مقالة منهجية

التصور المناعى من الحصين العصبية آخر بعد المكانية التعلم في نموذج الفأر من الاضطرابات العصبية النمائية

DOI:

10.3791/52919

⸱

مايو 12, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Integrative Biology (CIBIO), University of Trento, 2CNR Neuroscience Institute, Pisa, Italy

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفنا بروتوكول المناعية لدراسة الملف الشخصى تنشيط الخلايا العصبية قرن آمون بعد التعرض لمهمة التعلم المكاني في نموذج الفأر تتميز العجز المعرفي من أصل النمو العصبي. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول لكلا النموذجين الماوس وراثية أو الدوائية تتميز العجز المعرفي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحريض فسفرته كيناز الخلية التنظيم (بيرك) هو قراءات الجزيئية الموثوقة التي تعتمد على التعلم تنشيط الخلايا العصبية. هنا، نحن تصف بروتوكول المناعية رفع معنوياته لدراسة الملف الشخصى تنشيط الخلايا العصبية قرن آمون بعد التعرض لمهمة التعلم المكاني في نموذج الفأر تتميز العجز المعرفي من أصل النمو العصبي. على وجه التحديد، وكنا المناعية رفع معنوياته لدراسة تفعيل الخلايا العصبية التالية موريس المياه متاهة (MWM، وهي مهمة التعلم المعتمد على الحصين الكلاسيكية) في Engrailed-2 بالضربة القاضية (En2 - / -) الفئران، وهذا نموذج من اضطرابات طيف التوحد (ASD). بالمقارنة مع النوع البري (WT) الضوابط، En2 - / - أظهرت الفئران عجز التعلم المكاني كبيرة في MWM. بعد MWM، تم الكشف عن اختلافات كبيرة في عدد الخلايا العصبية رفع معنوياته إيجابية في الحقول الفرعية الحصين محددة من En2 - / - الفئران، بالمقارنة مع الحيوانات WT. وبالتالي، يمكن لدينا بروتوكول كشف بقوة الاختلافات فيالخلايا العصبية رفع معنوياته الإيجابية المرتبطة ضعف التعلم المعتمد على الحصين في نموذج الفأر من ASD. بشكل أعم، لدينا بروتوكول يمكن تطبيقها على التحقيق في الملف الشخصى تفعيل الخلايا العصبية قرن آمون في كلا النموذجين الماوس وراثية أو الدوائية تتميز العجز المعرفي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتشمل الاضطرابات العصبية النمائية مجموعة واسعة وغير متجانسة من الاضطرابات مثل متلازمة داون، متلازمة X الهش (FXS)، متلازمة ريت، الورم العصبي الليفي، التصلب درني وASD، والتي تشعر بالانزعاج تطوير ونضوج الجهاز العصبي المركزي (CNS) في وقت مبكر خلال فترة ما قبل الولادة 1. ويمكن لهذه الاختلالات التنموية الدماغ يسبب عميقة، تأثير مدى الحياة على وظيفة الحركة واللغة والتعلم وعملية الذاكرة. هناك عدد هائل من العوامل الوراثية والبيئية قد تورطت في التسبب في اضطرابات النمو العصبي خلال السنوات القليلة الماضية 2،3. حتى لو الآليات الجزيئية الكامنة وراء النمط الظاهري السريرية لا تزال مجهولة، فإن النتائج المذكورة أعلاه قد سمحت تطوير عدة نماذج الماوس من هذه الاضطرابات. وقد تم تحديد العجز في التعلم والذاكرة في عدد من هذه النماذج الماوس مثل TSC1 +/-، TSC2 +/-،NF1 +/- وEn2 - / - الفئران 2،4-7. تحديا هاما في مجال اضطرابات النمو العصبي هو تحديد العمليات الخلوية والجزيئية الكامنة والذاكرة والتعلم اختلال وظيفي. يمكن مسارات الإشارات اختيار تفعيلها خلال التعلم أو الذاكرة لحث على نسخ من جينات معينة وتؤدي في نهاية المطاف إلى دي نوفو تخليق البروتين. وبفعل الجينات المباشرة في وقت مبكر (IEGs) تفعيل والتي تعتمد على البروتين التعديلات متشابك بسرعة في الخلايا العصبية في الدماغ ردا على نشاط الخلايا العصبية والتدريب السلوكي 8،9.

وقد ارتبطت العجز في مسارات الإشارات التي تنطوي على neurofibromin مع ضعف في التعلم في الاضطرابات العصبية النمائية. Neurofibromin هو نتاج الجين NF1، الذي يسبب نوع الورم العصبي الليفي 1، متلازمة وراثية معقدة تتميز أورام الجهاز العصبي، والتأخير السلوكية والحركية، وديسا المعرفي الطفرةbilities 10. متخالف الفئران لNF1 حذف يقتصر على الخلايا العصبية المثبطة تظهر عجز في المرحلة المبكرة من التقوية على المدى الطويل (LTP)، وكذلك التعلم المكاني للخطر في MWM 5،11،12. ومن المثير للاهتمام، ونقص NF1 في هذا النموذج الماوس يؤدي إلى تفعيل أكثر من رأس الإشارات في interneurons المثبطة أثناء التعلم، مما أدى إلى زيادة الفسفرة ERK وأخيرا في تعزيز الشاذ الإفراج GABA من هذه الخلايا العصبية 5.

وبناء على هذه النتائج، والتصور من نشاط الخلايا العصبية بعد المهام السلوكية يمثل وسيلة لإعادة بناء الدوائر المحددة المعنية في الأمراض العصبية النمائية. بروتوكول المناعية الموصوفة هنا يهدف إلى تقييم وقياس مستويات ERK الفسفرة الحصين التالية MWM في نموذج الفأر ASD مع العجز المعرفي. ويستخدم على نطاق واسع MWM للتحقيق الحصين التعلم المكاني يعتمد والذاكرة في القوارض 13،14 . قررنا استخدام ERK الفسفرة كما قراءات الجزيئية التعلم قرن آمون التي تعتمد على المهمة، منذ ظهر ERK أن يكون لها دورا أساسيا في التعلم والذاكرة تشكيل 15. وعلاوة على ذلك، فإن مسار ERK ضروري لتعتمد على خبرة ليونة في القشرة البصرية تطوير 16. أخيرا، الفئران التي تفتقر إلى واحد من اثنين ERK وإيسفورمس (ERK2) في المعرض CNS ملحوظ الشذوذ في السلوك المعرفي والعاطفي والاجتماعي 17، مشيرا إلى أن ERK إشارات قد تلعب دورا حاسما في التسبب في اضطرابات النمو العصبي مثل ASD.

كنا Engrailed 2 بالضربة القاضية (En2 - / -) الفئران كنموذج للاضطرابات النمو العصبي. En2 - / - أظهرت الفئران الخصائص التشريحية والسلوكية "ASD تشبه"، بما في ذلك فقدان interneurons الدماغ الأمامي 18، خفضت التعبير عن الجينات المرتبطة ASD-19، وانخفضت مؤانسة، والمرونة الإدراكية ضعف 6،7،20. learni المكانينانوغرام وعيوب الذاكرة، مثل تلك الحالات المكتشفة في MWM، هي قوية خصوصا في En2 - / - الفئران 6،7 و قد تكون ذات صلة إدراكيا لوحظت في مرضى ASD 21. وعلاوة على ذلك، أظهرنا أن التعلم المكاني ضعف في MWM يرتبط مع انخفاض التعبير neurofibromin وزيادة مستويات رفع معنوياته في نقير En2 - / - الفئران البالغة 7. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لتوصيف المناعى لرفع معنوياته بعد MWM في هذا النموذج الماوس ASD.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأجريت جميع التجارب بما يتفق مع توجيهات الاتحاد الأوروبي 2010/63 / الاتحاد الأوروبي وتمت الموافقة من قبل وزارة الصحة الإيطالية.

1. رعاية الحيوان والإسكان والعلاج

  1. أداء جميع البروتوكولات التجريبية باستخدام الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية للرعاية الحيوان المؤسسية المعنية.
  2. الحفاظ على الحيوانات في 12 ساعة ضوء / دورة الظلام مع الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية المتاحة.
  3. بيت الفئران في مجموعات من 2-4، في أقفاص البولي الماوس من الحجم العادي مع نشارة الخشب والمواد الفراش أسبوعيا تغيرت.
  4. استخدام العمر والفئران يقابل الجنس، لأن التعرض للمرض يمكن أن تختلف مع تقدم العمر والجنس في نماذج الفئران مختلفة من الاضطرابات العصبية النمائية.
  5. اختيار عدد مناسب من الحيوانات للوصول إلى دلالة إحصائية (ما لا يقل عن 10 الفئران في التركيب الوراثي للدراسة السلوكية و4 الفئران في التركيب الوراثي للتجربة المناعية).

2. موريس المياه المتاهة (MWM)

  1. استخدام دبابات التعميم (قطرها 100 سم والطول 50 سم).
    1. وضع بعض الإشارات البصرية على غرفة المقسمات حول الخزان.
    2. وضع منصة قطرها 10 سم في خزان في موقع ثابت في قلب واحدة من أربعة أجزاء وهمية. الحفاظ على منصة مخفية في نفس الربع لجميع المحاكمات في جميع الدورات التدريبية.
    3. ملء حوض السباحة مع ماء الصنبور حتى النظام الأساسي هو 1 سم فوق سطح الماء. وينبغي أن يكون توازن درجة حرارة الماء وثيق إلى 22 ° C؛ هذه الخطوة قد تستغرق عدة ساعات. إضافة الماء الساخن لتقصير الوقت اللازم للتوازن درجة حرارة الماء.
    4. إضافة حوالي 1.5-2 لتر من الطلاء الأبيض، وغير سامة لجعل المياه مبهمة.
  2. المسار اكتساب الداخلي
    1. انشاء نظام تتبع MWM مع كاميرات CCD القياسية ومجالس الفيديو. اختيار نظام الفيديو تتبع لرصد وتحليل العديد من المتغيرات مثل طول الطريق، هيئة الأوراق الماليةالمؤسسة العامة الكمون، والوقت الذي يقضيه في كل رباعي.
    2. تقسيم الساحة في أربعة أجزاء وضبط إعدادات الكشف للتأكد من النقيض الأمثل بين الحيوانات والخلفية لتتبع الحية.
    3. تحديد منطقة المنصة.
    4. تعيين وقت المحاكمة الحد الأقصى إلى 60 ثانية.
  3. MWM اختبار
    1. قبل الاختبار السلوك، تسمح الفئران فترة التكيف من 20-25 دقيقة في منطقة حيث أنها لا تستطيع رؤية حمام السباحة أو العظة المكانية.
    2. تدريب كل فأر لمدة 9 أيام (تجربتان متتالية يوميا، مع 20-30 دقيقة فاصل بينهما).
    3. التبديل على جهاز الكمبيوتر والكاميرا والبدء في برنامج نظام تتبع الفيديو.
    4. خذ الماوس بواسطة ذيله ووضعه في الماء، مع رئيس وأشار تجاه جانب حمام السباحة، بدءا من واحدة من المواقف بداية الأربعة (الشمال والجنوب والشرق والغرب). لكل الماوس، وينبغي أن يكون موضع بداية مختلفة وpseudorandomized عبر التجارب.
    5. السماح للسباحة الماوس والبحث عن platfاسندت لمدة أقصاها 60 ثانية. عندما يصل الحيوان المنصة، يسمح لها بالبقاء على منصة لمدة 20 ثانية.
    6. إذا فشل الماوس لتحديد موقع منصة في ذلك الوقت، وتوجيه بلطف الماوس إلى منصة، وعقد من قبل ذيله والسماح لها بالبقاء هناك لمدة 20 ثانية. وبمجرد الانتهاء من الحيوانات كل التجربتين، يجف تشغيله مع منشفة وضعه مرة أخرى في قفص.
    7. كل يوم من فترة التدريب، كرر نفس الإجراء (الخطوات 2.3.4-2.3.6).
    8. إجراء اختبار التحقيق في يوم 9 بعد درب التدريب الأخير.
    9. إزالة منصة من التجمع.
    10. السماح للسباحة الماوس وابحث عن منصة لمدة أقصاها 60 ثانية.
    11. دوري، والتحقق من درجة حرارة الماء بحيث يجب أن يكون نفس (22 ° C) وتنظيف حوض السباحة.

3. إعداد أقسام من perfused لحيوانات

  1. التضحية الفئران في نهاية MWM. أربعة الفئران في التركيب الوراثي يجب تخدير قبل euthanizأوجه فقا للمبادئ التوجيهية المحلية والدولية.
  2. يروي الحيوان transcardially (قص الحق auriclewith مقص للسماح النزيف وإدخال قنية فراشة في البطين الأيسر ليروي) مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 4-5 دقيقة، تليها 4٪ لامتصاص العرق في برنامج تلفزيوني لمدة 10-15 دقيقة 22.
  3. تشريح وبعد إصلاح العقول في 4٪ امتصاص العرق في 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 12 ساعة.
  4. وضع العقول في 50 مل أنابيب البوليسترين المخروطية التي تحتوي على 15 مل من 0.02٪ أزيد الصوديوم في 0.1 M PBS وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة للتشريح.
  5. قطع وإزالة المخيخ قبل vibratome القطع.
  6. الغراء الدماغ تستقيم مع موقع القطع، superglue به، على لوحة صاحب vibratome.
  7. قطع الدماغ إلى 20-40 ميكرومتر أقسام الاكليلية سميكة، من أجل المسلسل على مدار الحصين الظهرية، على vibratome المناسب.
  8. جمع vibratome شرائح مع فرشاة الدهان ونقل إلى 24 لوحة متعددة أيضا تحتوي على 1 مل من 0.1 M PBS لكل بئر.
  9. متجر أقسام قصيرة المدى في برنامج تلفزيوني أو على المدى الطويل في 0.02٪ أزيد الصوديوم في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية (الأنسجة يمكن أن تستخدم لمدة تصل إلى واحد).

4. المناعية

  1. نقل 3-5 أقسام الحصين الظهرية لكل الماوس، في 24 لوحة متعددة جيدا تحتوي على 500 ميكرولتر من 0.1 M PBS لكل بئر.
  2. غسل المقاطع الواردة في كل بئر مع 500 ميكرولتر من 0.1 M PBS (5 دقائق، 3 مرات مع لطيف الهز).
  3. إخماد النشاط البيروكسيداز الذاتية، التي يحتضنها قسم 1٪ H 2 O 2 في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة مع الإثارة لطيف.
  4. غسل المقاطع في 0.1 M PBS مع الإثارة لطيف (3 × 5 دقائق).
  5. Permeabilization من الأنسجة: احتضان المقاطع لمدة 5 دقائق في 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني.
  6. خلال الخطوات المذكورة أعلاه (4.4، 4.5)، وجعل ما يكفي من عازلة تمنع (10٪ الماعز المصل و 0.1٪ تريتون-X100 في PBS) للتجربة برمتها (لكم رقمص أقسام × 100 ميكرولتر × 3 خطوات).
  7. ملاحظة: استخدام مصل من نفس النوع الذي صدر في آب الثانوي (مترافق لالبيوتين).
  8. منع غير محددة وملزمة من الأجسام المضادة، التي يحتضنها المقاطع في عرقلة العازلة (100 ميكرولتر / قسم) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع الإثارة لطيف.
  9. احتضان المقاطع في أب الأساسي (بيرك) المخفف في عرقلة العازلة، بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، مع الإثارة لطيف.
  10. غسل المقاطع في 0.1 M PBS مع الإثارة لطيف (3 × 5 دقائق).
  11. احتضان مع أب الثانوي مترافق مع البيوتين (1: 250) المخفف في عرقلة العازلة (نفس المستخدمة في الخطوة 4.6) لمدة 1 ساعة على RT مع الإثارة لطيف.
  12. إعداد ABC الكاشف في نفس الوقت، لأن أفيدين والبيوتين تتطلب على الأقل 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة إلى المجمع.
  13. إعداد حجم المطلوب من كاشف ABC وفقا لبروتوكول الصانعين.
  14. غسل المقاطع في 0.1 M PBS مع الإثارة لطيف (3 × 5 دقائق).
  15. Incubatأقسام ه لمدة 45 دقيقة في RT مع ABC الكاشف.
  16. غسل المقاطع في 0.1 M PBS مع الإثارة لطيف (3 × 5 دقائق).
  17. إعداد DAB حل العمل، ويجب أن يتم في كل خطوة تنطوي على DAB في غطاء الدخان كما DAB هو مادة مسرطنة وماسخة.
  18. نقل حل DAB إلى لوحة جديدة عن طريق التحويل من البلاستيك ماصة.
  19. أقسام مكان في لوحة تحتوي DAB حل وصفيحة دوامة ببطء العمل من جهة، للسماح الحد الأقصى للتعرض إلى أقسام.
  20. رصد رد فعل DAB على المجهر حتى تتطور إشارة كافية (2-5 دقيقة).
  21. وقف رد فعل على كثافة اللون المطلوب عن طريق غسل الأنسجة في 0.1 M PBS (3 × 5 دقائق).
  22. استخدام التبييض لتعطيل أي حل ما تبقى الركيزة DAB في غطاء الدخان ليلة وضحاها والتصرف فيها وفقا للمبادئ التوجيهية المختبر.
  23. أقسام جبل على الجيلاتين المغلفة الشرائح التي تطفو في برنامج تلفزيوني. ثم تجفيفها في درجة حرارة الغرفة على الأقل 3-4 ساعة.
  24. يذوى بالتسلسل المقاطع في 50٪، 70٪، 95٪والإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة لكل منهما، واضحة في 100٪ الزيلين لمدة 5 دقائق.
  25. ساترة باستخدام تصاعد المتوسطة وترك في غطاء الدخان لتجف بين عشية وضحاها.

عدد 5. خلية

  1. عدد الخلايا رفع معنوياته إيجابية، وينبغي تحليل 4:57 أقسام على مستوى الحصين الظهرية للحيوان.
  2. الحصول على صور متعددة مشرق الميدان من كل قسم في 200X التكبير باستخدام مجهر المناسب، ومن ثم تجميعها باستخدام برامج معالجة الصور.
  3. أداء عدد الخلايا في صور فسيفساء-تحويل شجار باستخدام البرمجيات الحرة يماغيج.
  4. عدد الخلايا رفع معنوياته الملون في طبقة الخلايا الحبيبية نقير وعلى مدى سنتين إلى ثلاث خانات عد من 100 × 100 ميكرون لكل منهما.
  5. ويتم التعبير عن الكثافة الخليوي وعدد من الخلايا المسمى في نافذة الفرز (100 × 100 ميكرون).
  6. إجراء تحليل إحصائي لتقييم فرق كبير بين الأنماط الجينية. ويمكن تحقيق ذلك مع تي الطالباختبار أو ANOVA تليها الاختبار اللاحق المناسب باستخدام البرمجيات التجارية. تعيين مستوى دلالة إحصائية عند P <0.05.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تصميم بروتوكول صفها هنا للتصور، من خلال المناعية، والتعبير عن علامة معينة من نشاط الخلايا العصبية الحصين بعد MWM في نموذج الفأر من الاضطرابات العصبية النمائية. وقد تم نقل كل البيانات التجريبية المبينة في هذا القانون من عملنا مؤخرا 7. استخدمت الحصول عليها من التزاوج متخالف، تتزاحم المطابقة سن البلوغ (الوزن = 25-35 ز 3-5 أشهر من العمر) - الذكور والإناث WT وEn2 - /. استخدمت اثنين وعشرين الفئران (11 في التركيب الوراثي) لMWM. تم التضحية ثمانية ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، ونحن نقدم بروتوكول المناعية رفع معنوياته للكشف عن تنشيط الخلايا العصبية التالية MWM في En2 - / - الفئران، نموذج الفأر من الاضطرابات العصبية النمائية. تم الكشف عن انخفاض مستويات رفع معنوياته في الحقل الفرعي CA3 من En2 - / - المسوخ مقارنة WT. بشكل مختلف عن ما لوحظ في الحقل الفرعي CA3، زيادة عامة من الخلايا العصبية رفع معنوياته إيجابية بدلا من ذلك تم الكشف في كل نقير وGCL من En2 - / - الفئران مقارنة WT. وثمة تفسير محتمل لهذا الاتجاه المعاكس في مس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر الموظفين الإداريين من CIBIO (جامعة ترينتو) ومعهد علم الأعصاب CNR للحصول على المساعدة. ويدعم جيوفاني بروفنزانو التي كتبها زمالة ما بعد الدكتوراه من FONDAZIONE فيرونيسى (ميلان الايطالي). وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الوزارة الإيطالية للجامعة والبحث (PRIN 2008 منحة # 200894SYW2_002 وPRIN 2010-2011 منحة # 2010N8PBAA_002 إلى YB)، جامعة ترينتو (CIBIO بدء منحة لYB) ومؤسسة تيليثون (منحة # GGP13034 ل YB).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
EthoVision XT 8Noldus Information Technologyهذه المنصة البرمجية ليست شرطا &ndash ؛ هناك العديد من البرامج السلوكية الأخرى في السوق.
Tempera PaintGiotto - شركةأبيض وسائل وغير سامة. تستخدم لتحضير المياه غير الشفافة في متاهة موريس المائية.
VibratomeLeicaVT1200المكافئة من شركات أخرى.
24 لوحة بئرسيجماCLS3524
100٪ إيثانولفيشر ScientificA406-20تستخدم لصنع تدرج الإيثانول للجفاف قبل تركيب الشريحة.
XyleneVWR66004-950سام - يستخدم تحت غطاء المحرك. قم بتغيير الزيلين كل شهر حسب الاستخدام.
أزيد الصوديومسيجما  S2002
PBSSigmaP3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100Sigma T-8787
بيروكسيد الهيدروجينسيجماH1009-100ML
مصل الماعز العاديAbcamG9023-10ML
ABC kit Vectastain   ؛مختبرات ناقلاتPK-6100أضف حجم 5 مل من PBS 2 قطرات من الكاشف A ، واخلط ثم أضف قطرتين من الكاشف B واخلطها.
DAB بيروكسيداز الركيزةVector LaboratoriesSK-4100أضف حجم 5 مل ddH2< / sub>O: قطرتان من محلول المخزون العازلة واخلطه ؛ 4 قطرات من DAB وتخلط ؛ 2 قطرات من H2< / sub>O2< / sub> واخلطها.
[header]
pERKتقنيات إشارات الخلايا   ؛4370التخفيف 1: 500
مختبرات ناقلات الأجسام المضادة IgG المضادة للأرانب البيوتينيلBA-1000   ؛التخفيف 1:250
شرائح SuperFrost كارل روث1879
CoverslipsFisher12-548-B
DPXSigma317616وسط تركيب للشرائح. يمكن استخدام وسط التركيب المكافئ.
المجهر  Zeiss Axio Imager.M2المكافئ.
أدوبي فوتوشوبأدوبي سيستمز ، سان خوسيه ، كاليفورنيالتجميع الصور.
برنامج ImageJNational Institute of HealthFree Software على http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0Systat Software Inc. (الولايات المتحدة الأمريكية)استخدام البرامج المكافئة للتحليل الإحصائي.
Prism 6GraphPad Software، Inc. (لا جولا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)يمكن استخدام البرامج المكافئة للتحليل الإحصائي.
Fila Group يمكن استخدام نماذج يمكن استخدام مجهر يمكن تنزيل Software يمكن

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).
  2. Ehninger, D., et al. Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis. Nature medicine. 14, 843-848 (2008).
  3. West, A. E., Greenberg, M. E. Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
  4. Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures. Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).
  5. Cui, Y., et al. Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning. Cell. 135, 549-560 (2008).
  6. Brielmaier, J., et al. Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice. PloS one. 7, e40914(2012).
  7. Provenzano, G., et al. Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).
  8. Morgan, J. I., Curran, T. Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes. Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).
  9. Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).
  10. Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).
  11. Costa, R. M., et al. Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1. Nature. 415, 526-530 (2002).
  12. Silva, A. J., et al. A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type. I. Nature. 15, 281-284 (1997).
  13. Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
  14. Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nature. 2, 266-270 (1999).
  15. Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).
  16. Di Cristo, G., et al. Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity. Science. 292, 2337-2340 (2001).
  17. Satoh, Y., et al. ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).
  18. Sgado, P., et al. Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders. Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).
  19. Sgado, P., et al. Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders. Molecular autism. 4, 51(2013).
  20. Cheh, M. A., et al. En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder. Brain research. 1116, 166-176 (2006).
  21. Dawson, G., et al. Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives. Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).
  22. Gage, G. J., et al. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  23. Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance. Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4(2009).
  24. Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

pERK Engrailed 2

مقالات ذات صلة