جيل من التذبذبات CA1 γ المحلية من خلال تحفيز كزازي

تحدث اهتزازات الشبكة الدماغ في نطاقات الترددات المختلفة التي ترتبط إلى الدول السلوكية. في القوارض، التذبذبات θ الحصين - ويلاحظ (5 10 هرتز) خلال السلوكيات الاستكشافية ^1،2، في حين التذبذبات γ (20-80 هرتز) مع الزميلة العمليات المعرفية المختلفة، بما في ذلك الإدراك والانتباه ^3،4. هو متورط متزامن نشاط الشبكة γ أيضا في أمراض اضطرابات مثل الصرع والفصام ^5،6. على سبيل المثال، يعتقد أن التذبذبات γ لتتوافق مع مجالات القشرية بؤر صرعية ^5،7،8 ويمكن أن تستخدم كعلامات من pharmacosensitivity أو المقاومة، واثنين من المجالات الهامة للتحقيق في أبحاث الصرع ^9.

شريحة الدماغ الحصين هو النموذج الذي تم استخدامه على نطاق واسع للتحقيق في نشاط الشبكة ^10-12. وقد وضعت بروتوكولات مختلفة لتوليد اهتزازات γ في شرائح الدماغ التي عادة ما طnvolve تعديل الدوائي مثل انخفاض المغنيسيوم ^2+، 4-aminopyridine (4AP)، bicuculline، وحمض الكايينيك ^12-17. أوجه القصور في التذبذبات أثار دواء هي أنها تحدث بشكل عشوائي بعد تطبيق المخدرات ولم يتم إنشاؤها بشكل موثوق أو مستقرة على مر الزمن. أثار كهربائيا التذبذبات γ التغلب على كثير من هذه المشاكل ولها أيضا ميزة حبسهم زمنيا لحدث مثير السماح لتسجيل وتحليل العرضية. هنا يوصف بروتوكول لتوليد اهتزازات CA1 γ من خلال تقديم التحفيز كزازي إلى الطبقة المتجهة في شريحة الحصين.

تمت الموافقة على جميع التجارب على الفئران قبل لجنة الأخلاق الحيوانية معهد فلوري.

1. إعداد لقطع شرائح الدماغ

1. إعداد محلول القطع تتألف من (ملم) 125 الكولين-CL، 2.5 بوكل، 0.4 CaCl _2، 6 MgCl _2، 1.25 ناه ₂ ص _4، 26 NaHCO _3، 20 D-الجلوكوز مشبعة بالغاز كربوجين (95٪ O ₂ -5 ٪ CO _2)، والسائل النخاعي الاصطناعي (حل ACSF) تسجيل تتألف من (ملم) 125 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 2 CaCl _2، 2 MgCl _2، 1.25 ناه ₂ ص _4، 26 NaHCO _3، 10 D-الجلوكوز، مشبعة كربوجين. وضع حل القطع على الجليد لإبقائه باردا.
2. تجميد حوالي 400 مل من محلول القطع والمزج مع 100 مل من محلول القطع رفع التجميد لخلق الطين الجليد. فقاعة مع كربوجين (95٪ O ₂ -5٪ CO ₂₎ في تدفق ما يقرب من 0.5 لتر / دقيقة عن طريق ج الصغيرةaliber أنابيب أو الزجاج متكلس لإنتاج تدفق ثابت ولكن لطيف من الفقاعات.
3. إعداد كوب 250 مل مع رفع إدراج شبكة من النايلون التي سيتم وضعها على شرائح الدماغ. ملء مع ACSF لتغطية شبكة بحوالي 2 سم وفقاعة مع كربوجين، وضمان أن الفقاعات لا يعطل مباشرة مساحة الشريحة القابضة. ومن المهم أيضا أن عدم وجود فقاعات الهواء في شبكة من النايلون، لذلك إن وجدت موجودة إزالتها. وستكون هذه الغرفة القابضة ويتم الاحتفاظ بها في RT (20-25 درجة مئوية).
4. تخطيط الصكوك تشريح بما في ذلك زوج كبير من مقص، وزوج من مقص صغير، ملاعق صغيرة صغيرة وكبيرة، وأزواج الكبيرة والصغيرة من الملقط والبرد منهم على الجليد. وضع كتلة قطع الأنسجة vibratome على الجليد على الساحة من رقائق الألومنيوم. الحصول على 2 قطعة من 6 سم رقة الترشيح، واحدة حافة شفرة الحلاقة، ودورق 25 مل مليئة الطين حل القطع كذلك.
5. ملء الحاويات الثانية مع الثلج، ووضع قطعة من حلمة الثدي النسيجإيه على الجليد ووضع صحن الثقافة 12 سم على القمة. ملء الطبق الثقافة مع قطع حل الطين الجليد وفقاعة مع كربوجين. هذا هو الحاوية التي تشريح الدماغ مع أن يؤديها.
6. إعداد vibratome. إزالة مزدوجة شفرة حلاقة جديدة حدين (استخدام شفرة جديدة في كل مرة) من الالتفاف ورذاذ مع 80٪ من الإيثانول الماء ثم منزوع الأيونات. قطع 3 مل من البلاستيك ماصة نقل عند النقطة التي يبدأ في الاضمحلال. وسوف تستخدم هذه لنقل شرائح الدماغ. بيند 27 G إبرة في قاعدة بحوالي 45 درجة ونعلق على حقنة 1 مل. وسوف تستخدم هذه للتلاعب شرائح خلال عدة قطاعات.

2. قطع شرائح الدماغ

1. تخدير ماوس (P16 - P18) مع 2٪ الأيزوفلورين أو طريقة معتمدة محليا. بعد الاستقراء، وقطع رأس الحيوان مع زوج كبير من مقص وإسقاط رئيس في طبق ثقافة 12 سم يحتوي على فقاعات الطين حل القطع. الطين يجب أن تزج تماما الرأس لالتبريد السريع.
2. عقد الجزء الأمامي من الرأس بيد واحدة تقشير الجلد والنسيج الضام إلى الأمام نحو الأنف. باستخدام مقص صغير قطع النسيج الضام للكشف عن الجمجمة الأساسية. ثم إزالة العضلات التي تغمر الجانب الظهري من الجمجمة والعنق.
3. إزالة الدماغ من الجمجمة عن طريق تأمين لأول مرة أمام الجمجمة مع ملقط كبيرة ومن ثم جعل اثنين من التخفيضات الجانبية من خلال العظام جانبي ماغنوم الثقبة باستخدام مقص صغير (الشكل 1، والتخفيضات وصفت A1 و A2).
   1. جعل قطع أخرى بين العينين (فقط الأمامي من bregma) (الشكل 1، وقطع المسمى B) ثم قطع بعناية على طول الدرز السهمي الأمامية وتعكس أقسام قطع الجمجمة للكشف عن الدماغ (الشكل 1، وقطع المسمى C).
   2. استخدام ملعقة صغيرة ليستخرج الدماغ ومكان على طبق الثقافة. يكون على بينة من كراالأعصاب الاتحاد العالمي للتعليم على الجانب السفلي من الدماغ والتي سوف تحتاج إلى أن تنقطع، وهذا يمكن أن يتم ذلك باستخدام ملعقة صغيرة صغيرة الحجم. باستخدام ملعقة الأكبر نقل الدماغ على الدورق 25 مل مليئة الطين حل القطع.
4. إعداد المخ في نصف الكرة للتشريح.
   1. وضع قطعة واحدة من ورقة الترشيح 6 سم في الجزء السفلي من طبق ثقافة جديدة ثم ملء مع الطازجة الطين حل القطع وفقاعة. استخدام الملعقة الكبيرة لوضع الدماغ، الجانب البطني أسفل، على ورقة الترشيح. اتخاذ حافة واحدة شفرة حلاقة جديدة وتنظيفها وقطع الدماغ لإزالة المخيخ، ثم اجراء خفض على طول خط منتصف لفصل المخ إلى نصفين.
5. إعداد كتلة الأنسجة vibratome.
   1. اتخاذ المبردة كتلة الأنسجة vibratome، يجف السطح، ووضع قطرة من الغراء cyanoacrylate في الوسط، وتنتشر بالتساوي على الحجم التقريبي للدماغ. استخدام ملعقة صغيرة لمعالجة واحدة مننصفي الدماغ على ملعقة صغيرة كبيرة جدا على الجانب الإنسي من الدماغ هو أسفل.
   2. تلمس حافة الملعقة في واجهة الدماغ على القطعة الثانية من ورق الترشيح لإزالة أكبر قدر من حل ممكن. حرك الدماغ قبالة ملعقة أكبر باستخدام ملعقة صغيرة لترشدها على الغراء.
   3. تأمين كتلة قطع في غرفة vibratome وملء الغرفة مع الطين حل القطع وفقاعة، بما يضمن مغمورة المخ تماما. تدوير كتلة قطع ذلك الجانب البطني من الدماغ يواجه النصل.
6. تشريح الدماغ.
   ملاحظة: كل vibratome هو فريد من نوعه اتبع تعليمات الشركة الصانعة.
   1. تعيين سمك شريحة إلى 450 ميكرومتر، وضمان شفرة تهتز وهي تتحرك من خلال الدماغ بسرعة حوالي 0.3 ملم / ثانية. قطع تماما من خلال الدماغ من الجانب البطني إلى السطح القشري، وهذا سوف ينتج الدماغ شرائح السهمي كلها التي يمكن بالبريد المستخدمة في التسجيلات الكهربية. وسيتم إنتاج شرائح أفقيا إلى إعلامي وعادة 3-4 شرائح يمكن قطع كل من نصف الكرة الغربي.
   2. إذا كانت قاعدة المصاعد شريحة تستخدم عازمة 27 G الإبرة إلى الصحافة لطيف شريحة أسفل الظهر. كما هو قطع كل شريحة، استخدم ماصة نقل لنقله على منصة في غرفة القابضة حيث أنها قابلة للحياة لمدة تصل إلى 8 ساعات.

3. خارج الخلية الكهربية تسجيلات

1. تركيب شريحة في غرفة تسجيل.
   1. باستخدام ماصة نقل، ضع شريحة الدماغ إلى غرفة تسجيل المغمورة مع perfused ACSF تتدفق في 1-2 مل / دقيقة ويسخن إلى 32 درجة مئوية. وACSF المستخدمة للتسجيلات يختلف عن ذلك في غرفة القابضة كما يتم زيادة المغنيسيوم ²⁺ تركيز من 2 مم إلى 4 مم.
   2. تأمين شريحة مع "القيثارة" (شبه دائري الفولاذ المقاوم للصدأ مع خيوط النايلون تمتد عبر في 2-3 ملم تباعد). مكانالقيثارة بحيث مسارات موازية لCA1. زيادة سرعة نضح إلى 8-10 مل / دقيقة عند 32 ° C.
2. تحت المجهر مكان تشريح القطب تحفيز والقطب تسجيل (الزجاج الكهربائي مليئة الحل تسجيل ACSF) على سطح الطبقة المشععة من CA1 (الشكل 2A). وضع القطب تحفيز أولا ثم وضع القطب تسجيل.
3. تحفيز شافر الضمانات مع 120-150 أمبير السعة و 0.1 مللي ثانية مدتها اختبار النبض ومراقبة مجال آخر مثير متشابك المحتملة (fEPSP) الموجي مما أدى لتحديد صحة شريحة (الشكل 2B). قد تحتاج الأقطاب محفزة وتسجيل ليتم نقلها إلى شريحة حوالي 50-100 ميكرون من سطح شريحة للحصول على fEPSP تسجيل من تسديدة الألياف الصغيرة والسعة الكبيرة. أثار الضمان شافر fEPSPs هي النمطية وتقدم مؤشرا جيدا للصحة شريحة. Hتظهر ealthy شرائح عادة من تسديدة الألياف إلى fEPSP نسبة السعة أقل من 0.3.
4. اعادة تموضع الأقطاب.
   1. باستخدام مجهر تشريح، نقل القطب تحفيز لمنتصف الطبقة المتجهة ونقل القطب تسجيل في طبقة الخلايا الهرمية أقرب إلى القطب تسجيل ممكن كما هو مبين في الشكل 3A. قد تحتاج الأقطاب محفزة وتسجيل لتكون دفعت إلى شريحة حوالي 50-100 ميكرون حتى يتسنى للاستجابة السعة fEPSP إلى 120-150 اختبار أمبير نبض حوالي 1 بالسيارات.
5. توليد اهتزازات γ.
   1. لتوليد اهتزازات γ تحفيز الأنسجة مع قطار 20 × 0.1 ميللي ثانية البقول تسليمها في 200 هرتز. هذا التحفيز كزازي يمكن أن تسفر عن ردود استنساخه عند تسليم كل 5 دقائق.
6. استخدام المعلمات تسجيل التالية.
   1. تحجيم مكاسب إشارة خرج لتتناسب مع نطاق الإدخال الجهدالتناظرية إلى المحول الرقمي. تأكد من أن يستخدم الحد الأقصى المتوقع إشارة رحلة لا تقل عن 30٪ من نطاق الإدخال الجهد. كن حذرا عند وضع المكاسب ليصل إشارات قد مقطع. عرض النطاق الترددي نموذجي اللازمة للتسجيلات ميدانية 500 هرتز مع AC اقتران عند 0.1 هرتز لإزالة الانجراف خط الأساس.
   2. رقمنة لا يقل عن 4 - 5 مرات أسرع من وتيرة زاوية منخفضة لتمرير مرشح لتجنب إشارة التعرج.
7. تحليل البيانات.
   1. تصفية البيانات عالية تمرير في 5 هرتز لإزالة أي تحولات أساسية. تحديد طفرات باستخدام عتبة المشتقة، مع فصل الحد الأدنى الحدث من 10 ميللي ثانية، وهو وقت الحدث نموذجية إلى الذروة وفترة الانحدار من 7 مللي، عتبة ~ 100 فولت / ميللي ثانية، وواد يفصل من 100٪. حساب الكمون مثل الوقت الذي يستغرقه لارتفاع حددت الأول تحدث بعد نهاية قطعة أثرية التحفيز. هذا التحليل يسمح لتوصيف عدد السنابل، الكمون، الفاصل الزمني بين الحدث، والمدة المحسوبة على النحوالتالي:
   2. حساب عدد السنابل كما يتم تحديد العدد الإجمالي للارتفاع في التذبذب لكل الاجتياح.
   3. حساب الكمون التذبذب. لكل التذبذب، وطرح الوقت من ارتفاع حددت الأول من نهاية قطعة أثرية التحفيز.
   4. حساب متوسط ​​الفاصل الزمني بين الحدث (ISI). تحديد الفترة الزمنية بين عدة طفرات الكشف عن والمتوسط.
   5. حساب مدة التذبذب. قياس الوقت بين ارتفاع الكشف الأول والأخير في كل التذبذب.

التحفيز كزازي من الطبقة المتجهة إنشاء قوية وقابلة للتكرار التذبذبات γ (± 2.2 35.4 هرتز)، انظر الشكل 3B. لإثبات أن تم توليد اهتزازات داخل الشبكة المحلية CA1 قطعت المدخلات من CA3 عن طريق قطع شريحة في المنطقة CA2 باستخدام عازمة 32 G الإبرة. لم خصائص التذبذب في شرائح قطع لا تختلف عن شرائح غير المصقول (ع = 0.85؛ قطع شرائح 6.16 ± 1.1 المسامير، ن = 6؛ شرائح تقطيعه 5.89 ± 0.8 المسامير، ن = 6)، مشيرا إلى أن التذبذبات تتولد محليا.

ومن المزايا المهمة لهذا الأسلوب هو استقرار التسجيلات. عندما تم تسليم الكزاز في 5 مين فترات كانت التذبذبات مستقرة لمدة 30 دقيقة على الأقل لأي شريحة معينة (ع = 0.26 لعدد السنابل في 15 دقيقة مقابل 30 دقيقة). هناك التباين بين الشرائح في عدد من المسامير داخل التذبذب وغيرها من المعالم. لددراسات البساط يقترن التجارب يمكن أن يتم ذلك أن الاختلافات في خصائص أساسية هي العوامل طفيفة. لتقلب مقارنات داخل شريحة يمكن أن يكون مصدر قلق، ويمكن التغلب عليها عن طريق المقارنات توفير الطاقة بما فيه الكفاية.

بعد ذلك، تم التحقيق القنوات الأيونية والمستقبلات التي مطلوبة من أجل توليد هذه التذبذبات CA1 γ حفز tetanically. الحصار الدوائي من α-الأمينية-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-isoxazolepropionic حمض (أمبا) مستقبلات مع 20 ميكرومتر 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2،3-ديون (CNQX) (الشكل 4A، B)، GABA A مستقبلات مع 20 ميكرومتر bicuculline (الشكل 4C)، وأنا ح الحالية مع 20 ميكرومتر 4- (N-ايثيل-N-phenylamino) -1،2-ثنائي ميثيل-6- (متيل) كلوريد pyrimidinium (ZD7288) (الشكل 4D)، وT-نوع كا كانت 2+ قنوات مع 100 ميكرومتر ني 2+ (الشكل 4E) كل مستقلة قادرة على الحد من عدد السنابل ولدت(p <0.05؛ CNQX ن = 6؛ bicuculline ن = 7؛ ZD7288 ن = 6؛ ني 2+ ن = 6). لم تطبيق (2R) -amino-5-phosphonopentanoate (AP5، 20 ميكرومتر) لن يؤثر على عدد السنابل (ع = 0.22، ن = 5؛ AP5، 5.9 ± 3.1 المسامير، والسيطرة، 8.3 ± 2.2 المسامير)، مما يوحي بأن لا يشاركون مستقبلات NMDA في الجيل التذبذب γ في هذا الإعداد.

هذا الإعداد هو الأمثل لتحديد نطاق عمل شبكة المخدرات. Retigabine هو دواء مضاد للصرع المستخدمة سريريا التي تفتح قنوات البوتاسيوم ويقلل من الغشاء استثارة 18-20. أنتجت تطبيق حمام من retigabine تخفيض تعتمد على الجرعة في عدد السنابل في ومدة التذبذب (الشكل 5).

الشكل 1. تخطيطي من الجمجمة والمغطي الجلد تظهر موقع تخفيضات لإعادة لحم العجل الدماغ. A1، A2، B و C بمناسبة مواقع التخفيضات التي يجب القيام بها لفتح الجمجمة لإزالة من الدماغ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. التنسيب للتحفيز وتسجيل الأقطاب في CA1 شافر الضمانات للصحة شريحة الاختبار. (A) معارض وضع القطب محفزة (STIM) والقطب تسجيل (التوصية). (ب) وهناك مثال الممثلين fEPSP التي حركها 120 التحفيز أمبير (كرة الألياف تميزت *). الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.

الرقم 4. توصيف الدوائية العلام tetanicallyالتذبذبات ATED γ. (A) تتبع ممثل مما يدل على تأثير CNQX. الرسوم البيانية مما يدل على تأثير (B) CNQX (20 ميكرومتر، ن = 6)، (C) bicuculline (20 ميكرومتر، ن = 7)، (D) ZD7288 (20 ميكرومتر، ن = 6) و (E) ني 2+ (100 ميكرومتر، ن = 6) على عدد من المسامير. وتعرض البيانات والمقارنات المقترنة. * P <0.05، ** p <0.01، و*** P <0.001. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5. الآثار Retigabine على خصائص الشبكة. أمثلة الممثل تظهر نشاط الشبكة تخفيض الاهتزازات التي يسببها (A) في ظروف سيطرة و (B) و <قوي> (C) مع retigabine. ملخص للآثار هو مبين في (D) عدد السنبلة، (E) مدة التذبذب، (F) الكمون إلى بداية التذبذب، و (G) الفاصل بين ارتفاع (ISI). وتعرض البيانات والمقارنات المقترنة. * P <0.05. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.