Method Article

تطبيق نظام التعبير محرض لدراسة التدخل من العوامل البكتيرية الفوعة مع اشارة بين الخلايا

DOI:

10.3791/52903

⸱

June 25th, 2015

 ,  ,  , 
1Department Biologie, Friedrich-Alexander-Universität, 2Institut für Molekulare Pathogenese, Friedrich-Loeffler-Institut, 3Mikrobiologisches Institut - Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, Universitätsklinikum Erlangen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم الطريقة الموضحة هنا للحث على سلسلة إشارات موت الخلايا المبرمج في خطوات محددة من أجل تشريح نشاط بروتين المستجيب البكتيري المضاد لموت الخلايا المبرمج. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للتعبير المحفز عن البروتينات المؤيدة لموت الخلايا المبرمج أو السامة ، أو لتشريح التداخل مع مسارات الإشارات الأخرى.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنية المعروضة هنا يسمح احد لتحليل في الخطوة التي بروتين الهدف، أو بدلا من ذلك جزيء صغير، تتفاعل مع مكونات مسار الإشارات. وتستند هذه الطريقة، من جهة، على التعبير عن محرض من بروتين معين لبدء الحدث الإشارات في خطوة محددة ومقررة مسبقا في شلال يشير المحدد. التعبير يصاحب ذلك، من ناحية أخرى، من الجينات في المصالح ثم يسمح للمحقق لتقييم ما إذا كان النشاط من البروتين المستهدف أعرب يقع المنبع أو المصب لهذا الحدث مما يشير بدأت، اعتمادا على قراءات من مسار الإشارات التي يتم الحصول عليها. هنا، تم اختيار سلسلة أفكارك كمسار إشارات محددة لإثبات وظائف البروتوكول. البكتيريا المسببة للأمراض، مثل الكوكسيلا البورنيتية، نقل من البروتينات المستجيب التي تتداخل مع الحث موت الخلايا المضيفة في الخلية المضيفة لضمان بقاء البكتيريا في الخلية وللترويج لنشر في الكائن الحي. وC. بروتين المستجيب البورنيتية CaeB يمنع بشكل فعال موت الخلايا المضيفة بعد استحثاث موت الخلايا المبرمج مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية أو مع staurosporine. لتضييق على الخطوة التي CaeB يتداخل مع انتشار الإشارة أفكارك، وأعرب عن البروتينات المحددة مع جيدا اتسم بالنشاط المساعد على أفكارك عابر بطريقة الدوكسيسيكلين محرض. إذا يعمل CaeB المنبع من هذه البروتينات، وموت الخلايا المبرمج المضي قدما دون عوائق. إذا يعمل CaeB المصب، سيتم تحول دون موت الخلايا. كانت البروتينات الاختبار المختارة باكس، الذي يعمل على مستوى الميتوكوندريا، وكاسباس 3، وهو الأنزيم البروتيني الجلاد كبير. CaeB يتداخل مع موت الخلايا الناجم عن باكس التعبير، ولكن ليس عن طريق كاسباس 3 التعبير. CaeB، وبالتالي يتفاعل مع تتالي أفكارك بين هذه البروتينات اثنين.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفوعة للعوامل الممرضة سلبية الغرام البكتيرية تعتمد على أنظمة إفراز المتخصصة لخطف الخلايا المضيفة حقيقية النواة. البكتيريا تستخدم هذه النظم إفراز لحقن البروتينات الفوعة البكتيرية (المؤثرات) في الخلية المضيفة لتعديل مجموعة متنوعة من الأنشطة الخلوية والكيمياء الحيوية. قدمت دراسة البروتينات المستجيب ليس فقط نظرة ملحوظة في الجوانب الأساسية للمضيف / التفاعلات الممرض ولكن أيضا في البيولوجيا الأساسية للخلايا حقيقية النواة 1. وقد تبين أن التشكيل من موت الخلايا المبرمج الخلية المضيفة أن تكون آلية الفوعة هامة لكثير من الكائنات الممرضة داخل الخلايا، كما تم تحديد عدد من البروتينات المستجيب تحوير الخلايا 2-9. ومع ذلك، ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. جيل من خطوط الخلايا مستقرة التعبير عن بروتين الاهتمام

  1. إعداد وسائل الاعلام من خلال إضافة FCS المعطل الحرارة و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين إلى المتاحة تجاريا Dulbecco's التعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع GlutaMAX-I، البيروفات، و 4.5 جم / L D-الجلوكوز.
  2. زراعة خلايا HEK293 في وسائل الإعلام عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. دون زراعة الخلايا كل يوم الثالث على التوالي. إزالة وسائل الإعلام وresuspend الخلايا في 15 مل وسائل الإعلام الجديدة. ماصة 1 مل في الجديدة 75 سم 2....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أولا، تم إنشاء خطوط الخلايا HEK293 التعبير عن ثابت وبروتين من الفائدة (CaeB) كما بروتين GFP الانصهار. كعنصر تحكم، قد تولدت أيضا خطوط الخلايا HEK293 التعبير عن ثابت GFP. تم التحقق من التعبير عن GFP وGFP-CaeB عن طريق تحليل طخة مناعية. لطخة مناعية ممثل (الشكل 4A) يوضح التعبير مستقر وقابل للكشف بشكل واضح من GFP وGFP-CaeB. ومع ذلك، هذا الاختبار لا يمكن تحديد ما إذا كانت جميع خلايا تعبر عن GFP أو GFP-CaeB. لذلك، تم تحليل ستابلي خطوط الخلايا HEK293 أيضا التدفق الخلوي. كم.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العديد من أنواع البكتيريا المسببة للأمراض تؤوي أنظمة إفراز لإفراز أو نقل من البروتينات المستجيب البكتيرية إلى داخل الخلية المضيفة. هذه البروتينات المستجيب لديها القدرة على تعديل العمليات ومسارات في الخلية المضيفة، مما يسمح للبكتيريا من أجل البقاء وتكرار داخل مكانة داخل الخلايا في كل منها. وفهم الأنشطة البيوكيميائية والآليات الجزيئية من البروتينات المستجيب مساعدة نحو فهم أفضل للالمرضية ويمكن أن تساعد على تطوير أدوات علاجية جديدة لمكافحة المرض. وعلاوة على ذلك، حيث أن البروتينات المس.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) من خلال مبادرة البحث التعاوني 796 (SFB796) إلى A.L. و CB ، ومن خلال مكالمة ERA-NET PathoGenoMics 3 rd إلى A.L.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM Life Technologies31966-021
FCSBiochromS0115
القلم / البكتيريا العصبية15140-122
تقنيات الحياة OptiMEM51985
X-tremeGENE 9Roche6365752001
GeneticinRothCP11.3
PolyethyleniminePolyscienes23966
DoxycyclineSigma AldrichD9891
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad165-8000EDU
Trans-Blot SD خلية نقل شبه جافةBio-Rad170-3940
PageRuler سلم البروتينالملون Thermo Scientific26616
غشاءPVDFMilliporeIPVH00010
مكافحة GFP لايف تكنولوجيزA6455
المضاد للشق PARPBD Bioscience611038
مضاد للأكتينسيجما ألدريتشA2066
ماوس IgG (H + L) -HRPODianova111-035-062
Rabbit IgG (H + L) -HRPODianova111-035-045
ECL Western BlotSubstrate Thermo Scientific32106
Restore Plus Western Blot Stripping BufferThermo Scientific46428
تقنيات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
  2. Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death member....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bacterial Virulence FactorsIntracellular SignalingInducible Expression SystemApoptotic CascadeWestern BlottingFlow CytometryDoxycycline InductionCaspase 3Bax ProteinPARP Cleavage

Related Articles