يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين

17.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52866

⸱

مايو 21, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics & Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 2School of Paediatrics and Reproductive Health, Research Centre for Reproductive Health, the Robinson Research Institute, The University of Adelaide, 3Department of Immunology & Microbiology, Wayne State University School of Medicine, 4Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS

في هذه المقالة

ملخص

الموصوف هنا هو بروتوكول لعزل وتحليل الكريات البيض المتسللة للأنسجة في واجهة الأم والجنين (الرحم ، والديسيدوا ، والمشيمة) للفئران. يحافظ هذا البروتوكول على سلامة معظم علامات سطح الخلية وينتج خلايا قابلة للحياة كافية للتطبيقات النهائية بما في ذلك تحليل قياس التدفق الخلوي.

الملخص

التسامح المناعي في الحمل يتطلب أن النظام المناعي للأم يخضع لتغيرات مميزة من أجل قبول ورعاية الجنين. يبدأ هذا التسامح أثناء الجماع، أنشأ خلال تلقيح والزرع، وحافظت طوال فترة الحمل. يتم إثراء وسطاء الخلوية والجزيئية النشطة التسامح الأم والجنين في موقع التماس بين أنسجة الجنين والأم، والمعروفة باسم واجهة الأم والجنين، والذي يتضمن المشيمة والرحم والأنسجة الساقطية. وتتألف هذه الواجهة من خلايا انسجة والكريات البيض التسلل، ووفرة والمظهرية خصائصها تتغير على مدى فترة الحمل. وتشمل التسلل الكريات البيض في واجهة الأم والجنين العدلات، الضامة، والخلايا الجذعية، الخلايا البدينة، وخلايا T والخلايا B والخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا NKT التي تخلق معا المحلية الصغيرة للبيئة التي تحافظ على الحمل. اختلال التوازن بين هذه الخلايا أو أي inappropيعتبر تغيير riate في الظواهر التي آلية المرض في فترة الحمل. ولذلك، فإن دراسة الكريات البيض التي تتسلل إلى واجهة الأم والجنين أمر ضروري من أجل توضيح الآليات المناعية التي تؤدي إلى مضاعفات متعلقة بالحمل. الموصوفة هنا هو البروتوكول الذي يستخدم مزيجا من التفكك الميكانيكية لطيف تليها تصنيف الأنزيمية قوية مع بروتين وحال للكولاجين كوكتيل الأنزيمية لعزل الكريات البيض التسلل من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين. هذا البروتوكول يسمح لعزل أعداد كبيرة من الكريات البيض قادرة على البقاء (> 70٪) مع خصائص المستضدات وظيفية الحفظ بما فيه الكفاية. ومن ثم يمكن تحليلها الكريات البيض معزولة من قبل العديد من التقنيات، بما في ذلك المناعي، فرز الخلايا، والتصوير، immunoblotting، مرنا التعبير، زراعة الخلايا، وفحوصات في المختبر وظيفية مثل ردود فعل متباينة الكريات البيض، والانتشار، أو فحوصات السمية الخلوية.

المقدمة

التسامح المناعي في الحمل هي فترة عندما تحدث تغيرات مميزة في الجهاز المناعي للأم. هذه التغييرات تسمح الأم لتحمل الجنين، والكسب غير المشروع شبه الصنعية 1. الجنين يعبر عن الأب معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) المستضدات 2، وقد تم العثور على خلايا الجنين في الدورة الدموية للأم 3. ومع ذلك، لا يتم رفض الجنين 4،5. ليست مفهومة تماما هذا اللغز.

تنص الفرضية الأخيرة أن التسامح الأم والجنين يتم إنشاؤه أثناء الجماع وتلقيح 6،7 وصيانتها للحفاظ على الحمل فترة ولاية كاملة 10/08. ويعتبر توزيع لهذا التسامح الأم والجنين آلية المرض خلال المراحل المبكرة والمتأخرة من الحمل 10-16. التسامح الأم والجنين ينطوي على مشاركة مختلف المجموعات الفرعية من السكان الكريات البيض، بما في ذلك خلايا T (خلايا T التنظيمي، وخلايا TH1 الخلايا TH2، وخلايا Th17)، لجنة الهدنة العسكريةrophages، العدلات، الخلايا البدينة، الخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا NKT، والخلايا الجذعية، والخلايا B، أن التغير في كثافة وتوطين طوال فترة الحمل 15،17-19. غير المخصب التسامح الأم والجنين على الأم والجنين واجهة 20 - الموقع التشريحي حيث يتفاعل الجهاز المناعي للأم مع الجنين مستضدات 20،21.

يتم إنشاء واجهة الأم والجنين خلال المشيمة عندما خلايا الأرومة الغاذية extravillous الجنين تغزو الغشاء المخاطي في الرحم 22-24. على الجانب الجنين من هذه الواجهة، والأغشية المحيطة بالجنين إنشاء سطح الظهارية المتخصصة في المشيمة، وخلايا الأرومة الغاذية المخلوية السيطرة على صرف المواد الغذائية من خلال الاتصال المباشر مع دم الأم (22). على الجانب الأمهات واجهة، والساقط المجندين تجمع غير متجانس من الكريات البيض التي في الفئران تمثل 30٪ إلى 50٪ من جميع الخلايا الساقطية. بالإضافة إلى مشاركتهم في maternآل التسامح المناعي، وهذه الخلايا هي من أهم المساهمين في عمليات مختلفة خلال فترة الحمل، على سبيل المثال، حماية الجهاز التناسلي من الالتهابات والتلقيح، زرع الجنين 7،25، الأوعية الدموية ساقطي 26، إعادة الأوعية الدموية 24،27، غزو الأرومة الغاذية 28، المشيمة التنمية 24،25، وفي نهاية المطاف والمخاض والولادة 15،17. ولذلك، فإن دراسة الكريات البيض تشارك في التسامح الأم والجنين ضروري لتوضيح التسبب في مضاعفات مرتبطة بالحمل.

في حين أن استخدام المناعية والمناعي ولدت البيانات لرؤية مباشرة وتوطين الرحم، ساقطي، أو الكريات البيض المشيمة 29،30، تحليل التدفق الخلوي وكذلك كشفت مجموعات فرعية محددة من الكريات البيض في كل من هذه الأنسجة 31،32. بالإضافة إلى ذلك، التدفق الخلوي قد استخدمت لتحديد الكثافة ونسبة الأمنال والجنين واجهة الكريات البيض 33 و التعبير مستويات بروتينات الخلية والخلايا 8-10،34. تحليل تدفق cytometric من الكريات البيض في واجهة الأم والجنين يتطلب تعليق وحيد الخلية. من أجل عزل الكريات البيض التسلل من ساقطي، الرحم، والأنسجة المشيمية، وقد استخدمت طريقتين للتفكك النسيج: الميكانيكية والأنزيمية. كلتا الطريقتين تسمح للفصل الكريات البيض تسللوا من المصفوفة خارج الخلية (ECM) من هذه الأنسجة. تفكك النسيج الأنزيمية متفوقة على تفكك النسيج الميكانيكية لأنها تسمح عائدات أعلى من الكريات البيض مع الأضرار المرتبطة القص قوة أقل 35. ونتيجة لذلك، تفارق الأنسجة الميكانيكية يتطلب إلى التجميع الأنسجة 36، والتي قد تزيد من التباين والتغاير من العينات. بعد ذلك، قد يكون التفكك الميكانيكية الخيار عندما يكون المستضد من الفائدة يمكن أن تتغير من التفكك الأنزيمية أو عند وظيفة الخليةأن الحفاظ على الصورة الحاجة الفائدة (على سبيل المثال، السمية الخلوية للخلايا NK) 35.

استخدام التحلل البروتيني مع إنزيمات معينة لتدهور ECM يلغي العائدات المنخفضة لاحظ مع التفكك الميكانيكية. وأفادت العديد من الدراسات أن استخدام التربسين 32، كولاجيناز 37، الدناز 31، dispase 38، والكوكتيلات التجارية من الإنزيمات المختلفة 32،39. ومع ذلك، فإن طبيعة وتركيز الإنزيمات المختلفة ومدة الهضم يجب تحديدها بدقة والتأكد من صلاحيتها لضمان الحفاظ على سلامة الحواتم المستضدية سطح الخلية المطلوبة لالمناعي. الهياكل سطح مختلف عرضة بشكل مختلف لتدمير الإنزيمات المختلفة، مع بعض الإنزيمات، مثل التربسين، كونها سيئة السمعة لتجريد الحواتم سطح الكريات البيض معترف بها من قبل العديد من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة.

قدم هنا هو طريقة استخدام proteolytجيم وكوكتيل الأنزيمية حال للكولاجين، ودعا Accutase. هذا الحل الأنزيمية هو لطيف بما فيه الكفاية في حين لا يزال فعالا في الفصل بين أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين، و لا يتطلب إضافة الكواشف النأي أخرى أو مصل لإنهاء رد فعل التفكك. وعلاوة على ذلك، وانها مستعدة لاستخدام الموردة و، على الرغم من أن الوقت من التفكك يحتاج إلى التحقق، وهو أكثر قوة من الانزيمات المشار إليها أعلاه 40،41.

استخدام مزيج من كلا النوعين من تصنيف الأنسجة يحسن نوعية وكمية من الخلايا التي تم الحصول عليها. وبالتالي، العديد من الدراسات قد نفذت الجمع بين استخدام تفارق الميكانيكية والأنزيمية مع نتائج مرضية 31،32،37. تأسست بروتوكول صفها هنا والتحقق من صحتها في مختبرنا. يستخدم مزيج من التفكك الميكانيكية لطيف تليها تصنيف الأنزيمية القوي. يسمح هذا البروتوكول الدراسة العزلة ومزيد منالكريات البيض التسلل في أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين (الرحم، الساقط، والمشيمة). يحافظ على بروتوكول التالية أيضا على سلامة علامات سطح الخلية وعوائد خلايا قابلة للحياة بما فيه الكفاية لتطبيقات المصب كما يتبين من تحليل تدفق cytometric. أخيرا، ويحافظ على هذا البروتوكول اتساق إعداد الخلايا لتحليل ومقارنة أنسجة الفئران مختلفة تتكون واجهة الأم والجنين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

قبل العمل مع العينات المشار إليها في هذا البروتوكول، ويجب أن تعطى الموافقة الأخلاقية الحيوانية من خلال لجنة أخلاقيات البحوث المحلية ومجالس المراجعة المؤسسية. عند العمل مع دم الحيوانات والخلايا، أو العوامل الخطرة كما ذكر في هذا البروتوكول، يجب أن يتبع الإجراءات المناسبة للسلامة الأحيائية وسلامة المختبرات.

1. ماوس المناولة والأنسجة مجموعة

  1. إعداد محطة العمل العقيمة والحصول على الأدوات المعقمة لجمع الأنسجة. وسوف تشمل هذه الأدوات مقص الكبيرة والصغيرة جراحية، ملقط، وملاقط غرامة طرف. وتشمل أطباق صغيرة بيتري المسمى مع أسماء الأنسجة المناسبة، مليئة 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل (3-5 مل) معايرتها لRT (20-22 درجة مئوية). وتشمل أيضا طبق بتري كبير، الخالي من الملصقات، مملوءة بمحلول PBS 1X (10-15 مل).
  2. الموت ببطء ماوس حاملا (10،5-19،0 أيام بعد coitum (DPC) أو قبل التسليم) باستخدام ثاني أكسيد الكربون (CO 2). للتأكد من أن الفأر هو الموت الرحيم، استخدم تقنية التفكك عنق الرحم.
    ملاحظة: قبل 10.5 DPC، فإنه من الصعب فصل الأنسجة الساقطية يدويا من أنسجة الرحم. إذا لم يكن مطلوبا من عزل الكريات البيض الساقطية، الكريات البيض من أنسجة الرحم من الفئران غير الحوامل أو تلك من الفئران في <10.5 DPC يمكن أيضا أن يؤديها بعد هذا البروتوكول.
  3. باستخدام زوج من مقص جراحي معقم، إزالة الجزء السفلي من البطن والجلد والأنسجة العضلية. مع ملقط، نقل جانبا كل الأجهزة الأخرى حتى الرحم والمبايض مرئية. مع الرحم لا تزال تعلق، واستخدام ملقط لنقلها خارج التجويف البريتوني (الشكل 1A).
  4. تحديد المبايض البعيدة إلى قناة البيض ورحمي بوقي تقاطع كل قرن الرحم. باستخدام مقص جراحي صغيرة، وجعل شق عند تقاطع رحمي بوقي وفصل قرون الرحم من مساريق تحتوي على الأوعية الرحم. ثم،المكوس في عنق الرحم لفصل قرون الرحم من التجويف البريتوني (الشكل 1B).
  5. مع مقص جراحي صغيرة، وجعل شق بين عنق الرحم والجزء السفلي من قرون الرحم. إجازة تعلق جزء من عنق الرحم أثناء هذه العملية (الشكل 1C) لتجنب فتح قرن الرحم.
  6. تزج قرون الرحم (بما في ذلك سرطان عنق الرحم) في طبق بيتري كبيرة مملوءة بمحلول PBS 1X (10-15 مل) لترطيب المواقع الزرع.
  7. في حين لا تزال مغمورة في محلول PBS 1X، وتقليم أي الدهون من قرون الرحم مع مقص جراحي الصغيرة. إبقاء الأنسجة مغمورة في محلول PBS 1X في جميع أنحاء تشريح.
  8. عقد قرون الرحم في مكان مع ملقط، إزالة أحد مواقع زرع من الرحم مع عرضية قطع طريق المنطقة بين الزرع، وذلك باستخدام مقص جراحي الصغيرة (الشكل 1D). يحتوي الموقع زرع الجنين، وتحيط بهاغشاء مشيمائي، والرحم، وساقطي، وأنسجة المشيمة.
  9. باستخدام ملقط، مع الاستمرار على الموقع في مكان وإجراء شق صغير في جدار الرحم المتاخمة للالمشيمة والأنسجة الساقطية (الشكل 1E). تقليم حول محيط المشيمة / الساقط حتى هذه ينفصل من كل من جدار الرحم والغشاء مشيمائي يتضمن الجنين (الشكل 1F).
  10. إزالة المشيمة والأنسجة ساقطي المرفقة والمكان في برنامج تلفزيوني 1X حل (3-5 مل؛ راجع الخطوة 1.12).
  11. وضع الجنين محاطة غشاء مشيمائي تعلق على أنسجة الرحم في طبق بيتري مملوءة بمحلول PBS 1X (3-5 مل). فإن الماء من هذه الأنسجة تسهيل فصل غشاء مشيمائي من جدار الرحم (راجع الخطوة 1.14).
  12. باستخدام زوج من ملاقط غرامة طرف، قشر بلطف الأنسجة الساقطية (طبقة بيضاء اللون الرمادي) من سطح المشيمة. تنفيذ هذهخطوة بعناية للحفاظ على سلامة المشيمة والأنسجة الساقطية (الشكل 1G).
  13. وضع المشيمة والأنسجة الساقطية في اثنين من أطباق بتري وصفت بشكل منفصل مملوءة بمحلول PBS 1X (3-5 مل لكل منهما).
  14. بلطف إزالة جدار الرحم من غشاء مشيمائي مع ملاقط غرامة طرف. هذه هي أنسجة الرحم.
  15. وضع أنسجة الرحم في طبق بيتري مملوءة بمحلول PBS 1X (3-5 مل).
  16. كرر الخطوات 1.8 خلال 1.15 حتى يتم معالجة كافة المواقع الزرع.
  17. جمع العديد من الرحم، ساقطي، وأنسجة المشيمة لتحسين العائد من الخلايا أثناء عملية الهضم الأنزيمي. كمية من الأنسجة يعتمد على حجم القمامة. ومع ذلك، الكريات البيض العزلة تتطلب> 2 قطعة من الأنسجة.
    ملاحظة: للحصول على معلومات أكثر تفصيلا بشأن تشريح للمواقع زرع في أيام مختلفة الحمل، عرض الصور موجود في الفصل الثاني من دليل Investigatiعلى الفأر الحمل 42.

2. الرحم، ساقطي، والمشيمة الأنسجة التفكك

  1. تسمية عدة العقيمة 2 مل أنابيب مخروطية مع اسم الأنسجة المناسبة، ووضع قنينة مع 1000 ميكرولتر من محلول الأنزيمي على الجليد.
  2. من طبق بيتري مملوءة بمحلول برنامج تلفزيوني 1X، ونقل قطعتين (100-150 ملغ) من الرحم، ساقطي، أو أنسجة المشيمة إلى المسمى 2 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  3. إضافة 500 ميكرولتر من محلول الأنزيمية البارد في كل 2 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  4. مع مقص العقيمة غرامة، والبدء في فصل الأنسجة مغمورة في محلول الأنزيمية حتى يتم مفروم ناعما ذلك. مع مرور الوقت، فإن وقف تطوير مظهر حليبي. يجب أن لا تتجاوز هذه الخطوة أكثر من 2 دقيقة لمنع أكثر من التلاعب من العينة.
  5. مرة واحدة وقد تم فصل الأنسجة، إضافة اضافي 500 ميكرولتر من محلول الأنزيمية البارد إلى 2 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  6. وضع أنبوب مخروطي 2 مل على الجليد.
  7. كرر الخطوات من 2.2 خلال 2.6 مع كل الأنسجة الفردية إلى أن يتم معالجة كافة الأنسجة.
  8. نقل كل مل 2 أنابيب مخروطية مع النسيج المتجانس (الأنسجة مفروم + حل الأنزيمية) عينات من الجليد في حاضنة عند 37 درجة مئوية وإجراء التحريض المداري لطيف (80 دورة في الدقيقة). احتضان لمدة 30 - 35 دقيقة. تأكد من استقرار درجة حرارة الحاضنة قبل بدء فترة حضانة.
  9. بعد الحضانة، وإزالة مل 2 أنابيب مخروطية مع الأنسجة فصلها عن الحاضنة ووضعها على الجليد لمنع أي عملية الهضم آخر.
  10. تسمية العقيمة 50 مل أنابيب مخروطية وفقا لنوع الأنسجة. إزالة الأغطية واستبدالها مصفاة الخلية معقمة (100 حجم ميكرون المسام).
  11. صب الأنسجة فصلها من مل 2 أنابيب مخروطية من خلال مصفاة الخلية باستخدام ~ 20 مل من محلول برنامج تلفزيوني 1X. فإن أجزاء من الأنسجة تبقى في مصفاة الخلية وسوف تعليق خلية تمر عبره.
  12. غسل ديالأنسجة ssociated في مصفاة الخلية 2-3 مرات مع 20 مل من محلول 1X PBS باستخدام ماصة نقل.
  13. شطف فارغة 2 مل أنابيب مخروطية مع حل PBS 1X (1 مل)، وصب محتويات من خلال مصافى الخلية.
  14. إزالة مصافى الخلية من 50 مل أنابيب مخروطية واستبدال الأغطية. أنابيب الطرد المركزي في 1250 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  15. بعناية، ونضح طاف دون الإخلال بيليه الخلية. بيليه خلية تحتوي على كريات الدم البيضاء والخلايا المعزولة اللحمية.
  16. إعادة تعليق بيليه خلية في 1 مل من RPMI مستنبت دون مصل بقري جنيني (FBS). المزيج بلطف. لا تستخدم الدوامة.
  17. إضافة 500 ميكرولتر من FBS أنيق إلى 5 مل أنبوب بلاستيكي البوليسترين وتراكب ببطء تعليق الخلية.
  18. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1100 x ج بدون فرامل في RT لتكوير خلايا قابلة للحياة في حين يتم الاحتفاظ الحطام الخلوي في واجهة PBS / FBS.
  19. نضح طاف دون لمس بيليه الخلية. وسلل بيليه يحتوي على خلايا معظمها قابلة للحياة.
  20. اختياري: لتركيز خلايا وحيدة النواة، استخدم 20٪ من محلول السكاريد المشبعة، كما هو موضح أدناه.
    1. resuspend الكرية خلية في 1000 ميكرولتر من RPMI مستنبت دون FBS.
    2. إضافة 1 مل من 20٪ من محلول السكاريد المشبعة إلى 5 مل أنبوب بلاستيكي البوليسترين وتراكب ببطء تعليق الخلية على رأس هذا الحل، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. في حين طبقات العينة، وتجنب خلط المشبعة 20٪ محلول السكاريد مع تعليق الخلية.
    3. أجهزة الطرد المركزي مع الدوار سوينغ بها في 500 x ج لمدة 30 دقيقة في RT دون فرامل. من المهم جدا لإيقاف الفرامل لتجنب الخلط الخلايا وفقدان التدرج. سيتم العثور على خلايا وحيدة النواة في واجهة بين المشبعة 20٪ محلول السكاريد والحل برنامج تلفزيوني 1X.
    4. نضح وتجاهل طاف. بيليه الخلية يحتوي على خلايا وحيدات النوى في الغالب.
      لاالشركة المصرية للاتصالات: لإجراء تلطيخ الجدوى وتلطيخ الخلايا، راجع الخطوة 3. أداء المناعي، راجع الخطوة 4. لأداء تلطيخ الجدوى وتلطيخ خارج الخلية فقط، انظر الخطوة 5. لإجراء زراعة الخلايا الكريات البيض معزولة، راجع الخطوة 6. لأداء فرز الخلايا المغناطيسي، راجع الخطوة 7.

3. قابلية تلطيخ للخلايا قابل للتثبيت

  1. resuspend الكرية خلية في 1100 ميكرولتر من محلول برنامج تلفزيوني 1X. المزيج بلطف باستخدام ماصة الصغرى.
  2. نقل 100 ميكرولتر من تعليق خلية في أنبوب بلاستيكي 5 مل البوليسترين. إضافة 400 ميكرولتر من محلول برنامج تلفزيوني 1X إلى 5 مل أنبوب البوليسترين. هذا الأنبوب هو السيطرة على النسيج لصناعة السيارات في مضان. تخزين عند 4 درجات مئوية حتى الخطوة 3.5.
  3. نقل 1000 ميكرولتر المتبقية من تعليق خلية إلى 5 مل جديد أنبوب بلاستيكي البوليسترين. إضافة 1 ميكرولتر من صبغة الجدوى والتجانس بلطف. احتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في 4 درجة مئوية.
  4. بعد الحضانة، إضافة 1000 & #181؛ ل من حل برنامج تلفزيوني 1X. المزيج بلطف باليد.
  5. الطرد المركزي على حد سواء 5 مل أنابيب البلاستيك البوليسترين (الخطوات 3.2 و 3.3) في 1250 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. نضح وتجاهل طاف.
    ملاحظة: سيتم استخدام الخلية بيليه (الخطوة 3.3) في الخطوة 4. الخلية بيليه (الخطوة 3.2) سيكون بمثابة الرقابة على النسيج لصناعة السيارات في مضان.

4. المناعي الظاهري

  1. resuspend الكرية خلية في 50 ميكرولتر من مكافحة فأر CD16 / CD32 (المخفف 1: 100 في FACS العازلة [0.1٪ BSA، 0.05٪ أزيد الصوديوم، حل برنامج تلفزيوني 1X، ودرجة الحموضة 7.4]). مزيج تعليق خلية بلطف. لا تستخدم الدوامة.
  2. احتضان تعليق الخلية في أنبوب البوليسترين 5 مل في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. بعد الحضانة، إضافة (يجب أن يتم التحقق من صحة التخفيفات الأجسام المضادة) 50 ميكرولتر من كل معاداة الكريات البيض وحيدة النسيلة الأجسام المضادة التفاعل مع علامات سطح الخلية الخلية أو يقابل نمط إسوي مراقبة الأجسام المضادة. على سبيل المثال، لتحليل الكريات البيض الفرعية من السكان، استخدم مكافحة مواستخدام الأجسام المضادة التفاعل مع علامات سطح خلايا كرات الدم البيضاء التالية: CD45، Ly6G، F4 / 80، CD11c و، CD49b، B220، CD3، CD4، وCD8 (الجدول 1).
  4. مرة واحدة تم إضافة أجسام مضادة ضد علامات خارج الخلية إلى 5 مل أنبوب من البلاستيك البولي ستايرين، والمزيج بلطف. احتضان في الظلام لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  5. خلال هذه الحضانة، وإعداد وقبل تسخين حل العازلة التثبيت (المخفف بالماء منزوع الأيونات، 1: 5) إلى 37 درجة مئوية، إذا لزم الأمر. إبقاء المنطقة العازلة في 37 درجة مئوية في الظلام حتى يكون استخدامه ضروريا.
  6. بعد 30 دقيقة الحضانة، إضافة 500 ميكرولتر من العازلة FACS في 5 مل أنبوب بلاستيكي البوليسترين وتخلط بلطف. هناك حاجة إلى هذه الخطوة لغسل الخلايا وإزالة أي فائض من الأجسام المضادة غير منضم.
  7. الطرد المركزي العينات في 1250 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. نضح وتجاهل طاف.
    ملاحظة: إذا لم يكن مطلوبا تلطيخ الخلايا، انظر الخطوة 5. إذا كان مطلوبا تلطيخ الخلايا، نفذ permeabilization وintracell تلطيخ جزيئية هنا، ومن ثم المضي قدما في تثبيت (الخطوة 4.8).
  8. إضافة 500 ميكرولتر من قبل تحسنت حل العازلة تثبيت لبيليه الخلية واحتضان في الظلام لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  9. الاستغناء عن 500 ميكرولتر من العازلة FACS في 5 مل أنبوب بلاستيكي البوليسترين. المزيج بلطف.
  10. الطرد المركزي العينات في 1250 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. نضح وتجاهل طاف.
  11. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة FACS إلى كل عينة. ويمكن الآن تحليل هذه العينات عن طريق التدفق الخلوي. الحصول على عينات فورا حصول على أفضل النتائج.

5. قابلية تلطيخ للخلايا Unfixable

  1. بعد المناعي خارج الخلية، resuspend الكرية الخلية في 500 ميكرولتر من العازلة FACS.
  2. إضافة 1 ميكرولتر من 4، هيدروكلوريد 6-diamidino-2-phenylindole (دابي، 200 ميكروغرام / مل) قبل الحصول على العينة.
  3. تصور العينات في غضون 1-2 دقيقة بعد إضافة دابي باستخدام قياس التدفق الخلوي.

معشوقة = "jove_title"> 6. زراعة الخلايا

  1. إعداد محطة عمل تحت غطاء الدخان العقيمة. قبل تدفئة مستنبت RPMI إلى 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي.
  2. resuspend الكرية خلية في 1000 ميكرولتر من العازلة FACS لحساب الخلية.
  3. حساب عدد خلايا قابلة للحياة باستخدام عداد الخلية التلقائي أو عدادة الكريات وحل الأزرق 0.4٪ التريبان، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تسجيل العدد الكلي للخلية الحية.
  4. الطرد المركزي الخلايا في 1250 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لإزالة المنطقة العازلة FACS.
  5. resuspend الكرية الخلية في 500 ميكرولتر من قبل حرارة RPMI مستنبت بواسطة pipetting بلطف 2-3 مرات.
  6. لوحة العدد المطلوب من الخلايا في العقيمة لوحة 24-جيدا واحتضان عند 37 ° C. وسيتم تحديد فترة حضانة من قبل على سؤال البحث.

7. المغناطيسي فرز الخلايا

  1. انشاء محطة نظيفة مع المواد الآتية: أعمدة MS، فاصل الخلايا المغناطيسي، و15أنابيب مل المخروطية، 30 ميكرون مرشحات قبل الانفصال، ومتعددة الاحتياطية.
  2. resuspend الكرية الخلية في 500 ميكرولتر من MACS العازلة (0.5٪ BSA، 2mm و EDTA، حل برنامج تلفزيوني 1X، ودرجة الحموضة 7.2).
  3. باستخدام عداد الخلية التلقائي أو عدادة الكريات و 0.4٪ التريبان حل الأزرق، عد وتسجيل العدد الكلي للخلايا الحية.
  4. الطرد المركزي الخلايا في 1250 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. نضح وتجاهل طاف. إضافة 500 ميكرولتر آخر من العازلة MACS.
  5. الشروع في تنفيذ الفصل المغناطيسي التالية توصيات الشركة الصانعة.
  6. تحديد نقاء التدفق الخلوي أو المجهري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يظهر تشريح الأنسجة الفئران من واجهة الأم والجنين في الشكل 1؛ ويشمل هذا الإجراء فتح التجويف البريتوني (الشكل 1A، B)، وأبواق الرحم (الشكل 1C) بما في ذلك مواقع زرع (الشكل 1D)، وجمع من أنسجة الرحم (الشكل 1E)، المشيمة (الشكل 1F)، والأنسجة الساقطية (الشكل 1G) في 16.5 شركة ظفار. ويبين الشكل (2) ومورفولوجية الضامة معزولة (F4 / 80 +) التي تم جمعها من ساقطي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

جمع البيانات متسقة أن يسجل وفرة والمظهرية خصائص الكريات البيض التسلل في واجهة الأم والجنين ضروري لفهم التسبب في مضاعفات مرتبطة بالحمل. وقد وصفت العديد من التقنيات التي تسهل عزل التسلل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين طوال فترة الحمل 31،38،39،43-46. ومع ذلك، كل تقنية مختلفة، يستخدم الانزيمات أو مجموعات انزيم مختلفة، ويتطلب مرات التفكك مختلفة، لا تحدد كميات من الأنسجة، والأهم من ذلك، لا تحدد دائما بقاء الخلايا المعزولة. بروتوكول الموصوفة هنا يسمح للعزل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب تكشف عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد NGL من قبل مبادرة جامعة واين ستيت في فترة ما حول الولادة صحة الأم وفترة ما حول الولادة وصحة الطفل. نحن نعترف بامتنان مورين McGerty وايمي E. Furcron (جامعة ولاية واين) لقراءة نقدية لها من المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات تحضير Life فراغ الخلايا الآلي
< قوي > فرز الخلايا الأرجواني < / strong>
MS أعمدةMilitenyi Biotec130-042-201
فاصل الخلاياMilitenyi Biotec130-042-102
30 & مرشحات ما قبل الفصلم ميليتيني بيوتيك130-041-407
MultistandMilitenyi Biotec130-042-303
أنابيب مخروطية 15 ملThermo Fisher339650
MACS BufferMilitenyiمختبرBiotec (0.5٪ ألبومين مصل بقري ، 2 ملي مولار EDTA و 1x PBS ، درجة الحموضة 7.2)
recodes< / strong>
محلول Accutase الأنزيميLife TechnologiesA11105-01
CD16 / CD32BD Biosciences533142
الأجسام المضادة خارج الخلية المضادة للفأرBD Bioscences / eBiosciencesالجدول 1< / قوي>
أزيد الصوديومفيشرS227-500
ألبومين مصل الأبقار (BSA)سيجما ألدريتشA7906-100G
صبغة الحياوىTechnologiesL23105
حل عازلة التثبيتBD Biosciences558049
FACS BufferBD Biosciencesتحضير المختبر0.1٪ BSA ، 0.05٪ أزيد الصوديوم ، 1x PBS ، درجة الحموضة 7.4
محلول تريبان الأزرق 0.4٪BIO-RAD145-0013
مصل الأبقار الجنيني (FBS)تقنيات الحياة16000-044
أدوات إضافية< / قوية >
حاضنة مع شاكرThermo ScientificMaxQ 4450
مقياس التدفق الخلويBD LSRFortessa
جهاز طردمركزي Thermo ScientificLegend LXTR
مختبر نظامتم إنشاؤه
حاضنة حاضنةحرارية علمية3307
حمام مائيدقيقعداد خلايا 51221035
BIO-RADTC20 عداد
المجاهر البصرية والفلورية Zeissو OlympusZeiss LSM780 و Olympus CKX41

المراجع

  1. Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother's little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
  2. King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast. J Immunol. 156 (6), 2068-2076 (1996).
  3. Bonney, E. A., Matzinger, P. The maternal immune system's interaction with circulating fetal cells. J Immunol. 158 (1), 40-47 (1997).
  4. Tafuri, A., Alferink, J., Moller, P., Hammerling, G. J., Arnold, B. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science. 270 (5236), 630-633 (1995).
  5. Chaouat, G., Petitbarat, M., Dubanchet, S., Rahmati, M., Ledee, N. Tolerance to the foetal allograft. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 624-636 (2010).
  6. Robertson, S. A., et al. Seminal fluid drives expansion of the CD4+CD25+ T regulatory cell pool and induces tolerance to paternal alloantigens in mice. Biol Reprod. 80 (5), 1036-1045 (2009).
  7. Robertson, S. A., Moldenhauer, L. M. Immunological determinants of implantation success. Int J Dev Biol. 58 (2-4), 205-217 (2014).
  8. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  9. Rowe, J. H., Ertelt, J. M., Xin, L., Way, S. S. Pregnancy imprints regulatory memory that sustains anergy to fetal antigen. Nature. 490 (7418), 102-106 (2012).
  10. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  11. Saito, S., Sakai, M., Sasaki, Y., Nakashima, A., Shiozaki, A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 30-39 (2007).
  12. Lee, J., et al. A signature of maternal anti-fetal rejection in spontaneous preterm birth: chronic chorioamnionitis, anti-human leukocyte antigen antibodies, and C4d. PLoS One. 6 (2), 0016806(2011).
  13. Steinborn, A., et al. Pregnancy-associated diseases are characterized by the composition of the systemic regulatory T cell (Treg) pool with distinct subsets of Tregs. Clin Exp Immunol. 167 (1), 84-98 (2012).
  14. Gomez-Lopez, N., Laresgoiti-Servitje, E. T regulatory cells: regulating both term and preterm labor. Immunol Cell Biol. 90 (10), 919-920 (2012).
  15. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. 23 (10), 46(2014).
  16. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
  17. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  18. Timmons, B., Akins, M., Mahendroo, M. Cervical remodeling during pregnancy and parturition. Trends Endocrinol Metab. 21 (6), 353-361 (2010).
  19. Arck, P. C., Hecher, K. Fetomaternal immune cross-talk and its consequences for maternal and offspring's health. Nat Med. 19 (5), 548-556 (2013).
  20. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  21. Wambach, C. M., Patel, S. N., Kahn, D. A. Maternal and fetal factors that contribute to the localization of T regulatory cells during pregnancy. Am J Reprod Immunol. 71 (5), 391-400 (2014).
  22. Cross, J. C., Werb, Z., Fisher, S. J. Implantation and the placenta: key pieces of the development puzzle. Science. 266 (5190), 1508-1518 (1994).
  23. Georgiades, P., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Comparative developmental anatomy of the murine and human definitive placentae. Placenta. 23 (1), 3-19 (2002).
  24. Croy, B. A., et al. Imaging of vascular development in early mouse decidua and its association with leukocytes and trophoblasts. Biol Reprod. 87 (5), (2012).
  25. Hofmann, A. P., Gerber, S. A., Croy, B. A. Uterine natural killer cells pace early development of mouse decidua basalis. Mol Hum Reprod. 20 (1), 66-76 (2014).
  26. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, B. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  27. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  28. Lash, G. E., et al. Regulation of extravillous trophoblast invasion by uterine natural killer cells is dependent on gestational age. Hum Reprod. 25 (5), 1137-1145 (2010).
  29. Kruse, A., Merchant, M. J., Hallmann, R., Butcher, E. C. Evidence of specialized leukocyte-vascular homing interactions at the maternal/fetal interface. Eur J Immunol. 29 (4), 1116-1126 (1999).
  30. Degaki, K. Y., Chen, Z., Yamada, A. T., Croy, B. A. Delta-like ligand (DLL)1 expression in early mouse decidua and its localization to uterine natural killer cells. PLoS One. 7 (12), 28(2012).
  31. Habbeddine, M., Verbeke, P., Karaz, S., Bobe, P., Kanellopoulos-Langevin, C. Leukocyte Population Dynamics and Detection of IL-9 as a Major Cytokine at the Mouse Fetal-Maternal Interface. PLoS One. 9 (9), (2014).
  32. Blaisdell, A., Erlbacher, E. Ch. 53. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 619-635 (2014).
  33. Rinaldi, S. F., Catalano, R. D., Wade, J., Rossi, A. G., Norman, J. E. Decidual neutrophil infiltration is not required for preterm birth in a mouse model of infection-induced preterm labor. J Immunol. 192 (5), 2315-2325 (2014).
  34. Plaks, V., et al. Uterine DCs are crucial for decidua formation during embryo implantation in mice. J Clin Invest. 118 (12), 3954-3965 (2008).
  35. Parr, E. L., Szary, A., Parr, M. B. Measurement of natural killer activity and target cell binding by mouse metrial gland cells isolated by enzymic or mechanical methods. J Reprod Fertil. 88 (1), 283-294 (1990).
  36. Arck, P. C., et al. Murine T cell determination of pregnancy outcome. Cell Immunol. 196 (2), 71-79 (1999).
  37. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. 7 (7), 1-11 (2012).
  38. Li, L. P., Fang, Y. C., Dong, G. F., Lin, Y., Saito, S. Depletion of invariant NKT cells reduces inflammation-induced preterm delivery in mice. J Immunol. 188 (9), 4681-4689 (2012).
  39. Collins, M. K., Tay, C. S., Erlebacher, A. Dendritic cell entrapment within the pregnant uterus inhibits immune surveillance of the maternal/fetal interface in mice. J Clin Invest. 119 (7), 2062-2073 (2009).
  40. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  41. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  42. Pang, S. C., Janzen-Pang, J., Tse, Y., Croy, B. A. Ch. 2. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 21-42 (2014).
  43. Zenclussen, A. C., et al. Murine abortion is associated with enhanced interleukin-6 levels at the feto-maternal interface. Cytokine. 24 (4), 150-160 (2003).
  44. Mallidi, T. V., Craig, L. E., Schloemann, S. R., Riley, J. K. Murine endometrial and decidual NK1.1+ natural killer cells display a B220+CD11c+ cell surface phenotype. Biol Reprod. 81 (2), 310-318 (2009).
  45. Addio, F., et al. The link between the PDL1 costimulatory pathway and Th17 in fetomaternal tolerance. J Immunol. 187 (9), 4530-4541 (2011).
  46. Shynlova, O., et al. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. J Cell Mol Med. 17 (2), 311-324 (2013).
  47. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  48. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  49. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
  50. Gordon, K. M., Duckett, L., Daul, B., Petrie, H. T. A simple method for detecting up to five immunofluorescent parameters together with DNA staining for cell cycle or viability on a benchtop flow cytometer. J Immunol Methods. 275 (1-2), 113-121 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.