Method Article

تطبيق نظام التعبير محرض لدراسة التدخل من العوامل البكتيرية الفوعة مع اشارة بين الخلايا

DOI:

10.3791/52903

⸱

June 25th, 2015

 ,  ,  , 
1Department Biologie, Friedrich-Alexander-Universität, 2Institut für Molekulare Pathogenese, Friedrich-Loeffler-Institut, 3Mikrobiologisches Institut - Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, Universitätsklinikum Erlangen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم الطريقة الموضحة هنا للحث على سلسلة إشارات موت الخلايا المبرمج في خطوات محددة من أجل تشريح نشاط بروتين المستجيب البكتيري المضاد لموت الخلايا المبرمج. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للتعبير المحفز عن البروتينات المؤيدة لموت الخلايا المبرمج أو السامة ، أو لتشريح التداخل مع مسارات الإشارات الأخرى.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنية المعروضة هنا يسمح احد لتحليل في الخطوة التي بروتين الهدف، أو بدلا من ذلك جزيء صغير، تتفاعل مع مكونات مسار الإشارات. وتستند هذه الطريقة، من جهة، على التعبير عن محرض من بروتين معين لبدء الحدث الإشارات في خطوة محددة ومقررة مسبقا في شلال يشير المحدد. التعبير يصاحب ذلك، من ناحية أخرى، من الجينات في المصالح ثم يسمح للمحقق لتقييم ما إذا كان النشاط من البروتين المستهدف أعرب يقع المنبع أو المصب لهذا الحدث مما يشير بدأت، اعتمادا على قراءات من مسار الإشارات التي يتم الحصول عليها. هنا، تم اختيار سلسلة أفكارك كمسار إشارات محددة لإثبات وظائف البروتوكول. البكتيريا المسببة للأمراض، مثل الكوكسيلا البورنيتية، نقل من البروتينات المستجيب التي تتداخل مع الحث موت الخلايا المضيفة في الخلية المضيفة لضمان بقاء البكتيريا في الخلية وللترويج لنشر في الكائن الحي. وC. بروتين المستجيب البورنيتية CaeB يمنع بشكل فعال موت الخلايا المضيفة بعد استحثاث موت الخلايا المبرمج مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية أو مع staurosporine. لتضييق على الخطوة التي CaeB يتداخل مع انتشار الإشارة أفكارك، وأعرب عن البروتينات المحددة مع جيدا اتسم بالنشاط المساعد على أفكارك عابر بطريقة الدوكسيسيكلين محرض. إذا يعمل CaeB المنبع من هذه البروتينات، وموت الخلايا المبرمج المضي قدما دون عوائق. إذا يعمل CaeB المصب، سيتم تحول دون موت الخلايا. كانت البروتينات الاختبار المختارة باكس، الذي يعمل على مستوى الميتوكوندريا، وكاسباس 3، وهو الأنزيم البروتيني الجلاد كبير. CaeB يتداخل مع موت الخلايا الناجم عن باكس التعبير، ولكن ليس عن طريق كاسباس 3 التعبير. CaeB، وبالتالي يتفاعل مع تتالي أفكارك بين هذه البروتينات اثنين.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفوعة للعوامل الممرضة سلبية الغرام البكتيرية تعتمد على أنظمة إفراز المتخصصة لخطف الخلايا المضيفة حقيقية النواة. البكتيريا تستخدم هذه النظم إفراز لحقن البروتينات الفوعة البكتيرية (المؤثرات) في الخلية المضيفة لتعديل مجموعة متنوعة من الأنشطة الخلوية والكيمياء الحيوية. قدمت دراسة البروتينات المستجيب ليس فقط نظرة ملحوظة في الجوانب الأساسية للمضيف / التفاعلات الممرض ولكن أيضا في البيولوجيا الأساسية للخلايا حقيقية النواة 1. وقد تبين أن التشكيل من موت الخلايا المبرمج الخلية المضيفة أن تكون آلية الفوعة هامة لكثير من الكائنات الممرضة داخل الخلايا، كما تم تحديد عدد من البروتينات المستجيب تحوير الخلايا 2-9. ومع ذلك، آلياتها الجزيئية دقيقة من النشاط لا تزال بعيدة المنال في كثير من الحالات.

موت الخلايا المبرمج، وهو شكل من موت الخلية المبرمج، يلعب دورا هاما في الاستجابة المناعية للإصابة 10. مسارين الرئيسية المؤدية إلى موت الخلايا المبرمج لهاتم تحديد: استهداف الميتوكوندريا (موت الخلايا المبرمج الجوهرية) أو تنبيغ المباشر للإشارة عن طريق مستقبلات موت الخلايا في الغشاء البلازمي (موت الخلايا المبرمج خارجي). يتم تشغيل مسار موت الخلايا الذاتية أو بوساطة الميتوكوندريا بواسطة إشارات بين الخلايا وتتضمن تفعيل باكس وباك، وهما عضوان الموالية لأفكارك من عائلة بي سي إل 2. وتتكون هذه العائلة من البروتينات منظم المؤيدة والمضادة للأفكارك التي تتحكم في موت الخلايا 11-14. تفعيل الخلايا يؤدي إلى oligomerization من باكس وباك تليها permeabilization لاحق من الغشاء الخارجي الميتوكوندريا، مما أدى إلى الإفراج السيتوكروم C إلى السيتوبلازم. الإفراج السيتوكروم C يبدأ تفعيل caspases المستجيب 3 و 7 من خلال تفعيل كاسباس 9 في apoptosome 15. وهذا يؤدي إلى التحلل البروتيني من ركائز مختارة، من بين أمور أخرى، يؤدي إلى تعرض فسفاتيديل على سطح الخلية 16 و يحرر الدناز مخصص أن شظايا الفصلromatin 17،18.

من أجل تحديد مكان ضمن سلسلة أفكارك بروتين المستجيب الفردية يتدخل، كان يعمل بنظام التعبير محرض 19. وكانت الأجهزة التنظيمية للتعبير مشروط من الجينات المحورة أداة لا تقدر بثمن في تحليل وظيفة البروتين داخل الخلية أو أهميتها بالنسبة للأنسجة، جهاز والتنمية الكائن الحي، وكذلك أثناء بدء والتقدم والحفاظ على المرض 20-23. عادة، ونظم التحكم محرض، مثل نظام تيت 24 يعملون هنا، تشكل وحدة النسخ الاصطناعية (انظر الشكل 1). عنصر واحد هو عامل النسخ هندسيا بشكل مصطنع دعا نقل واكتساب التكنولوجيا (التي تعتمد على التتراسيكلين النسخ المنشط)، التي شكلتها انصهار النسخ كاظمة البكتيرية TetR 25 إلى مجال البروتين الثدييات التي تتوسط تفعيل النسخي أو إسكات 24،26. العنصر الثاني هو هجينالمروج، ووصف TRE (عنصر التتراسيكلين استجابة)، التي تتألف من الحد الأدنى من المروج حقيقية النواة، التي تحتوي على ما لا يقل عن TATA مربع وموقع بدء النسخ، وانضم إلى تكرار متعددة من موقع ملزم DNA وما شابه ذلك لTetR، TETO 24،25. العنصر الثالث هو يجند الطبيعي للTetR، التتراسيكلين أو أحد مشتقاته، مثل anhydrotetracycline أو دوكسي 25. على يجند بالإضافة إلى مستنبت، TetR يفقد تقارب من أجل تيتو وتنأى عن TRE. ونتيجة لذلك، يتم إلغاء نسخ من الجين المستهدف. التعبير التحوير يمكن، بالتالي، أن تسيطر بإحكام بطريقة الزمنية وتعتمد على الجرعة في كل من زراعة الخلايا والحيوانات 20،23،24. مع نقل واكتساب التكنولوجيا، يحدث التحوير التعبير بشكل جوهري، إلا في وجود التتراسيكلين. هذا يمكن أن يكون العيب في دراسة السامة للخلايا أو أنكجنيك البروتينات لأن التتراسيكلين أولا أن يتم إزالتها من النظام، قبل التحوير expressioن يحدث ويمكن رصد آثار البروتين المستهدف على الخلية. هذا يمكن أن يكون مضيعة للوقت وليس دائما كاملة، خصوصا في الحيوانات المعدلة وراثيا 27. لمعالجة هذا القيد، تم استخدام متحولة TetR مع استجابة عكسية لوجود الدوكسيسيكلين لتوليد عامل النسخ الجديدة، rtTA (عكس TTA) 28. فإنه يلزم فقط لتري، وبصورة متزامنة، وينشط النسخ في وجود دوكسي. التسرب المتبقية للنظام، أي، التعبير التحوير في غياب عامل النسخ متجهة الى TRE، منشؤها إما (ط) من آثار الموقف في موقع التكامل الجيني، (ب) من TRE نفسها 29، أو (ج) من غير -specific ملزمة للنقل واكتساب التكنولوجيا / rtTA 28، وقد وجهت عن طريق إدخال كاتم الصوت النسخي إضافية، ووصف تحويل النص إلى كلام (التي تعتمد على التتراسيكلين كاتم الصوت النسخي) 30 إلى النظام. أنها تشكل شبكة تنظيمية مزدوجة مع rtTA (انظر الشكل 1).في غياب الدوكسيسيكلين، تحويل النص إلى كلام بربط TRE والعمل بنشاط على إيقاف أي النسخ المتبقية. في ظل وجود الدوكسيسيكلين، تحويل النص إلى كلام تنأى عن TRE وrtTA بربط حمل في وقت واحد التعبير عن الجينات المستهدفة. هذه طبقة إضافية من الصرامة ضرورية في كثير من الأحيان للتعبير عن البروتينات السامة للخلايا نشطة للغاية 31-34.

باستخدام هذا النظام المزدوج المنظم لرقابة مشددة، ويمكن البدء في سلسلة أفكارك في خطوة محددة تسمح بتحليل ما إذا كان البروتين المستجيب معينة يمكن أن تتداخل مع الخلايا الاستقراء. لا يمكن استخدام هذا الأسلوب فقط لدراسة النشاط المضادة للأفكارك البروتينات المستجيب البكتيرية ولكن أيضا للتعبير عن محرض من البروتينات الموالية لأفكارك أو السامة أو لتشريح التدخل في مسارات إشارات أخرى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. جيل من خطوط الخلايا مستقرة التعبير عن بروتين الاهتمام

  1. إعداد وسائل الاعلام من خلال إضافة FCS المعطل الحرارة و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين إلى المتاحة تجاريا Dulbecco's التعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع GlutaMAX-I، البيروفات، و 4.5 جم / L D-الجلوكوز.
  2. زراعة خلايا HEK293 في وسائل الإعلام عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. دون زراعة الخلايا كل يوم الثالث على التوالي. إزالة وسائل الإعلام وresuspend الخلايا في 15 مل وسائل الإعلام الجديدة. ماصة 1 مل في الجديدة 75 سم 2 خلية قارورة الثقافة وإضافة 14 مل سائل الإعلام.
  3. تحليل عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
  4. البذور خلايا HEK293 في لوحة 6 جيدا في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 5 خلايا لكل بئر واحتضان لمدة 24 ساعة.
  5. لترنسفكأيشن استخدام بروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة للكاشف ترنسفكأيشن. Transfect الخلايا مع pEGFP-C2 أو pEGFP-C2-CaeB باستخدام كاشف ترنسفكأيشن. قبل استخدامها، الاحماء reag ترنسفكأيشنوالأنف والحنجرة وسائل الإعلام اللازمة لRT. استخدام 3: 1 نسبة ترنسفكأيشن الكاشف لDNA.
    1. في التفاصيل، ماصة 1.5 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن مباشرة في 50 ميكرولتر من المصل خالية DMEM المتوسطة. لتكوين معقد، ماصة 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي ترميز GFP أو GFP-CaeB إلى ترنسفكأيشن التي تحتوي على كاشف الخليط واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
    2. Transfect الخلايا عن طريق إضافة خليط التفاعل بطريقة الإفلات من الحكمة واحتضان عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ لمدة 24 ساعة.
  6. إضافة 1 ملغ / مل geneticin لاختيار من الحيوانات المستنسخة GFP إيجابية عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
  7. بعد 6 أيام، عزل الخلايا وحيدة عن طريق التدفق الخلوي والفرز في لوحة 96-جيدا إيواء المتوسطة وHEK293 طاف في نسبة 1: 1. توليد HEK293 طاف من الخلايا متموجة HEK293 مثقف أن تم طرد لمدة 15 دقيقة في 4966 ز س.
  8. في اليوم التالي، تحل محل الثقافة المتوسطة مع المتوسط ​​تحتوي على 1.50؛ ملغ / مل geneticin. تغيير وسائل الإعلام مرة واحدة في الأسبوع. إذا كانت الخلايا شكل أحادي الطبقة متموجة، نقلها إلى لوحة 24-جيدا. دون زراعة الخلايا مرتين في الأسبوع في نسبة 1: 5 في وسائل الإعلام التي تحتوي على 1.5 ملغ / مل geneticin. أخيرا، وتحليل نسبة الخلايا GFP إيجابية من خلال تحليل طخة مناعية والتدفق الخلوي.

تحليل 2. من خطوط الخلايا مستقرة خلال تحليل طخة مناعية

  1. إزالة طاف وغسل الخلايا انضمت مرة واحدة مع PBS الدافئ. resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة، والحرارة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية وتخزينها في -20 ° C.
  2. تحميل ما يقرب من 4 × 10 4 خلايا لكل عينة على 12٪ هلام SDS-PAGE. بالإضافة إلى ذلك، حمولة 6 ميكرولتر من سلم البروتين التجاري باعتباره الوزن الواسمات الجزيئية. تشغيل المواد الهلامية في نظام الكهربائي للهلام في إطار الجهد المستمر من 180 V لل45-60 دقيقة مع 1X Laemmli عازلة على التوالي.
  3. البروتينات وصمة عار على الأغشية PVDF (حجم المسام 0.45 ميكرون) في الجهد المستمر من 16 V لمدة 60 دقيقة باستخدام ترانس وصمة عار SD نقل خلية شبه الجافة.
  4. الأغشية كتلة في 10 مل من 5٪ غير دهن الحليب الجاف في برنامج تلفزيوني / 0.05٪ توين 20 (MPT) لمدة 1 ساعة على RT.
  5. تمييع 4 ميكرولتر من مكافحة GFP الأضداد في 4 مل من MPT واحتضان الأغشية O / N عند 4 درجات مئوية.
  6. تنفيذ ثلاث خطوات الغسيل 10 دقيقة مع 10 مل من PBS / توين 20 بنسبة 0.05٪.
  7. احتضان الأغشية مع 0.8 ميكرولتر من الفجل-البيروكسيديز مترافق الأجسام المضادة الثانوية في 4 مل من MPT.
  8. بعد 1 ساعة حضانة في RT، وغسل الأغشية ثلاث مرات مع PBS / 0.05٪ توين 20 (كما هو موضح في 2.6) وكشف الفجل النشاط البيروكسيداز مع مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تطبيق التجهيزات القياسية للتنمية فيلم لتصور العصابات البروتين.

3. تحليل الخلايا باستخدام عداد الكريات التدفق.

  1. الخلايا resuspend في برنامج تلفزيوني. استخدام الخلايا HEK293 كما سيطرة سلبية لضبط الشوري الأمامatter (FSC) والجانب مبعثر (SSC) بحيث الخلايا هي على نطاق واسع. رسم بوابة على الخلايا الحية من خلال استبعاد الحلل خلية، وحدات العمل والحطام الخلية.
  2. ضبط أنبوب مضخم (PMT) مكاسب بحيث الخلايا غير ملوثين هي في أقصى اليسار من الرسم البياني للقناة FL1 (488 نانومتر الأرجون ليزر).
  3. لتحليل كثافة مضان من HEK293-GFP وHEK293-GFP-CaeB خلايا فتح الرسم البياني للقناة FL1 والحصول على 10000 الأحداث على السكان بوابات.
  4. تحليل البيانات باستخدام FACS التجارية برامج التحليل.

4. ترنسفكأيشن من مستقر خط الخلية مع محرض نظام ناقلات التعبير

  1. البذور خلايا HEK293 يعبرون عن ثابت GFP أو GFP-CaeB في لوحة ال 12 أيضا في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 5 خلايا / جيد.
  2. 19 ساعة بعد البذر، وشارك في transfect الخلايا مع البلازميد منظم والبلازميد استجابة إما ترميز باكس أو كاسباس تنشيط 3.
    1. شارك في transfect الخلايا HEK293 مستقرةمع 100 نانوغرام من pWHE125-P منظم البلازميد (الشكل 2) و 100 نانوغرام من البلازميدات استجابة pWHE655-hBax أو pWHE655-revCasp3 (الشكل 3) و 0.4 ميكرولتر من polyethylenimine.
    2. إعداد DNA وpolyethylenimine ترنسفكأيشن كاشف كل في 75 ميكرولتر من غروب MEM المتوسطة واحتضان لمدة 5 دقائق بالضبط في RT. لتكوين معقد، واحتضان كل من الخلائط معا لمدة 15 دقيقة في RT.
  3. إضافة polyethylenimine / DNA حل قطرة من الحكمة إلى الخلايا واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.

5. استحثاث موت الخلايا المبرمج

  1. 5 ساعة بعد ترنسفكأيشن، لحث التعبير من البروتينات الموالية لأفكارك طريق إضافة 1 ميكروغرام / مل الدوكسيسيكلين لثقافة المتوسط. احتضان الخلايا لمدة 18 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.

تحليل 6. من الخلية المضيفة موت الخلايا المبرمج من قبل تحليل طخة مناعية

  1. تفقد الخلايا قبل ساعةarvesting تحت المجهر الضوئي للتحقق من تحريض موت الخلايا. الخلايا أفكارك هي اكتشافها من خلال وجود هيئات أفكارك في الخلايا المحيطة بها الموت.
  2. إزالة طاف وغسل الخلايا انضمت مرة واحدة مع PBS الدافئ. resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة، والحرارة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية وتخزينها في -20 ° C.
  3. تحميل ما يقرب من 4 × 10 4 خلايا لكل عينة على 12٪ هلام SDS-PAGE. بالإضافة إلى ذلك، حمولة 6 ميكرولتر من سلم البروتين التجاري باعتباره الوزن الواسمات الجزيئية. تشغيل المواد الهلامية في نظام الكهربائي للهلام في إطار الجهد المستمر من 180 V لل45-60 دقيقة مع 1X Laemmli عازلة على التوالي.
  4. البروتينات وصمة عار على الأغشية PVDF (حجم المسام 0.45 ميكرون) في الجهد المستمر من 16 V لمدة 60 دقيقة باستخدام ترانس وصمة عار SD نقل خلية شبه الجافة.
  5. الأغشية كتلة في 10 مل من 5٪ غير دهن الحليب الجاف في برنامج تلفزيوني / 0.05٪ توين 20 (MPT) لمدة 1 ساعة على RT.
  6. تمييع 4 μل المضادة للالمشقوق بولي البلمرة ADP-ريبوز (PARP) الأجسام المضادة في 4 مل من MPT واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
  7. تنفيذ ثلاث خطوات الغسيل 10 دقيقة مع 10 مل من PBS / توين 20 بنسبة 0.05٪.
  8. احتضان الأغشية مع 0.8 ميكرولتر الفجل-البيروكسيديز مترافق الأجسام المضادة الثانوية المخفف في 4 مل MPT.
  9. بعد 1 ساعة حضانة في RT، وغسل الأغشية ثلاث مرات مع PBS / 0.05٪ توين 20 (كما هو موضح في 6.7) وكشف الفجل النشاط البيروكسيداز مع مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تطبيق التجهيزات القياسية للتنمية فيلم لتصور العصابات البروتين.
  10. إزالة الأجسام المضادة ملزمة 30 دقيقة حضانة في RT مع 7 مل البقعة الغربية تجريد العازلة.
  11. بعد ثلاثة يغسل مع PBS / 0.05٪ توين 20 (كما هو موضح في 6.7)، تحقيق الأغشية مع 4 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة الأكتين في 4 مل من MPT O / N عند 4 درجات مئوية.
  12. بعد ثلاث خطوات غسل MPT (كما هو موضح في 6.7)، واحتضان الأغشية مع 0.8 ميكرولتر من حوالأجسام المضادة البيروكسيديز مترافق rseradish الثانوية مخففة في 4 مل من MPT.
  13. بعد 1 ساعة حضانة في RT، وغسل الأغشية ثلاث مرات مع PBS / 0.05٪ توين 20 (كما هو موضح في 6.7 وكشف الفجل النشاط البيروكسيداز مع مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تطبيق التجهيزات القياسية للتنمية فيلم لتصور العصابات البروتين.
    ملاحظة: تم تنفيذ جميع الخطوات الحضانة على شاكر لوحة للمرة المشار إليه ودرجة الحرارة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أولا، تم إنشاء خطوط الخلايا HEK293 التعبير عن ثابت وبروتين من الفائدة (CaeB) كما بروتين GFP الانصهار. كعنصر تحكم، قد تولدت أيضا خطوط الخلايا HEK293 التعبير عن ثابت GFP. تم التحقق من التعبير عن GFP وGFP-CaeB عن طريق تحليل طخة مناعية. لطخة مناعية ممثل (الشكل 4A) يوضح التعبير مستقر وقابل للكشف بشكل واضح من GFP وGFP-CaeB. ومع ذلك، هذا الاختبار لا يمكن تحديد ما إذا كانت جميع خلايا تعبر عن GFP أو GFP-CaeB. لذلك، تم تحليل ستابلي خطوط الخلايا HEK293 أيضا التدفق الخلوي. كم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العديد من أنواع البكتيريا المسببة للأمراض تؤوي أنظمة إفراز لإفراز أو نقل من البروتينات المستجيب البكتيرية إلى داخل الخلية المضيفة. هذه البروتينات المستجيب لديها القدرة على تعديل العمليات ومسارات في الخلية المضيفة، مما يسمح للبكتيريا من أجل البقاء وتكرار داخل مكانة داخل الخلايا في كل منها. وفهم الأنشطة البيوكيميائية والآليات الجزيئية من البروتينات المستجيب مساعدة نحو فهم أفضل للالمرضية ويمكن أن تساعد على تطوير أدوات علاجية جديدة لمكافحة المرض. وعلاوة على ذلك، حيث أن البروتينات المس...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) من خلال مبادرة البحث التعاوني 796 (SFB796) إلى A.L. و CB ، ومن خلال مكالمة ERA-NET PathoGenoMics 3 rd إلى A.L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM Life Technologies31966-021
FCSBiochromS0115
القلم / البكتيريا العصبية15140-122
تقنيات الحياة OptiMEM51985
X-tremeGENE 9Roche6365752001
GeneticinRothCP11.3
PolyethyleniminePolyscienes23966
DoxycyclineSigma AldrichD9891
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad165-8000EDU
Trans-Blot SD خلية نقل شبه جافةBio-Rad170-3940
PageRuler سلم البروتينالملون Thermo Scientific26616
غشاءPVDFMilliporeIPVH00010
مكافحة GFP لايف تكنولوجيزA6455
المضاد للشق PARPBD Bioscience611038
مضاد للأكتينسيجما ألدريتشA2066
ماوس IgG (H + L) -HRPODianova111-035-062
Rabbit IgG (H + L) -HRPODianova111-035-045
ECL Western BlotSubstrate Thermo Scientific32106
Restore Plus Western Blot Stripping BufferThermo Scientific46428
تقنيات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
  2. Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
  3. Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
  4. Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115(2006).
  5. Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
  6. Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
  7. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
  8. Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
  9. Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
  10. Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
  11. Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
  12. Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
  13. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714(2013).
  14. Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
  15. Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
  16. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
  17. Cory, S. Cell death throes. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).
  18. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
  19. Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
  20. Felsher, D. W. Reversibility of oncogene-induced cancer. Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).
  21. Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
  22. Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
  23. Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27(2009).
  24. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  25. Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
  26. Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).
  27. Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
  28. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
  29. Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
  30. Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
  31. Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
  32. Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
  33. Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
  34. Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
  35. Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
  36. Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
  37. Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
  38. Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
  39. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  40. Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
  41. Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
  42. Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
  43. Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81(2010).
  44. Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
  45. Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
  46. Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bacterial Virulence FactorsIntracellular SignalingInducible Expression SystemApoptotic CascadeWestern BlottingFlow CytometryDoxycycline InductionCaspase 3Bax ProteinPARP Cleavage

Related Articles