مقالة منهجية

تصور miniSOG معلم البروتينات إصلاح الحمض النووي في الجمع مع الكترون طيفية تصوير (ESI)

9.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52893

⸱

سبتمبر 24, 2015

 ,  , 
1Department of Oncology, Faculty of Dentistry and Medicine, University of Alberta

في هذه المقالة

ملخص

< p class = 'jove_content'> يمكن للتصوير الطيفي الإلكتروني تصوير وتمييز الحمض النووي عن البروتين بدقة نانومتر. يمكن دمجه مع نظام miniSOG ، القادر على تسمية البروتينات الموسومة على وجه التحديد في عينات المجهر الإلكتروني الناقل. نوضح استخدام هذه التقنيات باستخدام بؤر إصلاح كسر مزدوجة الخيط كمثال.

الملخص

وكانت حدود لقرار بصري وتحدي تحديد السكان بروتين معين في المجهر الإلكتروني انتقال العقبات في علم الأحياء الخلوي. العديد من الظواهر لا يمكن تفسيره في المختبر تحليل نظم مبسطة وتحتاج المعلومات الهيكلية إضافية في الموقع، وخاصة في نطاق بين 1 نانومتر و 0.1 ميكرون، من أجل أن تكون مفهومة تماما. هنا، والتصوير الطيفي الإلكترون، وهي تقنية المجهر الإلكتروني النافذ الذي يسمح رسم الخرائط في وقت واحد لتوزيع البروتينات والأحماض النووية، وعلامة التعبير، miniSOG، يتم الجمع بين لدراسة بنية وتنظيم DNA مزدوج الجديلة إصلاح كسر البؤر.

المقدمة

وعلى الرغم من التقدم الكبير في المجهر الضوئي خلال السنوات الأخيرة 1، خلية علماء الأحياء لا تزال تعاني من فجوة في القرار. هذا يحد من فهم العلاقات هيكل الوظائف في العمليات الخلوية الأساسية التي تنطوي على تفاعل منسق بين المجمعات الجزيئات (على سبيل المثال، في إعادة لونين، وإصلاح DNA، RNA النسخ والتكرار DNA). على الرغم من المجاهر الإلكترونية الإرسال (TEM) ق تقديم القرار المطلوب، فقد كان تحديا لتعريف هذه العمليات من الناحية الهيكلية بسبب عدم القدرة على تسمية بروتينات معينة في حين يجري أيضا قادرة على تحديد التركيب الكيميائي الحيوي للهياكل تصور. في غياب الأغشية الداخلية للمساعدة في التفريق الهياكل النووية، كانت نواة تحديا من نوع خاص. الإلكترون الطيفية التصوير (ESI) يحل بعض هذه القيود من خلال السماح للكشف في وقت واحد والتفريق بين DNA، RNA، والبروتوكول الاضافيهياكل النووية 2-5 عين المستندة إلى

الإلكترون التصوير الطيفي:

من أجل خريطة توزيعات عنصري في حساسية عالية ودقة في المجهر الإلكتروني، يمكن للمرء استخدام مطياف التصوير التي يختار الإلكترونات التي تشتتت inelastically من خلال التفاعل مع الإلكترونات قذيفة الداخلية عنصر في العينة 6. بسبب فقدان كميات عنصر معين من الطاقة نتيجة للتأين الذرات في العينة، وهذه الإلكترونات يمكن فصلها وتصور باستخدام مطياف التي يتم تركيبها على المجهر الالكتروني. وهكذا، تحليل الطيف من الإلكترونات التي تفاعلت مع العينة يكشف عن معلومات نوعية وكمية عن التركيب العنصري للعينة 7. تم العثور على الإلكترونات التي لا تفقد الطاقة عندما تمر العينة في "عدم الخسارة الذروة" من فقدان الطاقة الإلكترونالطيف. يرتبط وفرة من هذه الإلكترونات إلى الكتلة والكثافة وسمك العينة، وتتألف من الإلكترونات التي تمر من خلال عينة من دون الاصطدام مع العينة أو فقدان الطاقة أثناء مرورها من خلال العينة. يمكن أن تكون هذه المعلومات مفيدة لتقدير المطلق للأعداد ذرات عنصر معين موجود في العينة 8.

منذ العينات البيولوجية تتكون في معظمها من العناصر الخفيفة التي تحرف سيئة الإلكترونات في شعاع حادثة TEM، وأساليب تلطيخ باستخدام أملاح المعادن الثقيلة يجب أن تطبق من أجل توليد التباين في العينة. عدم وجود خصوصية لمعظم هذه العوامل المتناقضة وعدم القدرة على تصور وصمة عار أكثر من حيث خصوصية ممكنة قد حد من قيمة المجهر الإلكتروني التقليدية في دراسة النواة. ESI له مزايا هامة على TEM التقليدية، وخاصة لدراسة هياكل نواة الخلية.فمن الممكن لاستغلال الطبيعة الفسفور الغني DNA- والمجمعات الجزيئات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي للتمييز مجمعات البروتين النووي من المجمعات البروتين ولحل مجمعات البروتين النووي مختلفة على أساس كثافتها من الأحماض النووية. ولا يمكن تصوير المواد البيولوجية المتبقية على أساس وفرة من النيتروجين. رسم الخرائط فقط هذين العنصرين وتحليل توزيعها والوفرة النسبية داخل هياكل تشريحية مختلفة توفر لنا الكثير من المعلومات حول النواة. على سبيل المثال، فإنه من السهل تحديد لونين وريبوسوم في الخريطة تمثل وفرة الفوسفور. مساحة interchromatin والمجمعات المسام النووية، والهيئات النووية، من ناحية أخرى، يمكن أن يتم الكشف بسهولة في الخريطة النيتروجين الصورة.

مصغرة النظام مولد الاوكسجين القميص (miniSOG)

في حين ESI يمثل تقنية قوية لدراسة الموقع هيكل لونين في ليستغرقالصورة الاستفادة من نسب مميزة في التركيب العنصري بين الفوسفور والنيتروجين وتكوين عنصر لا يمكن في العادة يستخدم للتمييز بين مجموعات مختلفة من المجمعات البروتين. الأجسام المضادة المسمى مع جزيئات الذهب الصغيرة في نطاق نانومتر وقد استخدمت على نطاق واسع لرسم خريطة للموقع الجزيئات الفردية. منذ عادة يتم إرفاق الجسيمات الذهب إلى الضد الثانوية، وسوف تظهر ضمن محيط من حوالي 20 نانومتر حول حاتمة الكشف عنها بواسطة الأجسام المضادة الأولية. في عينات بعد التضمين، يمكن أن الأجسام المضادة كشف فقط الحواتم التي يتم كشفها على سطح الأجزاء. في حين أنه من الممكن أن يثبت وجود مستضد وربطها بنية تشريحية معينة من الخلايا، فإن المعلومات التي يتم الحصول عليها غير كاملة، حيث يتم حجب معظم الحواتم التي كتبها الراتنج. التقنيات التي تستخدم بروتوكولات مماثلة لتلك المستخدمة في مضان المجهري قبل التضمين، تسمح بالوصول إلى المستضدات في جميع أنحاءعمق الكامل للعينة لكن الخطوات permeabilization المطلوبة للسماح للأجسام المضادة لاختراق الخلية عادة ما تتطلب إزالة الأغشية الدهنية وإزالة المكونات التي لا يمكن إصلاحها من خلال الألدهيدات. وعلاوة على ذلك، تثبيتي ألدهيد المفضل للحفاظ التركيب الدقيق، غلوتارالدهيد، ويدمر عادة الحواتم، وبالتالي مطلوب امتصاص العرق عادة. هذا هو أقل فعالية في البروتين البروتين يشابك. عيب آخر من الأجسام المضادة التي وصفت مع جسيمات متناهية الصغر الذهب أن الذهب هو مادة الإلكترون كثيفة جدا أن يخلق تناقضا واضحا أن يمكن أن يحجب تفاصيل الهيكلية مثيرة للاهتمام من العينة، والتي على النقيض أضعف.

ظهور البروتين الفلوري الأخضر (GFP) كما علامة البروتين أعرب حولت استخدام المجهر مضان الإجابة على الأسئلة في علم الأحياء الخلوي. علامات بروتين مع مجال الفلورسنت صغير يسمح رسم خرائط لتوزيعه في الجسم الحي دون الحاجة إلى إجراءات permeabilization التي يمكن أن تغير هيكل. من أجل ترجمة مبدأ أنيقة من استخدام علامات البروتين لخريطة توزيع البروتين في خلية لالمجهر الإلكتروني، وبحاجة إلى نظام قادر على إنتاج وثيقة إشارة إلى بنية الفائدة وتوليد التباين في TEM. diaminobenzidine بلمرة وصمة التي كثيرا ما تستخدم في الأنسجة للكشف عن الأجسام المضادة ملزمة. وعادة ما يتم إيداع هذه وصمة عار باستخدام البيروكسيديز الفجل (HRP) مترافق إلى الضد الثانوية. على الرغم من أن رد فعل ينتج نتيجة موثوق بها، HRP غير نشطة تحفيزيا في العصارة الخلوية للخلايا 9. هذه المنتجات يمكن أن رد فعل HRP أيضا منتشر بعيدا من موقع جيل بحيث حلها هو أسوأ من طريقة nanogold 10. من أجل تجاوز هذه المشاكل، تم تطوير نظام فلاش / ReAsH 11. وهو يتألف من البروتينات الانصهار المؤتلف التي تمتلك عزر tetracysteine. هذا عزر يسمح ملزمة للوfluorophore biarsenic. عندما متحمس، ومضة المربوطة أو ReAsH قادر على توليد الأكسجين القميص شديدة التفاعل وdiaminobenzidine بالتالي photoconvert (DAB) إلى البوليمر الذي يترسب على الفور في موقع البروتينات الموسومة. يمكن أن تكون ملطخة البوليمر DAB مع رباعي أكسيد الأوزميوم، وهي كثيفة الإلكترون وبالتالي يمكن استخدامها لخريطة توزيع انصهار بروتين المؤتلف في TEM.

في عام 2011، شو وآخرون 10 قدم نظام miniSOG، والذي يتألف من 106 الأمينية الصغيرة علامة الأحماض الانصهار مشتقة من بروتين فلافيني من نبات الأرابيدوبسيس هذا هو فلوري وقادرة على خلق العديد من المتطرفين الأكسجين القميص عندما متحمس مع 448 الضوء الأزرق نانومتر. تلك الجذور الأكسجين القميص يمكن أن تستخدم لالصور أكسدة diaminobenzidine لتشكيل البوليمرات في وبالقرب من سطح البروتين الموسومة، والتي هي أقرب بكثير من الأجسام المضادة المسمى immunogold 11. في حين أن نظام فلاش / ReAsH يتطلب يصل الفلوريةالكروم وdiaminobenzidine إلى خلايا قبل القيام photoconversion، ونظام miniSOG يتطلب سوى diaminobenzidine والضوء وبالإضافة إلى ذلك حوالي الفعال مرتين كما في البلمرة diaminobenzidine. هنا، يعمل miniSOG في تركيبة مع ESI من أجل رسم خريطة التركيب الدقيق للإصلاح الحمض النووي البؤر.

إصلاح الحمض النووي بؤر (DRF)

DNA دون اصلاح فواصل حبلا مزدوجة تشكل تهديدا خطيرا للخلية لأنها يمكن أن تؤدي إلى نقل المواقع وفقدان المعلومات الوراثية. وهذا بدوره يمكن أن يؤدي إلى الشيخوخة، والسرطان، وموت الخلايا. العديد من البروتينات التي تشارك في الحمض النووي المزدوج إصلاح كسر حبلا تتراكم في البؤر التي تجمع حول حبلا مزدوج DNA كسر 12-14. على الرغم من وظيفتها غير معروف، إلا أنها تمثل الموقع في النواة التي تحتوي على الحمض النووي المزدوج كسر حبلا وغير موقع من الحمض النووي حبلا مزدوجة إصلاح كسر.

إصلاح الحمض النووي لجنة مسؤولي المنتدىوقد اتسمت ط (DRF) بواسطة المجهر مضان وأنها بمثابة المؤشرات الحيوية للتلف الحمض النووي 12،15. فهي نسبية كبيرة لحجم كسر مزدوج الجديلة واعتبرت متجانسة نسبيا حتى كشفت الدراسات الحديثة المجهر فائقة الدقة بعض الأدلة على التقسيم الفرعي للجزيئات في كل تركيز 16. من أجل فهم كيفية تنظيم هذه المواقع، لا بد من تصور كل من الهياكل البيولوجية الأساسية بالنسبة لبعضها البعض. لا يمكن أن يتحقق ذلك عن طريق الفحص المجهري مضان ولكن من الممكن من خلال المجهر الإلكتروني 17،18. هنا، يتم وصف أسلوب يجمع بين الإلكترون التصوير الطيفي مع أسلوب miniSOG لتوضيح إمكانات هذا النهج جنبا إلى جنب لاستكشاف التركيب الدقيق للDNA مزدوج الجديلة إصلاح كسر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. جيل من miniSOG الخلوي خطوط

  1. تنمو U2OS (عظمية البشري) خلايا في طبق 35 ملم يحتوي على 2 مل من انخفاض مستوى السكر في Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM) التي تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
  2. Transfect الخلايا عندما تكون 80٪ متموجة قبل lipofection مع نوعية ترنسفكأيشن النقاء (A269 / 280 نسبة 1،8-2،0) يبني البلازميد التي تحتوي على تسلسل لminiSOG وmCherry الموسومة البروتينات إصلاحها وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للكاشف ترنسفكأيشن 19. ويمكن طلب البلازميدات التعبير miniSOG من تسين مختبر: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
  3. نوع الخلايا التعبير عن بروتين المؤتلف مع العلامة miniSOG وmCherry مضان خلية تنشيط فرز يومين آخر ترنسفكأيشن. جمع الخلايامع كثافة مضان المتوسطة من أجل تجنب الخلايا التي يتم overexpressing 20.
  4. ثقافة الخلايا إيجابية على طبق 10 سم في 10 مل من DMEM المتوسطة التي تستكمل مع 10٪ FBS و 0.6 ميكروغرام / مل من وكيل اختيار G418 (Geneticin).
  5. بعد أن ظهرت مستعمرات واضحة على لوحات، وشاشة لمستعمرات إيجابية mCherry باستخدام المجهر مضان مقلوب ورسم الدوائر حولهم (على الجزء السفلي من لوحة) مع علامة دائمة. استخدام المنخفض الجوي التكبير عدسة الهدف (على سبيل المثال، 10X) واختيار الحيوانات المستنسخة باستخدام تقنية معقمة بواسطة الخدش بعناية المستعمرات وإيقاف ببطء مص لهم في العقيمة 1000 ميكرولتر ماصة.
  6. توسيع المستعمرات المختارة وتجميد أجزاء منها لأسفل باستخدام متوسط ​​النمو هو موضح في الخطوة 1.1 تستكمل مع 10٪ ثنائي ميثيل sulphoxide. اختبار الخلايا لتشكيل DRF التي تنمو بها على معقمة 18 × 18 مم 2 زلات غطاء وتعريضهم ل2 غراي من الإشعاع. الخلايا المشع التعبير عن ثابت وminiSOG mCherry الموسومة البروتين إصلاح يجب أن تظهر نموذجية التنسيق سمة نمط DSBs عندما تصور مع المجهر مضان باستخدام مجموعة مرشح للتصوير mCherry.

2. خلية ثقافة

  1. ثقافة الخلايا U2OS يعبرون عن مستقر للminiSOG وmCherry الموسومة البروتينات إصلاح في ظل الظروف المذكورة في الخطوة 1.1. زراعة خلايا إلى 80٪ confluency في 35 ملم الزجاج صحن قطره السفلي يحتوي على 2 مل من DMEM. تأكد من أن الصمغ الذي تولى تغطية زلة لالبلاستيك والبلاستيكية المستخدمة مقاومة للالمحاليل المائية والكحولية ومقاومة للالراتنج المستخدم!
  2. قبل إجراء التجربة، الخطوط العريضة لمنطقة صغيرة من حوالي 1 ملم 2 يحتوي على الخلايا معربا عن البروتينات خارج الرحم بواسطة الخدش بالقلم الماس عقيمة باستخدام المجهر مضان لتحديد المنطقة ذات الاهتمام. وبدلا من استخدام ر الطبق أسفل الزجاجيحتوي على قبعة ساترة مع نظام الشبكة قبل محفورا في صلب ساترة.
    ملاحظة: في حالة استخدام عالية الجودة المجهر مترابط يجمع بين ESI ومضان الصور المجهرية 21، تأكد من أن سمك ساترة متوافق مع أهداف الغمر النفط. يجب أن يكون سمك رقم 1.5 (0،16-0،18 مم). اختيار منطقة قريبة من وسط الطبق في المنطقة لفحصها في TEM من أجل تجنب المشاكل مع البلمرة من الراتنج التي قد تحدث بالقرب من حواف (انظر النقطة 4،10-4،13).

3. DNA الأضرار التعريفي

  1. أشرق الخلايا مع أشعة غاما، واستخدام المخدرات محاك للإشعاع، أو حث الأضرار التي أشعة الليزر الجزئي على المجهر متحد البؤر (على سبيل المثال، كما هو موضح في 18،22 أو 23).
  2. في هذا المثال، أشرق الخلايا مع 2 و 6 جراى من أشعة جاما في microirradiate 137 السيزيوم مصدر الإشعاع أو ليزر باستخدام سول 405 نانومترليزر الحالة معرف المجهر متحد البؤر بعد توعية الخلايا لمدة 20 دقيقة مع 0.5 ميكروغرام / مل هويشت.

4. إعداد نموذج

  1. إصلاح الخلايا مع 1 مل من 4٪ لامتصاص العرق تنبيه في 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات أو 0.1 M الفوسفات العازلة درجة الحموضة 7.4 لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
    تنبيه: لامتصاص العرق وكاكوديلات الصوديوم سامة! ارتداء القفازات والتخلص من المواد السامة بشكل كاف.
  2. غسل الخلايا مرتين مع 4 مل من 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات 7.4 درجة الحموضة أو العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.4.
  3. علاج الخلايا الثابتة مع 2 مل 50 ملي الجلايسين، 5 ملي aminotriazole و 10 ملي سيانيد البوتاسيوم تنبيه في 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات أو 0.1 M العازلة الفوسفات (7.4 درجة الحموضة) (فحص درجة الحموضة!) لمدة 30 دقيقة من أجل منع المتفاعل مجموعة ألدهيد وقمع أنواع الأكسجين التفاعلية الناتجة عن مجموعة الهيم، والتي يمكن أن تزيد من الخلفية.
    تنبيه: سيانيد البوتاسيوم السامة للغاية! Wقفازات الأذن، تعمل تحت غطاء والتخلص من المواد السامة بشكل كاف. رد فعل حساس جدا لدرجة الحموضة لذلك من المهم أن الرقم الهيدروجيني التحقق منها ودقيقة.
  4. تسجيل المنطقة التي تم تحديدها في الخطوة 2.2 في 2D أو 3D على مجهر مضان مقلوب، إذا كان المطلوب المجهري مترابط.
  5. إعداد 1 ملغ / مل diaminobenzidine حل هيدروكلوريد تنبيه عن طريق وضع 10 ملغ قرص diaminobenzidine هيدروكلوريد في أنبوب microcentrifuge 2 مل. إضافة 980 ميكرولتر من H 2 O المقطر و 20 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المركز (11.65 م) وتخلط حتى الحل هو البني الفاتح وشفافة. تمييع هذا الحل في 0.1 M الفوسفات أو 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل في حين ضبط درجة الحموضة وهيدروكسيد الصوديوم لدرجة الحموضة بين 7.0 و 7.6 (يوصى 7.4 درجة الحموضة).
    تنبيه: Diaminobenzidine سامة! ارتداء القفازات والتخلص من المواد السامة بشكل كاف.
  6. لphotooxidation، صeplace العازلة مع 2 مل من 1 ملغ / مل حل هيدروكلوريد diaminobenzidine في 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات أو العازلة الفوسفات. حماية هذا الحل بعيدا عن الضوء وتبريده على الجليد إلى 4 درجة مئوية وذلك لزيادة قابلية ذوبان الأوكسجين. تشبع حل مع الأوكسجين من قبل محتدما الأكسجين من خلال حل (استخدام خرطوم التي يتم إدراجها في الحل ومتصلة زجاجة الأكسجين). تحقق من درجة الحموضة مرة أخرى وضبط إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: من المهم جدا للتفاعل photooxidation أن الرقم الهيدروجيني ما بين 7.0 درجة الحموضة ودرجة الحموضة 7.6.
  7. تركيب الطبق مع الخلايا الثابتة بعناية على مجهر مضان مقلوب مجهزة 40X الغمر النفط عدسة موضوعية ونقلها إلى مجال الاهتمام. تثير علامة miniSOG مع الضوء الأزرق باستخدام مكعبات تصفية GFP أو الحراجية. MiniSOG لديه الحد الأقصى الإثارة في 448 نانومتر مع الكتف في 473 نانومتر 10.
  8. تواصل مع الإضاءة حتى بعد الأخضر miniSOG مضان هكتارق اختفى تماما وحتى البني المنتج التأكسد الضوئي للdiaminobenzidine بلمرة يظهر في القناة الخفيفة المرسلة. عندما يكون المنتج أكسدة مرئيا في معظم الخلايا، وإيقاف الإضاءة مضان لوقف التأكسد الضوئي.
    ملاحظة: صور للأكسدة يمكن أن تصل إلى عدة دقائق اعتمادا على العدسة الشيئية، موجات الإرسال مرشح والكفاءة، ومصدر الإضاءة.
  9. بوستفيكس الخلايا مع 1 مل من 2٪ غلوتارالدهيد في 0.1 M الصوديوم كاكوديلات 7.4 درجة الحموضة عازلة أو الفوسفات عازلة درجة الحموضة 7.4 لمدة 30 دقيقة.
  10. إصلاح أغشية الخلايا مع 0.1٪ -0.5٪ رباعي أكسيد الأوزميوم لمدة 20 دقيقة في 0،1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات درجة الحموضة 7.4 أو 0.1 M الفوسفات العازلة درجة الحموضة 7.4.
    ملاحظة: من المستحسن استخدام أقل تركيز ممكن من رباعي أكسيد الأوزميوم اللازمة لتحقيق الاستقرار في الأغشية. منذ رواسب DAB بلمرة لديها كثافة عالية من النيتروجين، والتي يمكن الكشف عنها مباشرة من قبل ESI، قويةالأوسيميوم تلطيخ ليس من الضروري التعرف على البروتين miniSOG الموسومة، وربما تكون ضارة للESI. رباعي أكسيد الأوزميوم هي سامة جدا! العمل في غطاء الدخان والتخلص من النفايات السامة بشكل كاف.
  11. يذوى، الخلايا من خلال سلسلة الإيثانول باستخدام 30٪، 50٪، 70٪، 90٪، 98٪ 100٪ خطوات الإيثانول (كل 5 دقائق). وفي وقت لاحق، واحتضان الخلايا في 1: مزيج 1 من الإيثانول بنسبة 100٪ وراتنج الأكريليك (LR الأبيض) ووضع طبق على شاكر لمدة 4 ساعات لتسهيل تسلل إلى الخلايا قبل احتضان الخلايا على الأقل ساعة 4 أخرى في 100 راتنج الأكريليك٪ (LR الأبيض).
  12. من أجل بلمرة الراتنج، وقطع غطاء من المسمى 2 مل أنبوب microcentrifuge بشفرة حلاقة ومعطف حافة مع الاكريليك الراتنج دواسة البنزين. تأكد من أن مسرع لا يغطي سوى حافة ولا تتدفق في أنبوب. وفي وقت لاحق، وملء بعناية أنبوب حوالي ثلثي مع الراتنج LR الأبيض باستخدام ماصة باستور. الحرص على أن الراتنج لا تحصل على اتصال خفة دمح المسرع على حافة!
  13. إزالة الراتنج التي تسلل الخلايا في الطبق ووضع الطبق رأسا على عقب على تستقيم أنبوب microcentrifuge دائمة بحيث عرض أنبوب يملأ تماما تقريبا حتى الزجاج مغطى نافذة مراقبة الطبق.
  14. الانتظار 1-2 دقائق للمعجل لختم الأنبوب وساترة، ثم عكس الأنبوب بحيث الراتنج في أنبوب يغطي الآن الخلايا.
  15. وضع الطبق مع الأنبوب في فرن عند 60 ° C وعلاجه لمدة 12 ساعة.
  16. عندما يتم الشفاء كتلة، وإزالة الطبق مع المرفقة مليئة الراتنج أنبوب microcentrifuge من الفرن وفصل أنبوب microcentrifuge من الطبق. تسهيل الفاصل تجميد أذاب دورات في النيتروجين السائل والماء الساخن.
  17. تجاهل الطبق أسفل الزجاج وقطع بعناية فتح أنبوب microcentrifuge بشفرة حلاقة لإزالة كتلة.
  18. تسمية كتلة مع علامة دائمة.
  19. استخدام شفرة حلاقة لتريم كتلة بحيث لا شيء ولكن المنطقة 1 مم 2 الذي يحتوي على منطقة تميزت سابقا مع الماس أو التنغستن القلم (أو يحتوي على منطقة مع خلايا الفائدة) لا يزال قائما.
  20. جبل كتلة في مشراح مستدق، وتقليم كتلة بسكين وتقليم وقطع الأجزاء رقيقة جدا من حوالي 50 نانومتر باستخدام سكين الماس.
  21. التقاط المقاطع على عالية لنقل 300 شبكات سلكية. هذه الشبكات لها الحانات شبكة صغيرة جدا، وبالتالي تغطي أقل من الخلايا في مجال الاهتمام.
  22. معطف المقاطع على شبكات مع حوالي 0،2-0،4 نانومتر من الكربون يستخدم المغطي الكربون للمساعدة في استقرار منهم تحت شعاع الالكترون من TEM.

5. المجهر الإلكتروني

  1. تحميل الشبكات إلى TEM التي تم تجهيز مع مرشح الطاقة. بعد ضبط المجهر ومرشح الطاقة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، وفحص الخلايا على المقاطع في وضع التكبير المنخفض (انتقال طبيعي) وقارنلهم مضان البيانات عند الاقتضاء (حصلت عليه في الخطوة 4.4).
  2. مرة واحدة في النواة مع ميزات مثيرة للاهتمام (DNA الضرر المسار أو إصلاح الحمض النووي البؤر) وجدت، والتحول إلى وضع الترشيح الطاقة وتسجيل خريطة سمك.
    ملاحظة: يتضمن هذا الإجراء تسجيل صفر الخسارة وصورة غير المرشحة. سمك يصل إلى 0.3 تعني المسار الحر (30٪ من الإلكترونات من شعاع حادث يحصل متفرقة عن طريق العينة) هي رقيقة بما يكفي لتوليد خرائط عنصري جيدة.
  3. نسبة قياسية خرائط الفوسفور والنيتروجين العناصر باستخدام البرمجيات التي تسيطر على مرشح الطاقة من الاداة المستخدمة. تسجيل الخريطة الفوسفور الصور آخر الحافة على 175 فولت فقدان الطاقة مع عرض الشق من 20 فولت وقبل حافة الصور عند 120 فولت فقدان الطاقة، وأيضا مع عرض الشق من 20 فولت. لخرائط النيتروجين، وسجل آخر حافة الصور في 447 فولت مع عرض الشق من 35 فولت وقبل حافة الصور في 358 فولت، وأيضا مع عرض الشق من 35 فولت.
    ملاحظة: بما أن محتوى العناصر المصورة (phosphorus والنيتروجين) منخفضة نسبيا (حوالي 1٪)، اختر "صورة نسبة" (خريطة عنصري النوعية) على "طريقة 3 النافذة" (quantitate خريطة عنصري) من أجل توليد الصور مع إشارة أفضل إلى نسبة الضوضاء.

تجهيز 6. صورة

  1. فتح الخرائط نسبة عنصري في برامج معالجة الصور التي يمكن التعامل مع تنسيق ملف الصور المنقولة (على سبيل المثال، صورة مجهرية رقمية). نسخ خريطة النيتروجين في القناة الحمراء وخريطة الفوسفور في القناة الخضراء صورة RGB، ثم ركب ومحاذاة الخرائط.
  2. تصدير صورة مركبة باعتباره الموسومة شكل ملف صورة (TIFF) ملف. فتح الصورة في صورة برامج معالجة التي يمكن استخدام طبقات (على سبيل المثال، فوتوشوب).
  3. ضبط مجموعة ديناميكية من كل قناة من خلال إعادة قياس الحد الأدنى والحد الأقصى للقيم في الصورة إلى مجموعة البيانات 8 بت (0-255).
  4. طرح محتوى الفوسفور من الخريطة النيتروجين (باستخدام"الطبقات" نافذة) من أجل توليد خريطة النوعية التي تبين توزيع البروتين.
  5. تحويل الخرائط من الحمض النووي (الفوسفور) والبروتين (النتروجين) التي تم إنشاؤها في الخطوة السابقة إلى "اللون المفهرس" وإنشاء جدول بحث الأصفر في الفضاء لون CMYK لخريطة تبين توزيع الحمض النووي وطاولة السماوي بحث لعرض خريطة غير البروتين النووي. ويتم اختيار الألوان لتوليد أقصى قدر من التناقض بين اثنين من خرائط عنصري.
  6. خلق صورة جديدة واستيراد الخرائط التي تبين توزيع الفوسفور وبروتين كما طبقات مختلفة. استخدام "شاشة" وضع الشفافية من أجل أن نرى كل من طبقات متراكبة على بعضها البعض.
  7. فتح الصورة صفر فقدان المكتسبة في الخطوة 5.2. هذه الصورة تمثل صورة من المنطقة المسجلة والتي تبدو وكأنها صورة TEM التقليدية ولكن يحتوي فقط على الإلكترونات التي مرت من خلال عينة من دون الاصطدام مع العينة. تصديرهذه الصورة كصورة TIFF.
  8. فتح تصدير صورة الخسارة صفر في محرر الصور ونسخها في الطبقة العليا من الصورة التي تظهر الخريطة عنصري. محاذاة الصورة باستخدام "الشاشة" واسطة الشفافية.
  9. العتبة اختياريا صفر الخسارة الصورة لشريحة إشارة إلى أن تنبع من miniSOG. إضافة الصورة الناتجة كطبقة منفصلة كما هو موضح أعلاه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ESI

وبمقارنة الصور ESI للنواة (الشكل 1) مع الصور TEM التقليدية (على سبيل المثال، الشكل 7-1) يكشف عن زيادة كبيرة في البنى التشريحية التي يمكن تمييزها بسهولة. تظهر التلال لونين الأصفر وأنه من السهل جدا لتحديد chromocenters في خلايا فأر. الأنوية يمكن بسهولة التمييز بين لونين من قبل بنيتها مستديرة ولون مختلف، منذ ريبوسوم تجميعها مسبقا يحتوي بالفعل ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ESI يمكن أن تكون بمثابة أداة ممتازة لفحص حالات مختلفة من لونين وribonucleoproteins في النواة لأنه قادر على خريطة المناطق التي هي غنية في الفوسفور على وجه التحديد. وهو يعزز بشكل كبير من كمية التفاصيل التي يمكن الحصول عليها عن طريق المجهر الالكتروني وليس اعتمادا على الأساليب المتناقضة غير محددة. عيب واحد من ESI هو أنه يتطلب أقسام أرق من TEM التقليدية في نفس الجهد المتسارع. يمكن التغلب على ذلك من خلال العمل مع مسلسل أقسام أو باستخدام أساليب تصوير الشعاعي الطبقي 28.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور روجر تسين لتزويدنا بتركيبات miniSOG. الدكتور Xuejun Sun للمساعدة في TEM. ليزا ليم وبيتر شيبل من معهد كروس للسرطان لتزويد الأكسجين. هيلمار ستريكفادن حاصل على زمالة ما بعد الدكتوراه من مؤسسة ألبرتا للسرطان وبدعم من Bayrische Forschungsallianz. تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعاهد الكندية للبحوث الصحية ومؤسسة ألبرتا للسرطان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أطباق قاع زجاجية مقاس 35 ممMatTekP35G-1.5-14-C
أطباق قاع زجاجية شبكية مقاس 35 ممMatTekP35G-2-14-CGRD غير مصمم لأهداف الانغماس
LR أبيض: راتنج أكريلemsdiasum14381
LR مسرع أبيضemsdiasum14385
3،3 & prime ؛ -Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 أقراصSigmaD5905
Slim Bar Grids 300 MeshSPI1161123
قلم مختبر نقطة التنغستنemsdiasum41148
رباعي أكسيد الأوزميومemsdiasum19100
Carbon Coater 208 الكربونCressington
Ultra microtome Leica EM UC6Leica
Photoshop CS5Adobeمع الإصدارات القديمة
Micrograph V.2.30Gatanتعمل مع الإصدارات القديمة
Hoechst 33342SigmaH-1399
EffecteneQuiagen
MiniSOG-ConstructsTsien-Labtsienlab@yahoo.com< / a >
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
السيزيوم 137 مصدر الإشعاع "MARK 1" ( جي إل شيبرد وأمبير مرتبط)
ImageJ / FiJiمفتوح المصدرhttp://fiji.sc/Fiji
2 مل أنابيب EppendorfFisherbrand05-408-146
سكين الماس الترا 35 درجة ؛التشذيب الدياتوم
الترا تريمدياتوم
كاكوديلات الصوديوم ثلاثي هيدراتemsdiasum12300تحذير سامة!
جلوتارالديهايد EM الصف 8٪emsdiasum16020تحذير سامة!
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةemsdiasum21180
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدةemsdiasum21190
Paraformaldehydeemsdiasum19202
رابع أكسيد الأوزميوم 4٪ محلولemsdiasum19150
المضان المقلوب Axiovert 200Mحمض
FisherbrandA142-212
محلول هيدروكسيد الصوديوم 10MFluka72068
OxygenMedigas
3-Amino-1،2،4-triazoleSigmaA8056
سيانيد البوتاسيومSigma207810تحذير سامة!
الإيثانولemsdiasum15058تحذير سام!
شفرة حلاقة أحادية الحافة الكربون الصلبemsdiasum71960تحذير حاد!
DMEMSigmaD 5546
FBSLife Technologies16000-044
G418Life Technologies11811-023
DMSOSigmaD2650
مجهر إلكتروني ناقل الحركة 200 كيلو فولتJEOL2100
GIF Tridiem 863 فلتر الطاقةجاتان
قد تعمل Digital قد سكين المنظار الهيدروكلوريك Zeiss

المراجع

  1. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
  2. Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
  3. Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051(1999).
  4. Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
  5. Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
  6. Simon, G. T. Electron spectroscopic imaging. Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).
  7. Egerton, R. Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , Springer. (2011).
  8. Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
  9. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
  10. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041(2011).
  11. Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
  12. Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
  13. Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
  14. Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
  15. Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
  16. Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
  17. Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
  18. Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
  19. Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
  20. Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
  21. Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
  22. Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
  23. Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
  24. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
  25. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135(2013).
  26. Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
  27. Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
  28. Aronova, M. A., et al. Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
  29. Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
  30. Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

miniSOG DNA

مقالات ذات صلة