مقالة منهجية

تنفيذ في المختبر المخدرات المقاومة فحوصات: تعظيم إمكانات لكشف آليات المقاومة ذات الصلة سريريا

DOI:

10.3791/52879

⸱

ديسمبر 9, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1H3 Biomedicine, 2Massachusetts General Hospital

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مقاومة الجراثيم للأدوية إلى العلاجات المستهدفة على نطاق واسع، وضرورة تحديد آليات المقاومة - قبل أو بعد الإصابة السريرية - أمر بالغ الأهمية لتوجيه استراتيجيات إدارة السريرية بديلة. هنا، نقدم بروتوكول لزوجين اشتقاق خطوط المقاوم للأدوية في المختبر مع التسلسل لتسريع اكتشاف هذه الآليات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن العلاجات المستهدفة فعالة في البداية ، إلا أن المقاومة تظهر حتما. تم تطبيق عدة طرق ، مثل التحليل الجيني للعينات السريرية المقاومة ، للكشف عن آليات المقاومة هذه لتسهيل رعاية المتابعة. على الرغم من أن هذه الأساليب أدت إلى اكتشافات ذات صلة سريريا ، إلا أن الصعوبات في الوصول إلى مادة المريض ذات الصلة أو في تفكيك البيانات الجينومية التي تم جمعها من هذه العينات أعاقت بشدة الطريق نحو العلاج. تحقيقا لهذه الغاية ، نصف هنا أداة للاكتشاف السريع التي قد توجه التحسين في علاجات الخط الأول واستراتيجيات الإدارة السريرية البديلة. من خلال اقتران اختيار الأدوية قبل السريرية في المختبر أو في الجسم الحي مع تسلسل الجيل التالي ، من الممكن تحديد الاختلافات الهيكلية الجينومية و / أو تغييرات التعبير الجيني التي قد تكون بمثابة محركات وظيفية للمقاومة. يسهل هذا النهج الظهور التلقائي للتعديلات ، مما يعزز احتمالية ملاحظة هذه الآليات لدى المرضى. في هذا البروتوكول ، نقدم إرشادات لتعظيم إمكانات الكشف عن متغيرات النيوكليوتيدات المفردة التي تدفع المقاومة باستخدام خطوط ملتصقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أدى التوصيف الجزيئي مفصل من الجينوم الورم عن طريق تقنيات التسلسل قوية والأدوات التحليلية تحسن البيانات إلى اكتشاف تغيرات جينية رئيسية في أنواع معينة من السرطان 1،2. تطوير العلاجات المستهدفة التي تستهدف هذه الآفات الوراثية، مثل HER2، BCR-ABL، EGFR وALK، قد تحسنت بشكل ملحوظ نوعية الحياة للمرضى 1،2. ومع ذلك، على الرغم من خصوصية هذا النهج، كانت الاستجابة السريرية لمعظم العلاجات واحدة دون المستوى الأمثل كمقاومة يخرج في نهاية المطاف. مؤخرا، تم إحراز تقدم كبير في فهم الأسس الجزيئية لمقاومة العلاجات المستهدفة. يثير الاهتمام والفضول، فقد أصبح واضحا أن آلية بارزة للمقاومة تتضمن استمرار النشاط المستهدف / المسار. كما مثال على ذلك، مستقبلات الاندروجين (AR) -directed العلاج enzalutamide من سرطان البروستاتا يؤدي إلى إثراء تفعيل الطفرات في AR نفسها، والحفاظ على OUTP-AR يشيرحزب التحرير في وجود المانع 3-5. وقد أدى هذه المعرفة لحملة شرسة ل1) تطوير مضادات الجيل الثالث التي يمكن أن تستمر لقمع كل من WT وظيفة متحولة-AR في محكمة التحكيم الدائمة 3 و 2) تحديد العقد المصب المحتملة للAR الإشارات التي قد تكون مستهدفة للتدخل العلاجي مقاومة للenzalutamide . وبالمثل، ومقاومة للفئات الأخرى من مثبطات مثل تلك التي تستهدف EGFR، BRAF وABL غالبا ما تؤدي إلى حدوث طفرات أن تنشيط الأصلي الإدمان كيناز مسار 1.

مع العلم بأن المقاومة يخرج حتما في معظم المرضى، ووضع نهج لتحقيق على وجه السرعة هذه الآليات للضوء تتيح تطوير علاجات فعالة للمتابعة. نهج واحد والذي يتم استخدامه على نطاق واسع هو تحليل الجينوم الأورام السريرية الحرارية بالنسبة للأورام معالجة ساذجة أو -sensitive لتحديد التخصيب / استنفاد في الآفات الوراثية التي قد تكون قابلة للدسجادة الاكتشاف. على الرغم من وعدها، وهناك نوعان من الالتزامات الرئيسية لهذا النهج الذي يعيق اكتشاف سريع. أولا، الوصول في الوقت المناسب لمواد ورم لاستجوابه الجيني قد يكون بمثابة عقبة كبيرة في الانتقال من العلاج إلى علاج. ثانيا، deconvolution من عدد لا يحصى من الآفات الوراثية في الإعداد مقاومة قد تكون صعبة منذ الأورام يمكن أن تقدم كبير البينية ورمي التجانس 6،7.

في ضوء هذه التحديات، كانت هناك زيادة في الاعتماد على اكتشاف ما قبل السريرية آليات المقاومة. هذا النهج قد تسمح تحديد آليات مقاومة بارزة قبل التجارب السريرية 1 التي يمكن أن توجه استراتيجيات بديلة لإدارة السريرية في المرضى الذين لا يتحملون هذه الآليات إما قبل العلاج أو بعد ظهور المقاومة.

واحدة من هذه الأداة اكتشاف ما قبل السريرية والذي يتم استخدامه على نطاق واسع هو تطبيق مشاركات شاشات رني الوظيفية. للامتحانسبيل، ويتاكر وزملاؤه تطبيق شاشة رني الجينوم على نطاق تحديد تلك الخسارة NF1 تتوسط مقاومة لسلاح الجو الملكي البريطاني ومنظمة مجاهدي خلق مثبطات خلال MAPK حقت تفعيل المسار 8. تم العثور على هذه النتائج لتكون وثيقة الصلة سريريا كما لوحظت الخسارة من وظيفة الطفرات في NF1 في BRAF الخلايا السرطانية -mutant التي هي في جوهرها مقاومة للRAF تثبيط الأورام وسرطان الجلد مقاومة للvemurafenib تفعيل 8. ومع ذلك، على الرغم من نجاح هذا النهج، وغالبا ما يتم تحديد العديد من الأهداف ذات الصلة سريريا، ويفترض بسبب التحيز الخسارة من وظيفة هذا النهج.

في المقابل، أداة أقل انحيازا لاكتشاف ما قبل السريرية آليات المقاومة ينطوي على جيل من خطوط الخلايا المقاومة من خلال التعرض لفترات طويلة لمجمع الفائدة إلى جانب مقرها NGS-التنميط الجيني أو transcriptomic. وقد تم تنفيذ هذا النهج بنجاح من قبل عدة مجموعات لتحديد عفويةواحدة المتغيرات النوكليوتيدات أو التعبير التعديلات المتكررة التي تمكن المقاومة 5،9،10. على سبيل المثال، تم اكتشاف طفرة F876L المتكررة في AR مؤخرا في استنساخ مقاومة في المختبر 3-5 والأورام طعم أجنبي في الجسم الحي 5 قبل تحديد هذه الطفرة في العيادة 4. مؤخرا جدا، بانغ وزملاؤه (2015) 11 يستخدم ClonTracer في اثنين من النماذج ذات الصلة سريريا تبين أن الغالبية العظمى من الحيوانات المستنسخة المقاومة التي تنشأ أثناء التعرض للمخدرات لفترة طويلة كانت جزءا من قبل القائمة حيوانية مما يشير إلى أن الطفرات الأكثر أهمية وظيفيا ومن المرجح بالفعل موجودة مسبقا أن تصبح اختيارها لاختيار 11 خلال.

وعلى النقيض من التنميط الجيني للأورام نوقش في وقت سابق، وهذا النهج فوائد من أقل التجانس كما تستخدم "متجانسة" استنساخ مقاومة للتحليل تسهيل تشريح الجيني أكثر دقة من السائقين المحتملة. Furthermخام، المثير، بالإضافة إلى إمكانية الكشف عن آليات المقاومة، وهذه الطريقة يمكن أن تطبق أيضا على تحديد الآليات الخلوية من العمل والأهداف من الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا تكون هذه المعلومات غير معروف (10). نظرا للمزايا واضحة والاستخدامات المتعددة لهذا النهج، وهنا نقدم بروتوكول تفاصيل التنفيذ الناجح لمثل هذه الشاشة قبل السريرية لتعظيم إمكانات الاكتشافات ذات مغزى سريريا.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تقييم GI 50 لمجمع (ق) من الفائدة

  1. توليد منحنى النمو (ق) للخطوط خلية من الاهتمام لتقييم كثافة البذر المناسبة. رسم عدد الخلايا في نقاط زمنية مختلفة بعد غرس البذور (أيام 2 و 4 و 6 و 8) نسبة إلى اليوم 0. وهذا سيوفر معدل النمو النسبي للخط خلية من الاهتمام وينبغي أن تستخدم لتقييم كثافة البذر الأولية من النوع الذي لم يتم التوصل إلى نقطة التقاء في لوحات 96-جيدا خلال 7 أيام.
  2. مرة واحدة وقد تم تحديد منحنيات النمو، وبذور العدد المناسب من الخلايا في غير شفافة، واضحة أسفل لوحات 96-جيدا في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام خلية لتقييم GI 50. البذور عدد الخلايا استنادا إلى خط الخلية المستخدمة والمحددة في 1.1. عادة، والبذور 3x10 3 خلايا للخطوط الخلايا سريعة النمو مع الوقت تضاعف من ~ 24 ساعة، على سبيل المثال، HCT116.
    1. إعداد لوحة فحص (يوم-1). لوحة الفحص، وخلايا البذور في الكثافة المطلوبة في 100 ميكرولتر من ط سائل الإعلام والثقافةن الآبار مظللة باللون الأزرق (الشكل 1). أبرز الآبار بيضاء تحتوي على وسائل الإعلام فقط.
    2. إعداد لوحة التحكم (يوم 1). لوحة التحكم، والبذور نفس كثافة الخلايا كما في الخطوة 1.2.1 في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافة في لوحة 96-جيدا منفصلة. هذا 'يوم 0' القراءة سوف تساعد في تفسير الطبيعة السامة للخلايا / تثبيط الخلايا من المركبات التي يجري تحليلها (الشكل 2).
  3. في اليوم التالي (يوم 0)، قراءة لوحة التحكم. تتوازن الانارة بقاء الخلية كاشف (cellTiter بالشبكة الركيزة مختلطة مع العازلة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) لRT وتخلط بلطف بواسطة قلب محتويات للحصول على حل متجانسة. إضافة 80 ميكرولتر من كاشف إلى 100 ميكرولتر من خلية / مزيج سائل الإعلام ويهز محتويات لمدة 30 دقيقة للحث على تحلل الخلية.
    1. سجل التألق مع luminometer تعيين لتعرض 0،1-1،0 ثانية وكشف الطول الموجي 560 نانومتر.
  4. إضافة مركبات اختبار (المركباتمن الفائدة) لفحص لوحات (يوم 0). جعل 1: 4 التخفيف المتسلسل للمركبات في DMSO في 200X التركيز النهائي ليصبح المجموع 10 تركيزات (9 التخفيفات التي تحتوي على مركب وDMSO واحد فقط، لوحة المركبة). كنقطة انطلاق الأولية، وتهدف ل200X أقل جرعة من 0.03 ميكرومتر وجرعة أعلى من 2000 ميكرومتر (النهائي حجم 200 ميكرولتر).
  5. إضافة مركبات مخففة متسلسل والمتوسطة لتقديم مزيج مركب المتوسط ​​في 10X تركيز النهائي (نهائي حجم 100 ميكرولتر، لوحة المتوسطة). متجر لوحة المركبة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لاستخدامها في يوم 3 من الفحص. إضافة 10 ميكرولتر من مزيج مركب متوسطة إلى الخلايا في يثلث مثل أن أعلى جرعة هي 10 ميكرومتر (على سبيل المثال، الصفوف B، C و D، يوم 0) (الشكل 1). احتضان لوحات فحص لمدة 3 أيام في 37 ° C. تجاهل لوحة المتوسطة (ق) بعد الاستخدام.
  6. في يوم 3، وإعداد 1X مزيج مركب المتوسط ​​400 ميكرولتر باستخدام لوحات مجمع أعد في 1.4. عكس وحات الفحص لإزالة وسائل الإعلام واتركها حتى تجف على السياراتالمناشف الورقية claved 2-3x لإزالة وسائل الاعلام المتبقية. إضافة مركب / وسائل الإعلام (100 ميكرولتر / جيد) إلى الآبار مظللة باللون الأزرق وإضافة 100 ميكرولتر من وسائل الاعلام إلى محيط الآبار لمنع التبخر (الشكل 1). إعادة احتضان لوحات فحص عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام إضافية.
  7. في يوم 6، وتقييم العدد النسبي للخلايا قابلة للحياة عن طريق إجراء القراءة التلألؤ كما هو موضح في الخطوة 1.3.
  8. استخدام القراءة اليوم 0 لتقييم / الطبيعة السامة ثابت من المركبات. المواد السامة تحفز الخلايا في حين أن عوامل تثبيط الخلايا تحفز اعتقال دورة الخلية. إذا المركب السام (اليوم 6 القراءة أقل من يوم 0 القراءة)، والنظر في اختيار GI 50، وGI 50 × 5 تركيزات لفحوصات مقاومة. ومع ذلك، إذا كان المركب يستحث ركود (مساوية أو أعلى من القراءة D0)، والنظر GI 100 و 100 GI X5 لفحوصات مقاومة (الشكل 2).

2. إعداد المخدرات المقاومة فحوصات

  1. إذا الطرافة العملها عامل تثبيط الخلايا، وخلايا البذور في التقاء 30-40٪ في 150 مم 2 أطباق زراعة الأنسجة (حجم = 30 مل) لفحص المقاومة. إذا كان يعمل مع وكيل السامة، البذور في التقاء 70-80٪.
  2. لخطوط الخلايا التي ترعى لإصلاح عدم تطابق (MMR) آلية سليمة، واحتضان الخلايا من الخطوة 2.1 O / N عند 37 درجة مئوية مع مسرطن N-ايثيل-N-نتروزويوريا (ENU). علاج الخلايا مع 30 ميكرولتر من محلول المخزون من 50 ملغ / مل ENU (تركيز النهائي 50 ميكروغرام / مل) لتعزيز عدم الاستقرار الجيني. لخطوط الخلايا التي لديها خلل MMR (الجداول 2 و 3)، والمعاملة مع ENU أو غيرها من المواد المسرطنة قد لا تكون ضرورية.
    1. لخطوط الخلايا الأخرى، وتحديد نقص MMR وفقا لمعايير NCI باستخدام الصغرية عدم الاستقرار 12، أو بناء على توصيف نشرت باستخدام فحوصات عدم الاستقرار الصغرية أو التنميط الجيني / epigenomic الجينات MMR 13-15.
  3. خلايا تعامل مع مجمع اختبار (ق) منالفائدة في تركيز حددت في الخطوة 1.8. بالنسبة لمركبات شديدة السمية وتسبب موت الخلايا في نموذجي لمدة ثلاثة أيام جدوى فحص 10، مع بدء العلاج بجرعة منخفضة (أي GI 50) وتدريجيا زيادة تركيز (مضاعفات GI 50) من مجمع كل 2-3 أسابيع حتى قوية لوحظ المقاومة. تجديد وسائل الإعلام ويضاعف كل 3 د.
  4. بمجرد الشروع في الاختيار، وتغير وسائل الإعلام / مجمع خلط كل 3-4 أيام حتى تظهر استنساخ المقاومة. المقاومة تعريف تبرز عندما تظهر الخلايا المعالجة أكبر نمو / الجدوى أثناء العلاج من تعاطي المخدرات النسبية للعلاج الحادة من الخلايا السيطرة المعالجة DMSO.

3. عزل الحيوانات المستنسخة خلية واحدة

  1. دراسة طبق ثقافة استخدام على النقيض من المرحلة المجهري (التكبير 40X) لكتل ​​قابلة للحياة الخلايا.
  2. علامة استنساخ مرضية في أسفل الطبق مع قلم الوسم. اختيار الحيوانات المستنسخة التي هي من الحجم المتوسط ​​(المستعمرات الكبيرة قدتنشأ من خلايا متعددة) ومعزولة جيدا من المستعمرات الأخرى. اختيار الحيوانات المستنسخة باستخدام أحد النهجين هو موضح في الخطوة 3.3.
  3. النهج 1: باستخدام pipettor (الشكل 3)
    1. إزالة وسائل الاعلام النمو وشطف مع 1X PBS لإزالة أي خلايا العائمة.
    2. استخدام علامات سوداء كدليل على "اختيار" استنساخ مع طرف الماصة (تعلق على pipettor، P200 يفضل).
    3. استنساخ نقل إلى لوحات 48-جيدا مع 200 ميكرولتر وسائل الإعلام الجديدة (مع تركيز مركب نصف للسماح الانتعاش الأمثل للخلايا).
    4. تسمح للخلايا لاستعادة لمدة 2-3 أيام قبل أن يضيف 200 ميكرولتر وسائل الإعلام الجديدة / تركيز مركب المثالي.
    5. الاستمرار في تغيير وسائل الاعلام / مجمع كل 3-4 أيام والاستمرار في توسيع الحيوانات المستنسخة.
  4. نهج 2: عن طريق الاستنساخ أقراص (الشكل 3)
    1. بمناسبة استنساخ كما هو موضح في الخطوة 3.2.
    2. وضع 3 مم استنساخ الأقراص في صحن 10 سم زراعة الأنسجة التي تحتوي على 5 مل من 0.25٪ رrypsin-EDTA لمدة 2 دقيقة.
    3. وسائل الإعلام نضح من صحن يحتوي استنساخ المقاومة وتراكب استنساخ مع التربسين غارقة أقراص الاستنساخ باستخدام ملقط معقم يمكن التخلص منها.
    4. يترك لمدة 1-2 دقيقة، اعتمادا على مدى سهولة استنساخ رفع قبالة لوحات، في 37 ° C الحاضنة.
    5. التقاط استنساخ الأقراص باستخدام ملقط معقم ونقل إلى لوحات 48-جيدا مع وسائل الإعلام 200 ميكرولتر الطازجة ونصف تركيز مركب.
    6. ماصة صعودا وهبوطا بلطف لإزاحة الخلايا من أقراص الاستنساخ واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية (ترك استنساخ الأقراص في الآبار).
    7. في صباح اليوم التالي، وإزالة الأقراص الاستنساخ من لوحات 48-جيدا وتجديد الآبار مع 200 ميكرولتر جديدة وسائل الاعلام / مجمع (تركيز مركب نصف المثالي).
    8. بعد ثلاثة أيام، وتجديد وسائل الإعلام مع التركيز المثالي للمجمع.
    9. الاستمرار في تغيير وسائل الإعلام / مجمع كل 3-4 أيام والاستمرار في توسيع الحيوانات المستنسخة.

4. تقييم درجة Resistance من النسخ متفرقة

  1. مرة واحدة يتم توسيع 10-20 المستعمرات، وتوليد GI 50 منحنيات كما هو موضح في الخطوة 1 إلى تقييم درجة المقاومة.
  2. تشمل دائما إلى سكان تحكم تعامل مع DMSO أثناء عملية الاختيار. فمن المحتمل جدا أن الطيف المقاومة ستكون كبيرة (بعض تظهر الجزئي حين أن البعض الآخر تظهر مقاومة كاملة). جمع عدد قليل من الحيوانات المستنسخة من كل من هذه الفئات كآلية للمقاومة قد تختلف بين المجموعتين.

5. الجيل التالي من التسلسل

  1. تدور باستمرار 2 مليون خلية (مراقبة واستنساخ مقاومة) (500 x ج لمدة 5 دقائق) في 15 مل قارورة المخروطية لكلا gDNA وجمع الحمض النووي الريبي (لذلك 2 × 2 مليون دولار).
  2. يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X وتجميد الكريات في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للعزل.
  3. استخدام عدة استخراج التجارية لعزل الحمض النووي الريبي أو gDNA وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
  4. إرسال عينات للجيل المقبل من التسلسلباستخدام بروتوكول البائع 10.

6. المعلوماتية الحيوية تحليل العينات (كامل exome التسلسل)

  1. Preprocess تسلسل البيانات وفقا للممارسة-DNA وما يليها خط أنابيب أفضل 16.
    1. رسم خريطة لجميع يقرأ مرجع GRCh37 جينوم الإنسان باستخدام BWA 17. تحويل غير مضغوط التحالفات SAM مهيأ إلى تنسيق BAM مضغوط مع Samtools 18. نوع التحالفات التي تنسق مع Samtools. إضافة مجموعات القراءة باستخدام بيكار. (للBWA معين، Samtools وبيكار أوامر، انظر النص التكميلي 1، خطوط 1-4)
    2. أجعل كل التكرارات يقرأ باستخدام الأمر MarkDuplicates من أداة بيكار مجموعة 19. مؤشر هذا الملف مع Samtools. (النص التكميلي 1، خطوط 5-6)
    3. للحد من قواعد متطابقة في جميع يقرأ، إعادة تنظيم يقرأ محليا في مناطق إيواء الإدراج صغيرة أو الحذف باستخدام realigner INDEL 20. (النص التكميلي 1، خطوط 7-8)
    4. لزيادة تحسين الدقهذ من الدعوة البديل، إعادة ضبط تجريبيا نقاط جودة قاعدة باستخدام نوعية قاعدة أداة النتيجة إعادة تقويم. أداة معايرة جودة قاعدة ينبغي ألا الصحيحة نقاط الجودة الأولية، ولكن أيضا أن تأخذ بعين الاعتبار covariation من العديد من المزايا، بما في ذلك مجموعة قراءة، دورة آلة، موقف القاعدة، وسياق ثنائي النوكليوتيد (القواعد الحالية السابقة +). توليد BAM تعديلها مع PrintReads بيكار. (للحصول على أوامر معينة لهذه الخطوة، انظر النص التكميلي 1، خطوط 9-10)
    5. كرر الخطوات 6.1.1 خلال 6.1.4 (النص التكميلي 1، خطوط 1-10) لكل عينة التسلسل.
  2. تحديد الاختلاف النوكليوتيدات واحد (SNV) في كل استنساخ باستخدام البديل يقترن يدعو tool19، 21-23. لكل استنساخ التسلسل، تشغيل البديل يقترن يطالب باستخدام استنساخ الوالدية بوصفها يقابل "طبيعية". (النص التكميلي 1، السطر 11)
  3. تصفية المتكررة، المتغيرات ذات جودة عالية والاستعداد لالشرح مع أداة الشرح البديل 24. Deprioritize زارة شؤون المحاربين القدامىriants يست شائعة في جميع الحيوانات المستنسخة مقاومة. (انظر R النصي في نص التكميلي 2)
  4. علق المتغيرات مع أداة الشرح 25، 26. العديد من الأدوات البديل الشرح لها التطبيق على شبكة الإنترنت المصاحب السماح البيانات التي يتم تحميلها ومعالجتها من قبل الملقم البعيد.
  5. استخدام أداة التنبؤ تأثير وظيفي 27-29 إعطاء الأولوية لتلك المتغيرات وتوقع وجود تأثير وظيفي عال. مثل المتغير الشرح، تتوفر للتنبؤ تأثير وظيفي من خلال واجهة على شبكة الإنترنت العديد من الأدوات.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتعظيم إمكانيات لاكتشاف السائقين وظيفية رئيسية من المقاومة، حدد استنساخ خلية واحدة للتوسع والاختبار المظهرية والتسلسل. كما هو موضح في الشكل 4A، خلايا HCT116 علاجها لفترة طويلة مع مجمع السامة للخلايا # 1 أدى إلى ظهور عفوية من الحيوانات المستنسخة المقاومة التي استمرت في النمو خلال فترة العلاج (الدوائر السوداء متقطع). كان قد تم اعتقالهم هذه الحيوانات المستنسخة باستخدام نهج # 1 أبرزت في الشكل (3) وتوسعت بعد ذلك لتحليل المظهري. كما هو مبين في الشكل 4B، استنساخ مقاومة 1-3 أبدت جميع مقاومة كبيرة لمجمع # 1 والوثيق مجمع التناظرية # 2 (أكبر الجدوى / النمو)، في حين أظهرت جميع الحيوانات المستنسخة حساسية للا علاقة لها velcade مجمع السامة للخلايا. بعد تأكيد المقاومة المظهري، وgDNA معزولة وقدمت لتحليل تسلسل كامل exome. تم تطبيق أدوات المعلوماتية الحيوية لتضييق في تلك المتغيرات على هيكليةهي 1) المتكررة و2) لديها القدرة للتأثير وظيفي (الشكل 5A). وأكد المتغيرات الهيكلية التي اجتمعت هذين المعيارين بواسطة أداة التسلسل مستقلة. كما هو موضح في الشكل 5B، طفرة مغلطة متخالف التي تم تحديدها باستخدام وقد أكد كامل exome تسلسل باستخدام طريقة التسلسل سانجر (لوحة العلوي، وتسلسل WT؛ اللوحة السفلى، وتسلسل متحولة). عقب تأكيد تسلسل، وكان خط الخلية الوالدية في الأصل تستخدم لفحص مقاومة وراثيا للتعبير عن كدنا] متحولة إلى تأكيد وظيفيا دور الطفرة. كما هو موضح في الشكل (6)، في حين overexpression من وWT كدنا] فشل في منح المقاومة، واضطر تعبير عن كدنا] متحولة الممنوحة بشكل ملحوظ مقاومة المظهرية لمجمع رقم 1، مما يؤكد الدور الوظيفي لهذا الاختلاف الهيكلي كمحرك للمقاومة. وترد جميع الكواشف المستخدمة في هذه التجربة في الجدول 1 ترونج>.

figure-results-1
الشكل 1. تخطيط فحص ومراقبة لوحات. الظل الأزرق والآبار العلاج المركب. الظل الأبيض والمتوسط ​​فقط. مركبات مخففة متسلسل 1: 4 وتدار في يثلث (BD أو EG). 2 مركبات يمكن تطبيقها في لوحة.

figure-results-2
الشكل 2. منحنيات الجدوى التمثيلية. يمثل الخط الأحمر المنقط اليوم 0 القراءة. المحور السيني يشير إلى زيادة جرعة من مركب إلى اليمين والمحور الصادي يمثل بقاء نسبة إلى آبار المراقبة DMSO. GI 100 = الجرعات المستخدمة لتحقيق 100٪ إعاقة النمو. GI 50 = الجرعة المستخدمة للحد من قابلية إلى 50٪ من السيطرة DMSO.

_upload / 52879 / 52879fig3.jpg "/>
الشكل 3. نهجين لاختيار الحيوانات المستنسخة مقاومة للتوسع. نهج 1- استخدام pipettor لالتقاط ونقل الحيوانات المستنسخة واضحة المعالم لوحات 48-جيدا. غارقة التربسين- نهج 2- استخدام أقراص الاستنساخ لرفع استنساخ ونقل إلى لوحات 48-جيدا.

figure-results-3
الرقم 4. التأكيد المقاومة التي تحققت لاستنساخ HCT116 إلى تفاقم # 1 في المختبر. (A) مجمع # ظهرت استنساخ HCT116 المقاوم لل1 التالية مستمرة اختيار ثلاثة أسابيع. تم اختبار (B) قابلية السيطرة ومقاومة الحيوانات المستنسخة بعد العلاج 72 ساعة مع مركبات مختلفة. مجمع رقم 2 هو التناظرية وثيقة من مجمع # 1. وقد استخدم Velcade كعامل السيطرة السامة للخلايا. وتظهر البيانات كمتوسط ​​+ الانحراف المعياري من ثلاثة مكررات البيولوجية.

EP-together.within صفحة = "دائما"> figure-results-4
الرقم 5. تحديد فريدة من نوعها، وتحور المتكررة (المتغيرات النووية المنفردة، SNVs) في الجين A في مجمع # استنساخ HCT116 المقاوم لل1. التدفق (A) العمل على تحديد SNVs موجودة في جميع الحيوانات المستنسخة المقاومة وتوقع أن يكون لها تأثير وظيفي عال بواسطة MutationAssessor. (B) تأكيد من طفرة في الجين A من قبل سانجر تسلسل.

figure-results-5
الرقم 6. إعادة التعبير عن تحور الجين A المقاومة الممنوحة للتفاقم # 1 في المختبر. تم اختبار الجدوى من خطوط الخلايا HCT116 المهندسة بعد العلاج 72 ساعة مع مجمع # 1. خطوط الخلايا الطافرة-HCT116 WT أو يعبرون عن ثابت WT أو cDNAs متحولة من جين A، على التوالي. وتظهر البيانات كما هو متوسط ​​+ الانحراف المعياري سو ثلاثة مكررات البيولوجية.

اسم عينة الأحماض الأمينية الأنسجة الابتدائية Zygosity
C-33-A p.E768fs * 44 عنق الرحم متخالف
C-33-A p.S860 * عنق الرحم متخالف
CML-T1 ص؟ haematopoietic_and_lymphoid_tissue متماثل
CP66-MEL p.C822F بشرة متخالف
CTV-1 p.0؟ haematopoietic_and_lymphoid_tissue متماثل
EFO-27 p.Q130fs * 2 مبيض متخالف
EFO-27 ص؟ مبيض متخالف
HCC2218 p.E467K ثدي متخالف
J-RT3-T3-5 p.R711 * haematopoietic_and_lymphoid_tissue متماثل
LNCaP ص؟ البروستات متماثل
لوفو ص؟ الأمعاء الغليظة متماثل
MOLT-13 p.R711 * haematopoietic_and_lymphoid_tissue متماثل
NALM-6 ص؟ haematopoietic_and_lymphoid_tissue متماثل
NCI-H630 p.R680 * الأمعاء الغليظة متخالف
SKUT-1 p.L787fs * 11 بطانة الرحم متماثل
SKUT-1B رر787fs * 11 بطانة الرحم متماثل
SUP-T1 ص؟ haematopoietic_and_lymphoid_tissue متماثل

الجدول 1. MSH2 خطوط الخلايا -mutated. خط الخلية (اسم العينة)، استبدال الأحماض الأمينية، وأشارت النسب المنشأ وzygosity.

اسم عينة الأحماض الأمينية الأنسجة الابتدائية Zygosity
CCRF-CEM p.R100 * haematopoietic_and_lymphoid_tissue متخالف
CCRF-CEM ص؟ haematopoietic_and_lymphoid_tissue متخالف
CW-2 p.Y130fs * 6 الأمعاء الغليظة متماثل
DU-145 ص؟ متماثل
GR-ST ص؟ haematopoietic_and_lymphoid_tissue متماثل
HCT-116 p.S252 * الأمعاء الغليظة متماثل
IGROV-1 p.S505fs * 3 مبيض متماثل
MN-60 ص؟ haematopoietic_and_lymphoid_tissue متماثل
NCI-SNU-1 p.R226 * معدة متماثل
P30-OHK ص؟ haematopoietic_and_lymphoid_tissue متماثل
PR-ميل ص؟ بشرة متماثل
REH ص؟ haematopoietic_and_lymphoid_tissue
SK-OV-3 p.0؟ مبيض متماثل
SNU-1544 p.S2L الأمعاء الغليظة متخالف
SNU-1746 p.E523K الأمعاء الغليظة متماثل
SNU-324 p.C233R بنكرياس متخالف
SNU-324 p.V384D بنكرياس متخالف
SNU-478 p.V384D بنكرياس متخالف
البروستات متماثل

الجدول 2. MLH1 خطوط الخلايا -mutated. خط الخلية (اسم العينة)، استبدال الأحماض الأمينية، وأشارت النسب المنشأ وzygosity.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اختيار خط الخلية (ق): توصيف الدولة الجينية وعدم الاستقرار الجيني

مما لا شك فيه، فإن العامل الأكثر أهمية واحد في الكشف عن آليات المقاومة ذات الصلة سريريا بنجاح هو اختيار خط الخلية الأولية. وينبغي النظر عاملين. أولا، تهدف إلى تحديد خط الخلية (ق) من نفس النسب / سلالة إيواء الصفات الوراثية المميزة لهذا المرض (على سبيل المثال، BRAF V600E في سرطان الجلد). سوف استجواب البيانات transcriptomic وطفرة المتاحة علنا لكل من خطوط الخلايا 30-32 والأورام الأولية / ورم خبيث لمجموعة متنوعة من المؤشرات 33،34 تسهيل عملية الاختيار. على الرغم من تحديد خطوط الخلايا مع تغيرات جينية ذات الصلة سريريا مثالية، في بعض الحالات قد لا يكون هذا ممكنا بسبب عدم وجود خطوط الخلايا المتاحة أو ممكنا بسبب عوامل مثل صعوبة وطول عملية الفرز.

> وفيما يتعلق النقطة المذكورة أعلاه، والعامل الثاني للنظر ثم خلال اختيار خط الخلية هو سهولة أو جدوى المقاومة الفحص باستخدام الخط المطلوب. على سبيل المثال، يمكن لعوامل مثل انتشار ومعدلات الطفرة الجوهرية تؤثر بشكل كبير على سرعة الاكتشاف. تحقيقا لهذه الغاية، خطوط الخلايا يمكن استخدامها مع حركية النمو أسرع ونقص في الآليات DNA MMR على أمل أن ظهور المقاومة العفوية يمكن تسريع 35. استنادا إلى قاعدة بيانات الكونية وجود عدة خطوط الخلايا مرشح يعانون من نقص في واحد من اثنين تحور الجينات كثيرا MMR، MSH2 أو MLH1 (الجداول 2 و 3). بدلا من ذلك، إذا خطوط الخلايا من الفائدة لا وجود عيوب واضعة في MMR، العلاج حادة مع المطفرة الفيزيائية والكيميائية أو DNA التفاعلية مثل وكيل مؤلكل N -ethyl- N -nitrosourea (ENU) يمكن استخدامها لتعزيز عدم الاستقرار الجيني. على الرغم من أن كلا النهجين قد ق كبيرHORTEN الوقت لتحقيق استنساخ المقاومة ومتابعة التسلسل، ينبغي إجراء اختبار وظيفي صرامة على الجينات المرشحة إلى عدد أكبر من غير وظيفية، من المرجح أن تظهر الطفرات الركاب. SNVs يمكن أن تكون رتبة أمر لتعظيم فرص لتحديد الطفرات ذات الصلة وظيفيا. أولا، واختيار تلك الطفرات التي المتكررة في استنساخ مستقلة سيزيد من احتمال هذه الطفرات هي دوافع المقاومة. في حال لم يتم تحديد الطفرات المتكررة، مع التركيز على SNVs التي تتلاءم مع آلية عمل الدواء (على سبيل المثال، الهدف المخدرات أو المستجيب المصب يعرف الهدف المخدرات) قد تكون ذات مغزى. في نهاية المطاف، ومعيار الذهب هو دائما تقييم تجريبي لنشاط المقاومة التي تمنح للSNVs مرشح خارج الرحم التعبير كدنا] في الخلايا الأبوية الحساس للأدوية.

الحمض النووي RNA مقابل التسلسل

تم إنشاء استنساخ مرة واحدة مقاومة، DNA و / أو RNAيمكن أن تكون متسلسلة حسب الحاجة. تسلسل الحمض النووي، إما exome أو كامل تسلسل الجينوم، سيسمح تحديد سلالة الجرثومية وجسدية المتغيرات، مثل تعدد الأشكال، indels ونسخ عدد المتغيرات. في حين أن أكثر ودية من حيث التكلفة exome التسلسل يركز على توليد يقرأ من مناطق الترميز المعروفة، وكامل الجينوم التسلسل توليد البيانات تسلسل للجينوم بأكمله التي قد تسهل التعرف على الطفرات في العناصر غير الترميز مثل القدرة أو miRNAs 36. ومع ذلك، لأنه لا يقاس بيانات التعبير الجيني خلال تسلسل الحمض النووي، فمن الصعب التنبؤ الذي تحور (ق) من المرجح أن يكون سائق وظيفية. في هذا الصدد، وتسلسل الحمض النووي الريبي، على الرغم من أن أكثر تكلفة، ويقدم هذه الميزة. حقيقة أن الدعوة طفرة يتم تنفيذ فقط على الأنواع RNA أعرب يعزز احتمال تحور الفائدة قد يكون سائق وظيفية. بالإضافة إلى السماح لمسح أكثر تركيزا من الطفرات لمتابعة التجارب الفنية وتسلسل الحمض النووي الريبي أيضاتقدم ميزة إضافية تتمثل في القدرة على تحديد التعديلات التعبير الجيني، الربط البديلة والأنواع RNA خيالية جديدة، بما في ذلك اندماج الجينات التي قد تخدم أيضا السائقين قوية اعتبارا من المقاومة.

خط أنابيب المعلوماتية الحيوية

يتم توفير أوامر سبيل المثال لأغراض التوضيح، ولكن لا وثائق أكثر تفصيلا والبرامج التعليمية المتاحة من معهد برود 16 وينبغي قراءتها جيدا قبل البدء في تحليل NGS. مصممة الأوامر التالية للبيئة قذيفة UNIX على نظام فيه جميع الأدوات والبيانات المرجعية تم مثبتة مسبقا. هذه الأوامر أيضا تحمل ملفات FASTQ تحتوي على تسلسل إقران نهاية يقرأ من عينتين، واسمه "الدية" و "مقاومة"، وردت من البائع وضعها في الدليل "بيانات". في معظم الحالات يجب أن تتكيف هذه الأوامر أو الأمثل لتطبيق معين باستخدام إضافي وسيطة سطر الأوامرuments (على سبيل المثال، مضيفا "-t 8" إلى الأمر التحالف يتيح عملية مؤشرات في 8 النوى CPU). يجب أن تكون في كثير من الأحيان إضافة مجموعات القراءة (الذي تعيين التحالفات لعينات بيولوجية)، إلى ملفات BAM حتى إذا كان هناك نموذج واحد فقط لكل ملف بام، من أجل الامتثال لمتطلبات تنسيق ملف لأدوات معينة. قراءة المعلمات مجموعة RGID، RGSM، RGPL، RGPU، وRGLB يمكن أن تكون السلاسل التعسفية واصفا اسم العينة، منصة التسلسل، واستراتيجية المكتبة.

في المختبر مباراة في الجسم الحي المقايسات

على الرغم من أن عدة آليات المقاومة التي تم تحديدها عن طريق الانتقاء في المختبر وقد تم التحقق من أن تكون ذات صلة سريريا، هناك احتمال أن آليات قد لا تكون الآليات ذات الصلة أو الغالبة من المقاومة السريرية. وأحد أسباب ذلك يمكن أن تشمل دورا أساسيا للبيئة الصغرى في قيادة المقاومة للعلاج، وهو المكون الذي يخلو في بروتوكول تجريبي / إعداد دiscussed حتى الآن. في الواقع، وقد أظهرت العديد من الدراسات أن العوامل المضادة للسرطان التي هي قادرة على قتل الخلايا السرطانية وتصبح غير فعالة عندما الخلايا السرطانية يتم تربيتها في وجود خلايا انسجة يعني الآليات الفطرية المقاومة التي يمنحها سدى 37،38. لتحديد هذه الآليات المقاومة المكتسبة التي يسببها سدى، يمكن للمرء أن ينظر في أداء في المختبر شارك في الثقافة أو في فحوصات مقاومة الورم الجسم الحي. منذ الفحص السابق معقد جدا، وكثير لجأت إلى توليد xenografts الورم المقاوم للأدوية لمعالجة الدور المحتمل للسدى في قيادة المقاومة. وقد كشفت هذه الدراسات سواء متطابقة 5 وفريدة من نوعها 39 آليات المقاومة بالنسبة للاختيار في المختبر، مما يعني أن سدى قد تلعب بالفعل دورا في هذا الأخير. ومع ذلك، لا بد من أن تضع في اعتبارها طول الوقت قد يستغرق لتوليد مثل هذه الأورام مقاومة وتعقيد متابعة الجيني تحليل complexitieالصورة بسبب عدم تجانس الجزيئية والخلوية داخل ورمي.

تحديد الهدف

بالإضافة إلى الكشف عن آليات المقاومة للأدوية، ويمكن أيضا أن تطبق هذا النهج التنميط الجيني استنادا NGS لتحديد أهداف الخلوية تحقيقات الكيميائية. تاريخيا، وقد استخدمت أساليب مشاركات متعددة لتحديد الآليات الخلوية من العمل والأهداف للمواد الكيميائية منخفضة الوزن الجزيئي مع الأنشطة البيولوجية، بما في ذلك تنقية تقارب إلى جانب البروتينات الكمية والأساليب الجينوم الخميرة، رني الفرز، والاستدلال الحسابي النهج 40. امتدادا لتوضيح آليات المقاومة للأدوية باستخدام استنادا NGS-التنميط الجيني أو transcriptomic من السكان الخلية مقاومة ظاهريا، وتحديد الاختلافات فريدة المتكررة النووية المنفردة (SNVs) أو التعديلات التعبير التي تمكن المقاومة يمكن أن تقدم نظرة ثاقبة أهداف الخلوية الوظيفية للمركبات. تويستند على مفهوم أن مجموعة فرعية من آليات المقاومة لوحظ قد تنطوي على الطفرات المتكررة في الجينات التي تشفر بروتين الأهداف المباشرة للجزيء صغير. في الآونة الأخيرة، التحقق من صحة عدة تقارير الأداة المساعدة لهذا النهج، ولا سيما من خلال الجمع بين مع المناهج الأخرى بما في ذلك على نطاق واسع خط الخلايا السرطانية حساسية التنميط، لكشف أهداف الخلوية الصغيرة جزيء تحقيقات 9،10.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتدفع رسوم النشر لهذا المقال الذي H3 الطب الحيوي.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يعرب عن تقديرهم لزملائنا في H3 Biomedicine على ملاحظاتهم أثناء إعداد المخطوطة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
48 بئر لوحاتفيشر Scientific07-200-86 توسيع المستنسخة
96 بئر ألواحفيشر Scientific07-200-588توليد منحنيات GI50< / sub>
CellTiter-GloPromegaG7572اختبار الجدوى
أقراص الاستنساخ (3 مم)SigmaZ374431التقاط المستنسخة
ملقط معقمUnomedicalDF8088Sالتقاط المستنسخة
RNeasy Plus طقم استخراج الحمض النووي الريبيQiagen74134عزل الحمض النووي الريبي
للدم والأنسجة DNطقم استخراج DeasyQiagen69581عزل gDNA
GATKThe Broad InstituteIndel realigner
MuTectThe Broad Instituteأداة استدعاء متغير
Oncotatorالتعليقات التوضيحية المتغيرةللمعهد
الواسع MutationAccessorThe Broad أداة التنبؤ بالأثر الوظيفي للمعهد
مزدوج أداة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sellers, W. R. A blueprint for advancing genetics-based cancer therapy. Cell. 147 (1), 26-31 (2011).
  2. Housman, G., et al. Drug resistance in cancer: an overview. Cancers (Basel). 6 (3), 1769-1792 (2014).
  3. Balbas, M. D., et al. Overcoming mutation-based resistance to antiandrogens with rational drug design. Elife. 2, e00499(2013).
  4. Joseph, J. D., et al. A clinically relevant androgen receptor mutation confers resistance to second-generation antiandrogens enzalutamide and ARN-509. Cancer Discov. 3 (9), 1020-1029 (2013).
  5. Korpal, M., et al. An F876L mutation in androgen receptor confers genetic and phenotypic resistance to MDV3100 (enzalutamide). Cancer Discov. 3 (9), 1030-1043 (2013).
  6. Lawrence, M. S., et al. Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes. Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).
  7. Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
  8. Whittaker, S. R., et al. A genome-scale RNA interference screen implicates NF1 loss in resistance to RAF inhibition. Cancer Discov. 3 (3), 350-362 (2013).
  9. Wacker, S. A., Houghtaling, B. R., Elemento, O., Kapoor, T. M. Using transcriptome sequencing to identify mechanisms of drug action and resistance. Nat Chem Biol. 8 (3), 235-237 (2012).
  10. Adams, D. J., et al. NAMPT Is the Cellular Target of STF-31-Like Small-Molecule Probes. ACS Chem Biol. 9 (10), 2247-2254 (2014).
  11. Bhang, H. E., et al. Studying clonal dynamics in response to cancer therapy using high-complexity barcoding. Nat Med. 21 (5), 440-448 (2015).
  12. Boland, C. R., et al. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res. 58 (22), 5248-5257 (1998).
  13. Heinen, C. D., Richardson, D., White, R., Groden, J. Microsatellite instability in colorectal adenocarcinoma cell lines that have full-length adenomatous polyposis coli protein. Cancer Res. 55 (21), 4797-4799 (1995).
  14. Yamada, N. A., Castro, A., Farber, R. A. Variation in the extent of microsatellite instability in human cell lines with defects in different mismatch repair genes. Mutagenesis. 18 (3), 277-282 (2003).
  15. Ahmed, D., et al. Epigenetic and genetic features of 24 colon cancer cell lines. Oncogenesis. 2, e71(2013).
  16. GATK. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: https://www.broadinstitute.org/gatk/guide (2015).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. Picard. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: http://broadinstitute.github.io/picard (2015).
  20. McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20 (9), 1297-1303 (2010).
  21. Cibulskis, K., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
  22. Larson, D. E., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
  23. Koboldt, D. C., et al. VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing. Genome Res. 22 (3), 568-576 (2012).
  24. Oncotator. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: https://www.broadinstitute.org/oncotator (2015).
  25. Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Res. 38 (16), e164(2010).
  26. Cingolani, P., et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly. 6 (2), 80-92 (2012).
  27. Reva, B., Antipin, Y., Sander, C. Predicting the functional impact of protein mutations: application to cancer genomics. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
  28. Ng, P. C., Henikoff, S. SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3812-3814 (2003).
  29. Adzhubei, I., Jordan, D. M., Sunyaev, S. R. Predicting functional effect of human missense mutations using PolyPhen-2. Curr Protoc Hum Genet. Chapter 7, Unit 7.20(2013).
  30. Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
  31. Abaan, O. D., et al. The exomes of the NCI-60 panel: a genomic resource for cancer biology and systems pharmacology. Cancer Res. 73 (14), 4372-4382 (2013).
  32. Forbes, S., et al. Cosmic 2005. Br J Cancer. 94 (2), 318-322 (2006).
  33. Shah, S. P., et al. The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple-negative breast cancers. Nature. 486 (7403), 395-399 (2012).
  34. Behjati, S., et al. Recurrent PTPRB and PLCG1 mutations in angiosarcoma. Nat Genet. 46 (4), 376-379 (2014).
  35. de las Alas, M. M., Aebi, S., Fink, D., Howell, S. B., Los, G. Loss of DNA mismatch repair: effects on the rate of mutation to drug resistance. J Natl Cancer Inst. 89 (20), 1537-1541 (1997).
  36. Kotani, A., et al. A novel mutation in the miR-128b gene reduces miRNA processing and leads to glucocorticoid resistance of MLL-AF4 acute lymphocytic leukemia cells. Cell Cycle. 9 (6), 1037-1042 (2010).
  37. Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487 (7408), 500-504 (2012).
  38. Yang, X., Sexauer, A., Levis, M. Bone marrow stroma-mediated resistance to FLT3 inhibitors in FLT3-ITD AML is mediated by persistent activation of extracellular regulated kinase. Br J Haematol. 164 (1), 61-72 (2014).
  39. Arora, V. K., et al. Glucocorticoid receptor confers resistance to antiandrogens by bypassing androgen receptor blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
  40. Schenone, M., Dancik, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GI 50

مقالات ذات صلة