تطبيق نظام التعبير محرض لدراسة التدخل من العوامل البكتيرية الفوعة مع اشارة بين الخلايا

الفوعة للعوامل الممرضة سلبية الغرام البكتيرية تعتمد على أنظمة إفراز المتخصصة لخطف الخلايا المضيفة حقيقية النواة. البكتيريا تستخدم هذه النظم إفراز لحقن البروتينات الفوعة البكتيرية (المؤثرات) في الخلية المضيفة لتعديل مجموعة متنوعة من الأنشطة الخلوية والكيمياء الحيوية. قدمت دراسة البروتينات المستجيب ليس فقط نظرة ملحوظة في الجوانب الأساسية للمضيف / التفاعلات الممرض ولكن أيضا في البيولوجيا الأساسية للخلايا حقيقية النواة ^1. وقد تبين أن التشكيل من موت الخلايا المبرمج الخلية المضيفة أن تكون آلية الفوعة هامة لكثير من الكائنات الممرضة داخل الخلايا، كما تم تحديد عدد من البروتينات المستجيب تحوير الخلايا ^2-9. ومع ذلك، آلياتها الجزيئية دقيقة من النشاط لا تزال بعيدة المنال في كثير من الحالات.

موت الخلايا المبرمج، وهو شكل من موت الخلية المبرمج، يلعب دورا هاما في الاستجابة المناعية للإصابة ^10. مسارين الرئيسية المؤدية إلى موت الخلايا المبرمج لهاتم تحديد: استهداف الميتوكوندريا (موت الخلايا المبرمج الجوهرية) أو تنبيغ المباشر للإشارة عن طريق مستقبلات موت الخلايا في الغشاء البلازمي (موت الخلايا المبرمج خارجي). يتم تشغيل مسار موت الخلايا الذاتية أو بوساطة الميتوكوندريا بواسطة إشارات بين الخلايا وتتضمن تفعيل باكس وباك، وهما عضوان الموالية لأفكارك من عائلة بي سي إل 2. وتتكون هذه العائلة من البروتينات منظم المؤيدة والمضادة للأفكارك التي تتحكم في موت الخلايا ^11-14. تفعيل الخلايا يؤدي إلى oligomerization من باكس وباك تليها permeabilization لاحق من الغشاء الخارجي الميتوكوندريا، مما أدى إلى الإفراج السيتوكروم C إلى السيتوبلازم. الإفراج السيتوكروم C يبدأ تفعيل caspases المستجيب 3 و 7 من خلال تفعيل كاسباس 9 في apoptosome ^15. وهذا يؤدي إلى التحلل البروتيني من ركائز مختارة، من بين أمور أخرى، يؤدي إلى تعرض فسفاتيديل على سطح الخلية ¹⁶ و يحرر الدناز مخصص أن شظايا الفصلromatin ^17،18.

من أجل تحديد مكان ضمن سلسلة أفكارك بروتين المستجيب الفردية يتدخل، كان يعمل بنظام التعبير محرض ^19. وكانت الأجهزة التنظيمية للتعبير مشروط من الجينات المحورة أداة لا تقدر بثمن في تحليل وظيفة البروتين داخل الخلية أو أهميتها بالنسبة للأنسجة، جهاز والتنمية الكائن الحي، وكذلك أثناء بدء والتقدم والحفاظ على المرض ^20-23. عادة، ونظم التحكم محرض، مثل نظام تيت ²⁴ يعملون هنا، تشكل وحدة النسخ الاصطناعية (انظر الشكل 1). عنصر واحد هو عامل النسخ هندسيا بشكل مصطنع دعا نقل واكتساب التكنولوجيا (التي تعتمد على التتراسيكلين النسخ المنشط)، التي شكلتها انصهار النسخ كاظمة البكتيرية TetR ²⁵ إلى مجال البروتين الثدييات التي تتوسط تفعيل النسخي أو إسكات ^24،26. العنصر الثاني هو هجينالمروج، ووصف TRE (عنصر التتراسيكلين استجابة)، التي تتألف من الحد الأدنى من المروج حقيقية النواة، التي تحتوي على ما لا يقل عن TATA مربع وموقع بدء النسخ، وانضم إلى تكرار متعددة من موقع ملزم DNA وما شابه ذلك لTetR، TETO ^24،25. العنصر الثالث هو يجند الطبيعي للTetR، التتراسيكلين أو أحد مشتقاته، مثل anhydrotetracycline أو دوكسي ^25. على يجند بالإضافة إلى مستنبت، TetR يفقد تقارب من أجل تيتو وتنأى عن TRE. ونتيجة لذلك، يتم إلغاء نسخ من الجين المستهدف. التعبير التحوير يمكن، بالتالي، أن تسيطر بإحكام بطريقة الزمنية وتعتمد على الجرعة في كل من زراعة الخلايا والحيوانات ^20،23،24. مع نقل واكتساب التكنولوجيا، يحدث التحوير التعبير بشكل جوهري، إلا في وجود التتراسيكلين. هذا يمكن أن يكون العيب في دراسة السامة للخلايا أو أنكجنيك البروتينات لأن التتراسيكلين أولا أن يتم إزالتها من النظام، قبل التحوير expressioن يحدث ويمكن رصد آثار البروتين المستهدف على الخلية. هذا يمكن أن يكون مضيعة للوقت وليس دائما كاملة، خصوصا في الحيوانات المعدلة وراثيا ^27. لمعالجة هذا القيد، تم استخدام متحولة TetR مع استجابة عكسية لوجود الدوكسيسيكلين لتوليد عامل النسخ الجديدة، rtTA (عكس TTA) ^28. فإنه يلزم فقط لتري، وبصورة متزامنة، وينشط النسخ في وجود دوكسي. التسرب المتبقية للنظام، أي، التعبير التحوير في غياب عامل النسخ متجهة الى TRE، منشؤها إما (ط) من آثار الموقف في موقع التكامل الجيني، (ب) من TRE نفسها ^29، أو (ج) من غير -specific ملزمة للنقل واكتساب التكنولوجيا / rtTA ^28، وقد وجهت عن طريق إدخال كاتم الصوت النسخي إضافية، ووصف تحويل النص إلى كلام (التي تعتمد على التتراسيكلين كاتم الصوت النسخي) ³⁰ إلى النظام. أنها تشكل شبكة تنظيمية مزدوجة مع rtTA (انظر الشكل 1).في غياب الدوكسيسيكلين، تحويل النص إلى كلام بربط TRE والعمل بنشاط على إيقاف أي النسخ المتبقية. في ظل وجود الدوكسيسيكلين، تحويل النص إلى كلام تنأى عن TRE وrtTA بربط حمل في وقت واحد التعبير عن الجينات المستهدفة. هذه طبقة إضافية من الصرامة ضرورية في كثير من الأحيان للتعبير عن البروتينات السامة للخلايا نشطة للغاية ^31-34.

باستخدام هذا النظام المزدوج المنظم لرقابة مشددة، ويمكن البدء في سلسلة أفكارك في خطوة محددة تسمح بتحليل ما إذا كان البروتين المستجيب معينة يمكن أن تتداخل مع الخلايا الاستقراء. لا يمكن استخدام هذا الأسلوب فقط لدراسة النشاط المضادة للأفكارك البروتينات المستجيب البكتيرية ولكن أيضا للتعبير عن محرض من البروتينات الموالية لأفكارك أو السامة أو لتشريح التدخل في مسارات إشارات أخرى.

1. جيل من خطوط الخلايا مستقرة التعبير عن بروتين الاهتمام

1. إعداد وسائل الاعلام من خلال إضافة FCS المعطل الحرارة و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين إلى المتاحة تجاريا Dulbecco's التعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع GlutaMAX-I، البيروفات، و 4.5 جم / L D-الجلوكوز.
2. زراعة خلايا HEK293 في وسائل الإعلام عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2. دون زراعة الخلايا كل يوم الثالث على التوالي. إزالة وسائل الإعلام وresuspend الخلايا في 15 مل وسائل الإعلام الجديدة. ماصة 1 مل في الجديدة 75 سم ² خلية قارورة الثقافة وإضافة 14 مل سائل الإعلام.
3. تحليل عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
4. البذور خلايا HEK293 في لوحة 6 جيدا في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 ⁵ خلايا لكل بئر واحتضان لمدة 24 ساعة.
5. لترنسفكأيشن استخدام بروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة للكاشف ترنسفكأيشن. Transfect الخلايا مع pEGFP-C2 أو pEGFP-C2-CaeB باستخدام كاشف ترنسفكأيشن. قبل استخدامها، الاحماء reag ترنسفكأيشنوالأنف والحنجرة وسائل الإعلام اللازمة لRT. استخدام 3: 1 نسبة ترنسفكأيشن الكاشف لDNA.
   1. في التفاصيل، ماصة 1.5 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن مباشرة في 50 ميكرولتر من المصل خالية DMEM المتوسطة. لتكوين معقد، ماصة 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي ترميز GFP أو GFP-CaeB إلى ترنسفكأيشن التي تحتوي على كاشف الخليط واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
   2. Transfect الخلايا عن طريق إضافة خليط التفاعل بطريقة الإفلات من الحكمة واحتضان عند 37 درجة مئوية في CO ₂ 5٪ لمدة 24 ساعة.
6. إضافة 1 ملغ / مل geneticin لاختيار من الحيوانات المستنسخة GFP إيجابية عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2.
7. بعد 6 أيام، عزل الخلايا وحيدة عن طريق التدفق الخلوي والفرز في لوحة 96-جيدا إيواء المتوسطة وHEK293 طاف في نسبة 1: 1. توليد HEK293 طاف من الخلايا متموجة HEK293 مثقف أن تم طرد لمدة 15 دقيقة في 4966 ز س.
8. في اليوم التالي، تحل محل الثقافة المتوسطة مع المتوسط ​​تحتوي على 1.50؛ ملغ / مل geneticin. تغيير وسائل الإعلام مرة واحدة في الأسبوع. إذا كانت الخلايا شكل أحادي الطبقة متموجة، نقلها إلى لوحة 24-جيدا. دون زراعة الخلايا مرتين في الأسبوع في نسبة 1: 5 في وسائل الإعلام التي تحتوي على 1.5 ملغ / مل geneticin. أخيرا، وتحليل نسبة الخلايا GFP إيجابية من خلال تحليل طخة مناعية والتدفق الخلوي.

تحليل 2. من خطوط الخلايا مستقرة خلال تحليل طخة مناعية

1. إزالة طاف وغسل الخلايا انضمت مرة واحدة مع PBS الدافئ. resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة، والحرارة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية وتخزينها في -20 ° C.
2. تحميل ما يقرب من 4 × 10 ⁴ خلايا لكل عينة على 12٪ هلام SDS-PAGE. بالإضافة إلى ذلك، حمولة 6 ميكرولتر من سلم البروتين التجاري باعتباره الوزن الواسمات الجزيئية. تشغيل المواد الهلامية في نظام الكهربائي للهلام في إطار الجهد المستمر من 180 V لل45-60 دقيقة مع 1X Laemmli عازلة على التوالي.
3. البروتينات وصمة عار على الأغشية PVDF (حجم المسام 0.45 ميكرون) في الجهد المستمر من 16 V لمدة 60 دقيقة باستخدام ترانس وصمة عار SD نقل خلية شبه الجافة.
4. الأغشية كتلة في 10 مل من 5٪ غير دهن الحليب الجاف في برنامج تلفزيوني / 0.05٪ توين 20 (MPT) لمدة 1 ساعة على RT.
5. تمييع 4 ميكرولتر من مكافحة GFP الأضداد في 4 مل من MPT واحتضان الأغشية O / N عند 4 درجات مئوية.
6. تنفيذ ثلاث خطوات الغسيل 10 دقيقة مع 10 مل من PBS / توين 20 بنسبة 0.05٪.
7. احتضان الأغشية مع 0.8 ميكرولتر من الفجل-البيروكسيديز مترافق الأجسام المضادة الثانوية في 4 مل من MPT.
8. بعد 1 ساعة حضانة في RT، وغسل الأغشية ثلاث مرات مع PBS / 0.05٪ توين 20 (كما هو موضح في 2.6) وكشف الفجل النشاط البيروكسيداز مع مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تطبيق التجهيزات القياسية للتنمية فيلم لتصور العصابات البروتين.

3. تحليل الخلايا باستخدام عداد الكريات التدفق.

1. الخلايا resuspend في برنامج تلفزيوني. استخدام الخلايا HEK293 كما سيطرة سلبية لضبط الشوري الأمامatter (FSC) والجانب مبعثر (SSC) بحيث الخلايا هي على نطاق واسع. رسم بوابة على الخلايا الحية من خلال استبعاد الحلل خلية، وحدات العمل والحطام الخلية.
2. ضبط أنبوب مضخم (PMT) مكاسب بحيث الخلايا غير ملوثين هي في أقصى اليسار من الرسم البياني للقناة FL1 (488 نانومتر الأرجون ليزر).
3. لتحليل كثافة مضان من HEK293-GFP وHEK293-GFP-CaeB خلايا فتح الرسم البياني للقناة FL1 والحصول على 10000 الأحداث على السكان بوابات.
4. تحليل البيانات باستخدام FACS التجارية برامج التحليل.

4. ترنسفكأيشن من مستقر خط الخلية مع محرض نظام ناقلات التعبير

1. البذور خلايا HEK293 يعبرون عن ثابت GFP أو GFP-CaeB في لوحة ال 12 أيضا في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 ⁵ خلايا / جيد.
2. 19 ساعة بعد البذر، وشارك في transfect الخلايا مع البلازميد منظم والبلازميد استجابة إما ترميز باكس أو كاسباس تنشيط 3.
   1. شارك في transfect الخلايا HEK293 مستقرةمع 100 نانوغرام من pWHE125-P منظم البلازميد (الشكل 2) و 100 نانوغرام من البلازميدات استجابة pWHE655-hBax أو pWHE655-revCasp3 (الشكل 3) و 0.4 ميكرولتر من polyethylenimine.
   2. إعداد DNA وpolyethylenimine ترنسفكأيشن كاشف كل في 75 ميكرولتر من غروب MEM المتوسطة واحتضان لمدة 5 دقائق بالضبط في RT. لتكوين معقد، واحتضان كل من الخلائط معا لمدة 15 دقيقة في RT.
3. إضافة polyethylenimine / DNA حل قطرة من الحكمة إلى الخلايا واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2.

5. استحثاث موت الخلايا المبرمج

1. 5 ساعة بعد ترنسفكأيشن، لحث التعبير من البروتينات الموالية لأفكارك طريق إضافة 1 ميكروغرام / مل الدوكسيسيكلين لثقافة المتوسط. احتضان الخلايا لمدة 18 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2.

تحليل 6. من الخلية المضيفة موت الخلايا المبرمج من قبل تحليل طخة مناعية

1. تفقد الخلايا قبل ساعةarvesting تحت المجهر الضوئي للتحقق من تحريض موت الخلايا. الخلايا أفكارك هي اكتشافها من خلال وجود هيئات أفكارك في الخلايا المحيطة بها الموت.
2. إزالة طاف وغسل الخلايا انضمت مرة واحدة مع PBS الدافئ. resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة، والحرارة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية وتخزينها في -20 ° C.
3. تحميل ما يقرب من 4 × 10 ⁴ خلايا لكل عينة على 12٪ هلام SDS-PAGE. بالإضافة إلى ذلك، حمولة 6 ميكرولتر من سلم البروتين التجاري باعتباره الوزن الواسمات الجزيئية. تشغيل المواد الهلامية في نظام الكهربائي للهلام في إطار الجهد المستمر من 180 V لل45-60 دقيقة مع 1X Laemmli عازلة على التوالي.
4. البروتينات وصمة عار على الأغشية PVDF (حجم المسام 0.45 ميكرون) في الجهد المستمر من 16 V لمدة 60 دقيقة باستخدام ترانس وصمة عار SD نقل خلية شبه الجافة.
5. الأغشية كتلة في 10 مل من 5٪ غير دهن الحليب الجاف في برنامج تلفزيوني / 0.05٪ توين 20 (MPT) لمدة 1 ساعة على RT.
6. تمييع 4 μل المضادة للالمشقوق بولي البلمرة ADP-ريبوز (PARP) الأجسام المضادة في 4 مل من MPT واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
7. تنفيذ ثلاث خطوات الغسيل 10 دقيقة مع 10 مل من PBS / توين 20 بنسبة 0.05٪.
8. احتضان الأغشية مع 0.8 ميكرولتر الفجل-البيروكسيديز مترافق الأجسام المضادة الثانوية المخفف في 4 مل MPT.
9. بعد 1 ساعة حضانة في RT، وغسل الأغشية ثلاث مرات مع PBS / 0.05٪ توين 20 (كما هو موضح في 6.7) وكشف الفجل النشاط البيروكسيداز مع مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تطبيق التجهيزات القياسية للتنمية فيلم لتصور العصابات البروتين.
10. إزالة الأجسام المضادة ملزمة 30 دقيقة حضانة في RT مع 7 مل البقعة الغربية تجريد العازلة.
11. بعد ثلاثة يغسل مع PBS / 0.05٪ توين 20 (كما هو موضح في 6.7)، تحقيق الأغشية مع 4 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة الأكتين في 4 مل من MPT O / N عند 4 درجات مئوية.
12. بعد ثلاث خطوات غسل MPT (كما هو موضح في 6.7)، واحتضان الأغشية مع 0.8 ميكرولتر من حوالأجسام المضادة البيروكسيديز مترافق rseradish الثانوية مخففة في 4 مل من MPT.
13. بعد 1 ساعة حضانة في RT، وغسل الأغشية ثلاث مرات مع PBS / 0.05٪ توين 20 (كما هو موضح في 6.7 وكشف الفجل النشاط البيروكسيداز مع مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تطبيق التجهيزات القياسية للتنمية فيلم لتصور العصابات البروتين.
    ملاحظة: تم تنفيذ جميع الخطوات الحضانة على شاكر لوحة للمرة المشار إليه ودرجة الحرارة.

أولا، تم إنشاء خطوط الخلايا HEK293 التعبير عن ثابت وبروتين من الفائدة (CaeB) كما بروتين GFP الانصهار. كعنصر تحكم، قد تولدت أيضا خطوط الخلايا HEK293 التعبير عن ثابت GFP. تم التحقق من التعبير عن GFP وGFP-CaeB عن طريق تحليل طخة مناعية. لطخة مناعية ممثل (الشكل 4A) يوضح التعبير مستقر وقابل للكشف بشكل واضح من GFP وGFP-CaeB. ومع ذلك، هذا الاختبار لا يمكن تحديد ما إذا كانت جميع خلايا تعبر عن GFP أو GFP-CaeB. لذلك، تم تحليل ستابلي خطوط الخلايا HEK293 أيضا التدفق الخلوي. كما هو مبين في الشكل 4B، وأعرب أكثر من 90٪ من الخلايا في كل من خطوط الخلايا GFP. وهكذا، هذه خطوط الخلايا مستقرة يمكن استخدامها لإجراء مزيد من التحليل وظيفة CaeB. في الخطوة التالية، ويعاير النشاط المناهض للأفكارك من CaeB عن طريق تحليل طخة مناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد PARP المشقوق. انشقاق بروتين من PARP النووي يعطل النشاط إصلاح الحمض النووي وهو علامة نموذجية من termiمراحل نال من موت الخلايا المبرمج. لم يتم الكشف عن انشقاق من PARP في HEK293-GFP أو خلايا HEK293-GFP-CaeB، مما يدل على أن أيا من التعبير عن GFP، ولا من GFP-CaeB غير سامة للخلايا. ومع ذلك، عندما تم علاج الخلايا مع staurosporine، وهو محفز قوي للموت الخلايا المبرمج الجوهرية، تم الكشف عن انشقاق من PARP (الشكل 5). الأهم من ذلك، تظهر خلايا HEK293-GFP-CaeB تخفيض الانقسام من PARP، مما يدل على النشاط المناهض للأفكارك من الكوكسيلا البورنيتية النوع الرابع البروتين نظام إفراز المستجيب CaeB 7.

تحليل في الخطوة التي CaeB يتداخل مع مسار أفكارك، كان يعمل على نظام تيت أون. في التفاصيل، و transfected الخلايا HEK293-GFP أو HEK293-GFP-CaeB مع البلازميد منظم يعبرون بشكل جوهري على كاظمة المزدوج / الإعداد التي تسيطر عليها دوكسي المنشط (الشكل 2) والترميز pTRE استجابة البلازميد إما كامل طول باكس البشري أو شكل تفعيلها لل كاسباس الإنسان 3، ووصف revCasp 3 (الشكل 3). وينظم هذا النظام بإحكام، كما يدل على ذلك عدم وجود PARP الانقسام تحت غير الذي يحفز الظروف (الشكل 6). أدت إضافة دوكسي إلى الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في التعبير عن باكس أو revCasp 3. إذا يتدخل CaeB مع مسار أفكارك المصب باكس، ثم يجب أن يكون قد تم حظره إشارة أفكارك الناتجة عن التعبير وتفعيل لاحق من قبل باكس CaeB التعبير. في الواقع، وخلايا HEK293 يعبرون عن ثابت GFP-CaeB تمنع عميقا موت الخلايا المبرمج من قبل التعريفي التي تسيطر عليها دوكسي باكس التعبير، في حين أن الخلايا HEK293-GFP عرض واضح PARP الانقسام. هذه النتيجة تشير إلى أن CaeB كتل الخلايا تحريض المصب من تفعيل باكس. بعد ذلك، تم تحليل ما إذا CaeB يمكن أن تتداخل مع كاسباس 3 التنشيط - حدث في وقت متأخر من مسار أفكارك. خلايا HEK293-GFP، وكذلك خلايا HEK293-GFP-CaeB، انشقاق المعرض PARP (الشكل 6)، مشيرا إلى أنه بمجرد أن كاسباس المستجيب 3 وأكتيفلا يمكن ATED، CaeB منع موت الخلايا المبرمج من الحدوث. معا المتخذة، وتظهر هذه البيانات التي CaeB يعمل بين باكس وكاسباس 3 التنشيط.

الشكل 1. نظرة عامة تخطيطي للنظام التنظيمي التتراسيكلين. ويتألف نظام تيت-على اثنين من البلازميدات مختلفة، البلازميدات التنظيمية والاستجابة لها. البلازميد التنظيمي بترميز transsilencer تيت-استجابة (تحويل النص إلى كلام، شغل دائرة) وtransactivator عكس تيت متجاوبة (rtTA، دائرة مفتوحة). يتم التعبير عن كل من البروتينات بشكل جوهري تحت سيطرة القوي، التأسيسي استطالة عامل 1 ألفا المروج (P EF-1A). TTS وrtTA هي عوامل النسخ خيالية تتكون من مجال حقيقيات النوى النسخي التنظيمي (كاتم الصوت أو المنشط، على التوالي)، وكاظمة التتراسيكلين البكتيري (TetR). TetR يتوسط DNA ملزمة لسبعة تيت م> مشغل (تيتو) تسلسل على البلازميد استجابة يقع TETO المنبع للمحرض الحد الأدنى من الفيروس المضخم للخلايا المروج (P CMV)، جنبا إلى جنب تشكيل العنصر تيت المراعية لل(TRE). في ظل ظروف غير المحفزة، تحويل النص إلى كلام لا بد أن TRE منع التعبير. بعد إضافة الدوكسيسيكلين (دوكس، شغل الماس)، يتفاعل مع rtTA دوكس مما يؤدي إلى تغيرات متعلق بتكوين والتنشيط. تنشيط rtTA يستبدل تحويل النص إلى كلام على البلازميد ردا على ذلك، يسمح النسخ من الجينات المستهدفة منها باكس وكاسباس 3، مما يؤدي إلى تحريض موت الخلايا المبرمج وموت الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. نظرة تخطيطية للالبلازميد pWHE125 التنظيمية. عناصر أساسية لنشر في البكالورياالبكتيرات، بما في ذلك أصل التكرار (أوري PBR) وكاسيت مقاومة المضادات الحيوية ضد الأمبيسلين (الأمبير R)، وللتعبير عن تيت-transregulators، مثل قوي، التأسيسي الفورية المبكرة المروج / محسن من الفيروس المضخم للخلايا البشرية (P / E hCMV)، وهو موقع الريبوسوم الداخلية ملزم من شلل الأطفال للفيروسات (PV-IRES) والموقع بوليا من فيروس قردي 40 (SV40 بوليا) يتم عرضها. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. نظرة تخطيطية للالبلازميد استجابة. عناصر أساسية لانتشار البكتيريا، بما في ذلك أصل التكرار (أوري PBR) والمقاومة للمضادات الحيوية كاسيت (الأمبير R)، وللتعبير محرض في حقيقيات النوى، مثل expressi التحويرعلى شريط كاسيت مع المروج تيت التي تعتمد على الحد الأدنى من TREtight (P TREtight)، الجينات في المصالح البشرية باكس (hBax) وموقع بوليا من فيروس قردي 40 (SV40 بوليا)، ويصور. ويحيط الكاسيت التحوير التعبير يكرر جنبا إلى جنب مباشرة من نسختين من الدجاج HS4 تسلسل عازل الأساسية (HS4 الأساسية). بالإضافة إلى ذلك، كاسيت المقاومة G418 تتألف من الفئران فسفوغليسرات كيناز 1 المروج (P mPGK)، مقاومة الجينات بالنيوميسين (G418 R) وموقع بوليا كيناز ثيميدين الإنسان (TK بوليا) موجود. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4. HEK293-GFP وHEK293-GFP-CaeB تعبر عن ثابت البروتينات الفلورية الخضراء. (A) لست] خلية كاملة من HEK293-GFP وتم immunoblotted خلايا HEK293-GFP-CaeB لGFP لإظهار التعبير مستقرة. يظهر (B) التدفق الخلوي ممثل (FACS) تحليل HEK293-GFP والخلايا HEK293-GFP-CaeB للتدليل على شدة التعبير GFP. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

وعولج الشكل 5. آثار التعبير عن GFP-CaeB على يسببها staurosporine موت الخلايا المبرمج. HEK293-GFP والخلايا HEK293-GFP-CaeB مع 4 ميكرومتر staurosporine عن 6 ساعات للحث على موت الخلايا المبرمج الجوهرية. تم تحليل الخلايا التي المشقوق تحليل PARP طخة مناعية. تم تخفيض PARP الانقسام في الخلايا HEK293-GFP-CaeB بالمقارنة مع خلايا HEK293-GFP. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبرمن هذا الرقم.

الرقم 6. استخدام النظام تيتون لتضييق نقطة عمل CaeB. وكان المستحث (A) موت الخلايا المبرمج من قبل التعبير عن باكس في HEK293-GFP والخلايا HEK293-GFP-CaeB. تم تحليل الخلايا التي المشقوق تحليل PARP طخة مناعية. تم تخفيض PARP الانقسام في الخلايا HEK293-GFP-CaeB بالمقارنة مع خلايا HEK293-GFP. وكان المستحث (B) موت الخلايا المبرمج من قبل التعبير عن revCasp 3 في HEK293-GFP والخلايا HEK293-GFP-CaeB. تم تحليل الخلايا التي المشقوق تحليل PARP طخة مناعية. كان PARP انشقاق مماثل في خلايا HEK293-GFP-CaeB وHEK293-GFP. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.