Method Article

ارتفاع العائد ونظام التعبير التكلفة ذات كفاءة من Granzymes الإنسان في خلايا الثدييات

DOI:

10.3791/52911

⸱

June 10th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Medicine Program, Boston Children’s Hospital and Harvard Medical School, 2Department of Medicine, University of Fribourg, 3Centre Médical Universitaire, University of Geneva

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف هنا نظام تعبير الجرانزيم الفعال من حيث التكلفة باستخدام خلايا HEK293T تنتج عوائد عالية من البروتياز النقي والجليكوزيل بالكامل والنشط إنزيميا.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عندما تتعرف الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا (CTL) أو الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) على الخلايا السرطانية أو الخلايا المصابة بمسببات الأمراض داخل الخلايا ، فإنها تطلق محتواها من الحبيبات السامة للخلايا للقضاء على الخلايا المستهدفة وممرض داخل الخلايا. يحدث موت الخلايا المضيفة ومسببات الأمراض داخل الخلايا عن طريق بروتياز السيرين الحبيبي ، الجرانزيم (Gzms) ، الذي يتم توصيله إلى العصارة الخلوية للخلية المضيفة عن طريق بروتين البرفورين المشكل للمسام (PFN) وفي مسببات الأمراض البكتيرية بواسطة الغشاء بدائي النواة الذي يعطل بروتين الحبيبات (GNLY). للتحقيق في الآليات الجزيئية لموت الخلايا المستهدفة بوساطة Gzms في البيئات المختبرية التجريبية ، من الضروري استخدام أنظمة التعبير والتنقية للبروتين التي تنتج كميات كبيرة من الإنزيمات النشطة. تشير أنظمة التعبير عن البروتين المفرز من الثدييات إلى القدرة على إنتاج بروتين مطوي بشكل صحيح ويعمل بكامل طاقته يحمل تعديلا بعد الترجمة ، مثل الارتباط بالجليكوزيل. لذلك ، استخدمنا طريقة ترسيب الكالسيوم فعالة من حيث التكلفة للتعداء العابر للخلايا HEK293T مع Gzms البشري المستنسخ في تعبير البلازميد pHLsec. تم تحقيق تنقية Gzm من المادة الطافية المزروعة عن طريق كروماتوغرافيا تقارب النيكل المجمدة باستخدام علامة البولي هيستيدين C-terminal التي يوفرها المتجه. سمح إدخال موقع المعوي في الطرف N للبروتين بتوليد البروتياز النشط الذي تم تنقيته أخيرا عن طريق كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني. تم اختبار النظام من خلال إنتاج مستويات عالية من Gzm A و B و M البشري السام للخلايا ويجب أن يكون قادرا على إنتاج كل إنزيم تقريبا في جسم الإنسان بإنتاجية عالية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وGzms أسرة مكونة من البروتياز سيرين مثلي غاية موضعية في الجسيمات الحالة المتخصصة CTL وخلايا NK 1. تحتوي على حبيبات السامة للخلايا من هذه الخلايا القاتلة أيضا البروتينات تعطيل غشاء PFN وGNLY التي تم إصدارها في وقت واحد مع Gzms على الاعتراف الخلية المستهدفة الموجهة للقضاء 2،3. هناك خمسة Gzms في البشر (GzmA، B، H، K و M)، و 10 Gzms في الفئران (GzmA - G، K، M و N). GzmA وGzmB هي الأكثر وفرة، ودرس على نطاق واسع في البشر والفئران 1. ومع ذلك، فقد بدأت دراسات أكثر حداثة للتحقيق في مسارات الخلايا من الموت، فضلا عن الآثار البيولوجية إضافية بوساطة من قبل الطرف الآخر، ما يسمى Gzms اليتيم في الصحة والمرض (4).

وظيفة الأكثر شهرة من بين Gzms، ولا سيما من GzmA وGzmB، هو تحريض موت الخلايا المبرمج في خلايا الثدييات عندما سلمت إلى الخلايا المستهدفة من قبل PFN 5،6. لكنأظهر المزيد من الدراسات الحديثة أيضا آثار خارج الخلية من Gzms مع تأثير عميق على تنظيم جهاز المناعة والالتهابات، بصرف النظر عن تسليم عصاري خلوي من قبل PFN 7،8. كما تم توسيع نطاق من الخلايا التي يتم قتل بكفاءة بعد دخول عصاري خلوي من Gzms مؤخرا من خلايا الثدييات للبكتيريا 9،10 وحتى بعض الطفيليات 11. هذه الاكتشافات الحديثة فتحت حقل جديد كليا للباحثين Gzm. ولذلك، فإن لذلك، عالية الغلة نظام التعبير الثدييات فعالة من حيث التكلفة يخفف إلى حد كبير من الطريق لتلك الدراسات المستقبلية.

تم تخصيبه الإنسان، والماوس والفئران مواليد Gzms بنجاح من جزء الحبيبية من CTL والخلايا القاتلة الطبيعية خطوط 12-14. ومع ذلك، في أيدينا العائد من هذه التقنيات تنقية هو في حدود الثقافة أقل من 0.1 ملغم / لتر الخلية (المراقبة غير منشورة و 12). وعلاوة على ذلك، فإن القرار الكروماتوغرافي من Gzm واحد دون التلوث آلات موسيقية أخرىص Gzms و / أو البروتينات التي هي أيضا موجودة في حبيبات يتحدى (بيانات غير منشورة و12،14). أنتجت Gzms المؤتلف في البكتيريا 15، 16 الخميرة، وخلايا الحشرات 17 وحتى في خلايا الثدييات مثل HEK 293 18،19. فقط الأنظمة التعبير الثدييات تحمل القدرة على إنتاج الإنزيمات المؤتلف مع التعديلات posttranslational متطابقة إلى البروتين السامة للخلايا الأم. قد تورطت التعديلات Posttranslational مع امتصاص محددة من قبل الإلتقام وتوطين الخلايا من البروتيني داخل الخلايا المستهدفة 20-22. ولذلك، باستخدام pHLsec 23 (هدية كريمة من رادو Aricescu وايفون جونز، جامعة أوكسفورد، المملكة المتحدة) باعتبارها العمود الفقري البلازميد لGzm التعبير، أنشأنا نظام بسيط زمني وفعالة من حيث التكلفة لإنتاج بروتين عالية الغلة في خلايا HEK293T. pHLsec يجمع بين محسن CMV مع الدجاج Β أكتين المروج. معا، وهذه العناصر demonstraتيد أقوى نشاط المروج في مختلف خطوط الخلايا 24. بالإضافة إلى ذلك، البلازميد يحتوي على أرنب Β-غلوبين إنترون، إلى أقصى حد كوزاك وإفراز الإشارات، واليس-6xHis العلامة وبولي-A إشارة. إدراج يمكن استنساخ مريح بين إشارة إفراز واليس-6xHis العلامة (الشكل 1) ضمان التعبير الأمثل وكفاءة إفراز البروتينات التي تفتقر إلى المجالات N-المحطة المناسبة. للتعبير عن Gzms، استبدلنا الذاتية تسلسل إشارة إفراز مع إشارة إفراز المقدمة من ناقلات يعقبه إنتيروكيناز (EK) الموقع (DDDDK) بحيث العلاج EK تنشيط Gzms يفرز (Gzms نشاطا تبدأ مع N-محطة تسلسل الأحماض الأمينية IIGG 25). بالإضافة إلى ذلك لصالح لهذا الأسلوب، وخلايا HEK293T تنمو بسرعة في البلدان المنخفضة المتوسطة الثمن، مثل Dulbecco لتعديل متوسطة النسر (DMEM)، وهي مناسبة تماما للفعالة من حيث التكلفة الكالسيوم فوسفات طريقة ترنسفكأيشن.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إنتاج البلازميد التعبير pHLsec-Gzm

  1. تحضير الحمض النووي الريبي مجموع من خلايا NK الإنسان (الخلايا الأولية التي أعدت كما في 26 أو خط الخلايا القاتلة الطبيعية NK-92 معربا عن Gzms الإنسان خمسة) باستخدام طريقة مناسبة عزل الحمض النووي الريبي وتدوين عكس باستخدام طقم كدنا] توليف الأولى المنطلق، بعد manufacturer` الصورة التوصيات. تضخيم Gzm كدنا] باستخدام PCR واستنساخ إلى pHLsec كما هو موضح في 23 (هدية كريمة من رادو Aricescu وايفون جونز، جامعة أوكسفورد، المملكة المتحدة) باستخدام مواقع AgeI وKpnI (الشكل 1).
    ملاحظة: استخدام البادئات التالية مبين في الجدول 1.
  2. تأكيد إدراج الصحيحة بواسطة التسلسل. توسيع البلازميدات التعبير في الخلايا DH5α وتنقية باستخدام البلازميد العزلة عدة خالية من الذيفان الداخلي واتباع تعليمات الشركة الصانعة.
  3. Resuspend والبلازميدات النقاء في خالية من الذيفان الداخلي، الماء المعقم بتركيز 2 ملغ / مل وتخزينها في -20 ° C أونتيل الاستخدام.

2. التعبير عن Gzms في الخلايا HEK293T

  1. إعداد الكواشف
    1. إعداد معيار مستنبت. لDulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) التي تحتوي على ارتفاع نسبة الجلوكوز (25 ملم)، GlutaMax (4 ملم)، البيروفات الصوديوم (1 ملم) تضيف 10٪ من معيار مصل العجل الجنين (FCS)، البنسلين (100 وحدة / مل)، الستربتومايسين ( 100 ميكروغرام / مل).
    2. إعداد ترنسفكأيشن المتوسطة. إلى مستنبت دون البنسلين، الستربتومايسين إضافة 25 ميكروغرام / مل الكلوروكين (إضافة الطازج في اليوم ترنسفكأيشن من 1،000x الأسهم في برنامج تلفزيوني، وتخزينها في -20 ° C).
    3. إعداد المصل خالية مستنبت: لمصل خالية المتوسطة للHEK293 الخلايا تضيف الجلوتامين (4 ملم)، البنسلين (100 وحدة / مل)، الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل)، و2.5mg / L الأمفوتريسين B.
    4. إعداد الحلول هو موضح في الجدول (2) وفلتر مع 0.45 ميكرون التصفية قبل الاستخدام:
  2. توسيع الخلايا HEK293T
    1. زراعة خلايا HEK293T في 20 مل عبادةلدى عودتهم المتوسطة باستخدام 150 × 25 ملم أطباق زراعة الأنسجة.
    2. تقسيم الخلايا في 80٪ confluency (تقسيم نسبة 1: 4، وعادة كل يوم 3 الثالثة). خلايا إرفاق فضفاضة، فإنها يمكن أن تكون منفصلة ميكانيكيا دون trypsinization من قبل pipetting بصرامة صعودا وهبوطا.
    3. خلايا لوحة ليلة قبل ترنسفكأيشن لإعطاء 60-70٪ confluency في يوم من ترنسفكأيشن (كثافة البذر ~ 2 × 10 5 خلية / مل). A حجم إعداد المعتاد يتكون من 20-25 أطباق الثقافة.
  3. ترنسفكأيشن الكالسيوم الفوسفات
    1. 1 ساعة قبل ترنسفكأيشن، وتغيير ثقافة المتوسط ​​القياسي إلى 20 مل ترنسفكأيشن المتوسطة. قرب نهاية هذه الخطوة حضانة 1 ساعة، مزيج 400 ميكروغرام من DNA البلازميد مع 10.95 مل ده 2 0 و 1.55 مل من 2M CaCl 2 في 50 مل أنابيب (1 أنبوب / 5 أطباق).
    2. 1-2 دقيقة قبل ترنسفكأيشن، إضافة 12.5 مل 2X HBS إلى 12.5 مل من محلول الحمض النووي الكالسيوم، مزيج من قبل انعكاس للأنابيب واحتضان لمدة 30 ثانية في RT.
    3. إضافة عشرخليط ه أعدت في 2.3.2 مباشرة إلى الخلايا (5 مل لكل طبق)، وانخفاض الحكيم في المتوسط. يرش بالتساوي على المنطقة بأكملها، وتحول المتوسطة إلى اللون البرتقالي قليلا.
    4. احتضان الأطباق ثقافة 7-11 ساعة في حاضنة زراعة الأنسجة (37 ° C، 5٪ CO 2 في الهواء مرطب). بعد الحضانة، وراسب غرامة مرئيا. إزالة المتوسطة ترنسفكأيشن، شطف بعناية مع برنامج تلفزيوني قبل تحسنت وإضافة 20 مل مستنبت المصل خالية أعدت في 2.1.3. احتضان لمدة 72 ساعة في حاضنة زراعة الأنسجة.
    5. تحليل ترنسفكأيشن والتعبير الكفاءة عن طريق تشغيل العينة (~ 20 ميكرولتر) من طاف الخلية على SDS-PAGE وتلطيخ مع Coomassie بريليانت الأزرق لتصور الفرقة granzyme.
  4. تنقية Gzms من ثقافة طاف بواسطة النيكل IMAC
    1. بعد الحضانة، صب supernatants ثقافة الخلية إلى 250 مل أنابيب واضحة عن طريق الطرد المركزي. تنفيذ تدور الأول (400 x ج، 10 دقيقة، 4 درجاتC) من شأنها أن مسح المتوسطة من خلايا منفصلة. نقل طاف في طازجة 250 مل أنابيب وتدور في 4000 x ج، 30 دقيقة على 4 درجات مئوية لإزالة أي حطام الخلايا المتبقية.
    2. إضافة 5 مل من 5 M كلوريد الصوديوم، 6.25 مل من 2 M تريس قاعدة (درجة الحموضة 8) و 1 مل من 0،25 M NISO 4 في 250 مل من طاف تطهيرها. تصفية طاف باستخدام وحدة تصفية فراغ 500 مل (0.45 ملم).
    3. تتوازن عمود النيكل IMAC مع صاحب ملزم عازلة A (10 مجلدات العمود، CV) باستخدام نظام FPLC مناسبة.
    4. تطبيق طاف مسح إلى العمود معايرتها بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    5. بعد تطبيق طاف، ويغسل العمود مع صاحب ملزم مخزن مؤقت حتى يتم التوصل إلى امتصاص الأشعة فوق البنفسجية الأساس (عادة 10 CV).
    6. أزل Gzms مع خطي 20 مل التدرج (0-250 ملم إميدازول) بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة في حين جمع 2 مل-الكسور. تحليل الكسور شطف بواسطة SDS-PAGE وCoomassie تلطيخ.
  5. إنتيروكيناز (EK)العلاج والنهائي تنظيف كتبها الموجبة تبادل اللوني
    1. تجمع Gzm تحتوي على كسور في أنبوب dialyzing مع ≤10 MWCO. تخزين عينة صغيرة في -20 ° C عن السيطرة قبل EK.
    2. إضافة EK عند 0.02 وحدة / 50 مل من طاف الأولي مباشرة إلى جزء المجمعة في الأنبوب غسيل الكلى وdialyze O / N (لا يقل عن 16 ساعة) في RT في EK-عازلة (4 L، تغيير عازلة مرة واحدة).
    3. في اليوم التالي، وتحليل EK تعامل Gzms بالمقارنة مع ما قبل EK سيطرة SDS-PAGE وCoomassie تلطيخ.
    4. عندما تجهيز N-محطة كاملة، تغيير غسيل الكلى عازلة لS العازلة A (4 L) وdialyze للساعة 4 أخرى في RT. مرشح ديالة (0.45 ميكرون).
    5. تتوازن لS-عمود مع S عازلة A. تحميل العينة على العمود مع بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    6. بعد تحميل عينة، وغسل العمود مع S عازلة A حتى يتم التوصل إلى الأشعة فوق البنفسجية الأساس الامتصاصية (حوالي 10 CV). أزل Gzms مع 30 مل الانحدار الخطي (150 إلى 1000 ملي كلوريد الصوديوم). GzmA هالعود في ~ 650 ملي كلوريد الصوديوم، GzmB في ~ 700 ملي كلوريد الصوديوم وGZMM في ~ 750 ملي كلوريد الصوديوم.
    7. تحليل الكسور شطف بواسطة SDS-PAGE والمقايسات اللونية (انظر أدناه). كسور بركة تحتوي على Gzms والتركيز (حوالي 30 أضعاف، إلى تركيز من حوالي 100 ميكرومتر) في المرشحات تدور (15 مل، 10 MWCO). قسامة الاستعدادات Gzm يتركز وتخزينها في -80 ° C.

النشاط 3. اختبار Gzm

  1. إعداد الكواشف
    1. إعداد اللونية العازلة مقايسة: 50 ملي تريس، قاعدة، ودرجة الحموضة 7.
      1. لقياس GzmA، إضافة نا CBZ-L-ليسين thiobenzyl استر (S-BZL) (BLT) إلى المخزن المؤقت مقايسة إلى التركيز النهائي من 0.2 ملم و5،5'-ثنائي ثيو؛ ديثيو مكرر (حمض 2-nitrobenzoic) (DTNB) إلى تركيز 0.22 ملم. لGzmB، وتشمل 0.2 ملي بوك علاء علاء-ASP-S-BZL (AAD) و 0.22 ملي DTNB. لGZMM، وتشمل 0.2 ملي يمث علاء علاء-PRO-لوي-P-nitroanilide (السلطة الوطنية الفلسطينية) (AAPL). وأضاف الببتيدات الاصطناعية من الحلول الأسهم المناسبة (في DMSO، ستورإد في -20 ° C) إلى المخزن المؤقت الطازج قبل الفحص.
    2. يعد انشقاق فحص العازلة: 100 ملي كلوريد الصوديوم، و 50 ملي تريس، قاعدة، ودرجة الحموضة 7.5
  2. المقايسات اللونية
    1. توزيع عينات Gzm الصغيرة (<5 ميكرولتر) من الكسور شطف أو الأسهم تتركز في ال 96 جيدا مسطحة القاع لوحات. تشمل مراقبة إيجابية (مستحضرات Gzm اختبار أو الخام لست] خلية NK) والسيطرة السلبية (العازلة فقط).
    2. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة الفحص إلى كل بئر (باستخدام ماصة متعدد القنوات). احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 ° C. قياس OD في 405 نانومتر في قارئ صفيحة ميكروسكوبية.
  3. انشقاق فحص
    1. لفحوصات انشقاق باستخدام ركائز النقاء، وشارك في احتضان ركيزة البروتين (اللغة الأم أو المؤتلف، 100-400 نانومتر؛ يتم عرض بعض الأمثلة من ركائز Gzm كفاءة في القسم نتيجة والملاحظة في نهاية هذا القسم) مع التخفيفات المسلسل من Gzm (ابتداء من 400 نانومتر) في المخزن فحص لأوقات مختلفة.تحليل بواسطة SDS-PAGE وCoomassie أو الفضة تلطيخ. أو عن طريق ويسترن النشاف باستخدام أجسام مضادة محددة.
    2. لفحوصات انشقاق باستخدام الخلية لست]، تعليق 10 6 خلايا هيلا (أو أي خط الخلايا السرطانية متوفرة) في 1 مل من العازلة الفحص وليز من خلال تجميد في الإيثانول / الجاف حمام الجليد وذوبان الجليد عند 37 درجة مئوية ثلاث مرات. إزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي (15000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية).
    3. شارك في احتضان المحللة تطهيرها مع Gzms في تركيزات مختلفة ومرات على النحو الوارد أعلاه. تم الكشف عن انشقاق من قبل immunoblotting باستخدام الأجسام المضادة المناسبة.
      ملاحظة: وهناك أمثلة قليلة من ركائز الحسنة النية التي هي الأجسام المضادة التجارية المتاحة: المزايدة (BH3-التفاعل ناهض الموت المجال) وكاسباس 3 المشقوق من قبل GzmB 27،28. متعددة ribonucleoproteins النووية غير متجانسة (hnRNPA1، A2 وU) المشقوق من قبل GzmA 29؛ الفيروس المضخم للخلايا بروتين فسفوري؛ فسوبروتين 71 بواسطة GZMM 30.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في القسم التالي سنعرض وثائق كاملة لإعداد GzmA لإلقاء الضوء على الأسلوب. نحن أيضا تنقية بنجاح GzmB وGZMM، وتنتج نتائج مماثلة فيما يتعلق كفاءة تنقية والنشاط. ومع ذلك، من تلك التحضيرات في وقت لاحق سوف نظهر فقط بضع قطع مختارة من البيانات. استخدمت الاستعدادات GzmB من خلايا 293T بعد بروتوكول الحالي في العديد من الدراسات المنشورة، تسليط الضوء على نشاطها في مختلف النظم فحص البيولوجية 9،29،31-34.

ويرد تنقية Gzm...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدور الكلاسيكي، ودرس على نطاق واسع من GzmA وGzmB هو استحثاث موت الخلايا المبرمج في خلايا الثدييات بعد الولادة عصاري خلوي من خلال البروتين تشكيل المسام PFN 1. مؤخرا، تم توسيع نطاق السامة للخلايا من Gzms كبير من خلايا الثدييات للبكتيريا 9،10، فضلا عن بعض الطفيليات 11. وعلاوة على ذلك، وغير التقليدية، وظائف خارج الخلية من GzmA وGzmB فضلا عن الأهمية البيولوجية من مختلف Gzms اليتيم لا تزال غامضة. ولذلك، فإن التعبير وتنقية النظام الزمني وفعالة من حيث الت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بمنح من مؤسسة نوفارتيس للبحوث الطبية والبيولوجية ومن مجموعة الأبحاث بجامعة فريبورغ (إلى ميغاواط). نشكر لي تشاو وزان شو وسولانج خروبي هيس على الدعم الفني ، بالإضافة إلى رادو أريسيسكو وإيفون جونز (جامعة أكسفورد ، المملكة المتحدة) لتوفير بلازميد pHLsec ، وتوماس شوربف (كلية الطب بجامعة هارفارد) للمناقشات المفيدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
كاشف TRIzolInvitrogen15596-026مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلي
SuperScript II Reverse TranscriptaseInvitrogen18064-014
Phusion عالية الدقة DNA PolymeraseNEBM0530L
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362
EX-CELL 293 وسيط خال من المصل ل HEK 293 CellsSigma14571C
DMEM, نسبة عالية من الجلوكوز, مكمل GlutaMAX, البيروفاتGibco31966-021
أنابيب غسيل الكلى SnakeSkin, 10K MWCOThermo Scientific68100
Enterokinase من الأمعاء البقريةSigmaE4906المؤتلف, & ge; 20  وحدات / ملغ بروتين
HisTrap Excel 5 مل عمودGE Healthcare17-3712-06 النيكل IMAC
HiTrap SP HP 5 مل عمودGE Healthcare17-1152-01 العمود S
N- &α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT)SigmaC3647GzmA الركيزة
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)MP Biomedicals2193608 _10mgGzmB الركيزة
Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL)BachemGzmM الركيزة
5،5 & -dithio-bis (2-حمض النيتروبنزويك) (DTNB)كاشفسيجماD8130إلمان

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chowdhury, D., Lieberman, J. Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death. Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).
  2. Thiery, J., Lieberman, J. Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer. Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).
  3. Krensky, A. M., Clayberger, C. Biology and clinical relevance of granulysin. Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).
  4. Bovenschen, N., Kummer, J. A. Orphan granzymes find a home. Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).
  5. Lieberman, J. Granzyme A activates another way to die. Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).
  6. Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell death and differentiation. 19, 28-35 (2012).
  7. Hiebert, P. R., Granville, D. J. Granzyme B in injury, inflammation, and repair. Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).
  8. Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme. B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).
  9. Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157, 1309-1323 (2014).
  10. Lee, W. Y., et al. Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
  11. Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein. Antimicrob Agents Chemother. , (2014).
  12. Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).
  13. Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. Purification and use of granzyme B. Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).
  14. Masson, D., Tschopp, J. A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes. Cell. 49, 679-685 (1987).
  15. Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B. Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).
  16. Sun, J., et al. Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris. Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).
  17. Xia, Z., et al. Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system. Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).
  18. Stahnke, B., et al. Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes. Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).
  19. Gehrmann, M., et al. A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme. B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).
  20. Metkar, S. S., et al. Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation. Immunity. 16, 417-428 (2002).
  21. Motyka, B., et al. Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis. Cell. 103, 491-500 (2000).
  22. Pinkoski, M. J., et al. Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis. Blood. 92, 1044-1054 (1998).
  23. Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
  24. Fukuchi, K., et al. Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).
  25. Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity. Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).
  26. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  27. Barry, M., et al. Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid. Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).
  28. Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. Nature. 377, 446-448 (1995).
  29. Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).
  30. Domselaar, R., et al. Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71. J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).
  31. Thiery, J., et al. Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis. Blood. 115, 1582-1593 (2010).
  32. Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).
  33. Thomas, M. P., et al. Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins. J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).
  34. Jacquemin, G., et al. Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis. Cell death and differentiation. , (2014).
  35. Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C. The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).
  36. Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419(2014).
  37. Huang, M. T., Gorman, C. M. Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA. Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).
  38. Luthman, H., Magnusson, G. High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells. Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).
  39. Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity. Biochem J. 197, 239-244 (1981).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Granzyme ExpressionMammalian Cell TransfectionCalcium Phosphate MethodImmobilized Metal Affinity ChromatographyCation Exchange ChromatographyEnterokinase ActivationHEK293T CellsProtein PurificationEnzymatic Activity AssayGlycosylated Protease

Related Articles