأم والجنين البشري ضروري لفهم الآليات المناعية التي تؤدي إلى اضطرابات الحمل. وقد وصفت عدة تقنيات من أجل عزل الكريات البيض من واجهة الأم والجنين البشري طوال فترة الحمل 10،14،25،28،37،42،43. ومع ذلك، كل هذه التقنيات هو واضح، يستخدم الانزيمات أو مجموعات انزيم مختلفة، ويتطلب مرات التفكك مختلفة، لا تحدد كميات من الأنسجة، والأهم من ذلك، لا تحدد دائما بقاء الخلايا المعزولة. بروتوكول الموصوفة هنا يسمح للعزلة التسلل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يكشف المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل معهد كينيدي شرايفر يونيس الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية، NIH / DHHS. وأيد هذا العمل أيضا، في جزء منه، من خلال مبادرة جامعة واين ستيت في فترة ما حول الولادة صحة الأم وفترة ما حول الولادة وصحة الطفل. نحن نعترف بامتنان مورين McGerty (جامعة ولاية واين) لها قراءات نقدية للمخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>تشريح < / قوي>
أدوات تشريح معقمة: مقص جراحي ، ملقط ، وملاقط ذات طرف رفيع   ؛أي بائع20012-027
1X محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) تقنياتالحياة(1X PBS) أطباق
بتري كبيرة وصغيرةأي بائع
AccutaseLife TechnologiesA11105-01(محلول انفصال الخلية)
مخروطية معقمة 2 ملقفل أي البائع
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية أيبائع
100 & مايكرو ؛ مصافي الخلايا mFALCON / Corning352360
5 مل أنابيب اختبار البوليسترين ذات القاع المستديرأي بائع
نقل الماصاتأي بائع
أنابيب CMiltenyi Biotec130-093-237
Cell Culture< / strong>
RPMI culture medium 1640 & nbsp ؛تقنيات الحياة22400-089(1X) (10٪ FBS و 1٪ P / S)
شرائح الغرفة البلاستيكية حاضنة177437الحرارية العلمية
شركة HEPAفئة 100
حمام مائيفيشر Scientific ISOTEMP110
عداد الخلاياNexelcomمقياس الخلو Auto2000
المجهرأوليمبوسأوليمبوس CKX41
<قوي>فصل الخلايا< / strong>
MS أعمدةMiltenyi Biotec130-042-201
فاصل الخلاياMiltenyi Biotec130-042-109
30 & mu ؛ مرشحات الفصل المسبقم Miltenyi Biotec130-041-40
MultistandMiltenyi Biotec130-042-303
15 مل أنابيب مخروطية ذات قفل آمن أيبائع
MACS buffer   ؛(0.5٪ ألبومين مصل البقر ، 2 ملي مولار EDTA و 1X PBS)
FcR BlockingMiltenyi Biotec130-059-901(Fc Block)
الأجسام المضادة للمستضد السطحي للخلية البشرية   ؛BD Biosciences(الجدول 1)
ألبومين مصل الأبقار صبغة الحية SigmaA7906
LIVE / DEADBiosciences564406
Lyse / Fix buffer   ؛BD Biosciences346202
FACS buffer (0.1٪ BSA ، 0.05٪ أزيد الصوديوم ، و 1X PBS ، الرقم الهيدروجيني = 7.4)
تلطيخ   ؛BD Biosciences554656
محلول Trypan Blue 0.4٪Life Technologies15250-011
FicollGE Healthcare17-1440-02متدرجة كثافة 20٪ (1.077 + 0.001 جم / مل)
<قوي>أدوات إضافية< / قوي >
حاضنة مع شاكرThermo ScientificMAXQ 4450
مقياس التدفق الخلويBD BiosciencesLSR-Fortessa
للطرد المركزي Beckman CoulterSpinChron DLX
نظام فراغأي بائع
التلقائي الأنسجة المنفصلة  Miltenyi Biotecلطيف MACS Dissociator
< td colspan = "4" ><قوي>تفكك< / قوي> أنابيب آمنة < td colspan = "4" >< قوي > الكواشف < / قوي> BD مخزن وسائط

المراجع

  1. Kelly, R. W. Inflammatory mediators and parturition. Rev Reprod. 1 (2), 89-96 (1996).
  2. Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta. 24, Suppl A. S33-S46 (2003).
  3. Romero, R., et al. Inflammation in preterm and term labour and delivery. Semin Fetal Neonatal Med. 11 (5), 317-326 (2006).
  4. Norman, J. E., Bollapragada, S., Yuan, M., Nelson, S. M. Inflammatory pathways in the mechanism of parturition. BMC Pregnancy Childbirth. 7, Suppl 1. S7(2007).
  5. Mor, G., Cardenas, I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 425-433 (2010).
  6. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  7. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. , (2014).
  8. Bulmer, J. N., Morrison, L., Longfellow, M., Ritson, A., Pace, D. Granulated lymphocytes in human endometrium: histochemical and immunohistochemical studies. Hum Reprod. 6 (6), 791-798 (1991).
  9. Bulmer, J. N., Williams, P. J., Lash, G. E. Immune cells in the placental bed. Int J Dev Biol. 54 (2-3), 281-294 (2010).
  10. Sindram-Trujillo, A., Scherjon, S., Kanhai, H., Roelen, D., Claas, F. Increased T-cell activation in decidua parietalis compared to decidua basalis in uncomplicated human term pregnancy. Am J Reprod Immunol. 49 (5), 261-268 (2003).
  11. Red-Horse, K., et al. Trophoblast differentiation during embryo implantation and formation of the maternal-fetal interface. J Clin Invest. 114 (6), 744-754 (2004).
  12. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  13. Christiansen, O. B. Reproductive immunology. Mol Immunol. 55 (1), 8-15 (2013).
  14. Vince, G. S., Starkey, P. M., Jackson, M. C., Sargent, I. L., Redman, C. W. Flow cytometric characterisation of cell populations in human pregnancy decidua and isolation of decidual macrophages. J Immunol Methods. 132 (2), 181-189 (1990).
  15. Trundley, A., Moffett, A. Human uterine leukocytes and pregnancy. Tissue Antigens. 63 (1), 1-12 (2004).
  16. Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression. Biol Reprod. 52 (3), 609-615 (1995).
  17. Rango, U. Fetal tolerance in human pregnancy--a crucial balance between acceptance and limitation of trophoblast invasion. Immunol Lett. 115 (1), 21-32 (2008).
  18. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  19. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy,, B, Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  20. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  21. Thomson, A. J., et al. Leukocytes infiltrate the myometrium during human parturition: further evidence that labour is an inflammatory process. Hum Reprod. 14 (1), 229-236 (1999).
  22. Young, A., et al. Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and fetal membranes during human parturition at term. Biol Reprod. 66 (2), 445-449 (2002).
  23. Osman, I., et al. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Mol Hum Reprod. 9 (1), 41-45 (2003).
  24. Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biol Reprod. 86 (2), 39(2012).
  25. Gomez-Lopez, N., et al. Evidence for a role for the adaptive immune response in human term parturition. Am J Reprod Immunol. 69 (3), 212-230 (2013).
  26. Hamilton, S. A., Tower, C. L., Jones, R. L. Identification of chemokines associated with the recruitment of decidual leukocytes in human labour: potential novel targets for preterm labour. PLoS One. 8 (2), e56946(2013).
  27. Sindram-Trujillo, A. P., et al. Differential distribution of NK cells in decidua basalis compared with decidua parietalis after uncomplicated human term pregnancy. Hum Immunol. 64 (10), 921-929 (2003).
  28. Repnik, U., et al. Comparison of macrophage phenotype between decidua basalis and decidua parietalis by flow cytometry. Placenta. 29 (5), 405-412 (2008).
  29. Sanguansermsri, D., Pongcharoen, S. Pregnancy immunology: decidual immune cells. Asian Pac J Allergy Immunol. 26 (2-3), 171-181 (2008).
  30. Houser, B. L. Decidual macrophages and their roles at the maternal-fetal interface. Yale J Biol Med. 85 (1), 105-118 (2012).
  31. Tamiolakis, D., et al. Human decidual cells activity in women with spontaneous abortions of probable CMV aetiology during the first trimester of gestation. An immunohistochemical study with CMV-associated antigen. Acta Medica (Hradec Kralove). 47 (3), 195-199 (2004).
  32. Williams, P. J., Bulmer, J. N., Searle, R. F., Innes, B. A., Robson, S. C. Altered decidual leucocyte populations in the placental bed in pre-eclampsia and foetal growth restriction: a comparison with late normal pregnancy. Reproduction. 138 (1), 177-184 (2009).
  33. Eide, I. P., et al. Serious foetal growth restriction is associated with reduced proportions of natural killer cells in decidua basalis. Virchows Arch. 448 (3), 269-276 (2006).
  34. Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
  35. He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques. J Vis Exp. (38), (2010).
  36. Jaso, J. M., Wang, S. A., Jorgensen, J. L., Lin, P. Multi-color flow cytometric immunophenotyping for detection of minimal residual disease in AML: past, present and future. Bone Marrow Transplant. 49 (9), 1129-1138 (2014).
  37. Ritson, A., Bulmer, J. N. Isolation and functional studies of granulated lymphocytes in first trimester human decidua. Clin Exp Immunol. 77 (2), 263-268 (1989).
  38. Nagaeva, O., Bondestam, K., Olofsson, J., Damber, M. G., Mincheva-Nilsson, L. An optimized technique for separation of human decidual leukocytes for cellular and molecular analyses. Am J Reprod Immunol. 47 (4), 203-212 (2002).
  39. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Chapter 7. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. (UNIT 7.40), Wiley Online Library. 41-11 (2012).
  40. Soares, M. J., Hunt, J. S. Placenta and trophoblast: methods and protocols overview II. Methods Mol Med. 122, 3-7 (2006).
  41. Ritson, A., Bulmer, J. N. Extraction of leucocytes from human decidua. A comparison of dispersal techniques. J Immunol Methods. 104 (1-2), 231-236 (1987).
  42. White, H. D., et al. A method for the dispersal and characterization of leukocytes from the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol. 44 (2), 96-103 (2000).
  43. Maruyama, T., et al. Flow-cytometric analysis of immune cell populations in human decidua from various types of first-trimester pregnancy. Hum Immunol. 34 (3), 212-218 (1992).
  44. Zhang, J., et al. Isolation of lymphocytes and their innate immune characterizations from liver, intestine, lung and uterus. Cell Mol Immunol. 2 (4), 271-280 (2005).
  45. Carlino, C., et al. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood. 111 (6), 3108-3115 (2008).
  46. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  47. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  48. Snegovskikh, V. V., et al. Intra-amniotic infection upregulates decidual cell vascular endothelial growth factor (VEGF) and neuropilin-1 and -2 expression: implications for infection-related preterm birth. Reprod Sci. 16 (8), 767-780 (2009).
  49. Oliver, C., Cowdrey, N., Abadia-Molina, A. C., Olivares, E. G. Antigen phenotype of cultured decidual stromal cells of human term decidua. J Reprod Immunol. 45 (1), 19-30 (1999).
  50. Chang, Y., Hsieh, P. H., Chao, C. C. The efficiency of Percoll and Ficoll density gradient media in the isolation of marrow derived human mesenchymal stem cells with osteogenic potential. Chang Gung Med J. 32 (3), 264-275 (2009).
  51. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  52. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  53. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل الكريات البيضاء من واجهة الإنسان الأم والجنين
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.