TRAP-الصليب الأحمر، وترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية من بالسكان خلية نادر ذبابة الفاكهة الأجنة

فهم كيفية الخلايا تكتسب خصائص محددة خلال التنمية أمر بالغ الأهمية من أجل إدراك تعقيد الأجهزة وتطورها المحتمل تجاه الحالات المرضية. هناك دفعة كبيرة لبحث فك شبكات الجينات التنظيمية تشكل أساس مواصفات الخلايا والتمايز التي كتبها unrevealing ملامح التعبير الجيني العالمية، ووضع ملزمة بول الثاني، شغل النسخ عامل في تسلسل التنظيمية أو التعديلات بعد متعدية من الهستونات.

لتقييم التعبير الجيني في ميكروأرس على الصعيد العالمي وتستخدم نهج RNA وما يليها. ميكروأرس تسمح للكشف عن وفرة مرنا، في حين RNA وما يليها هو أفضل موجهة لإعلام على أنواع مختلفة من الرنا بما في ذلك الترميز وغير المرمزة noncoding الموجودة الرنا مثل microRNAs، lncRNAs أو snRNAs. ومع ذلك، يمكن لهذه التقنيات لا تفرق نسخه بنشاط، حالة استقرار مرنا، بنشاط-ترجمة مرنا، ومرنا دخول عملية التحلل. قياس ثابت-شارع تناولوا مستويات مرنا أنه من المعروف أن تقدير ضعف تكوين بروتيوم ^1-3. في العكس من ذلك، تحديد بنشاط-ترجمة مرنا يعطي صورة أكثر دقة لإنتاج البروتين.

ومع ذلك، فقد تم أساسا أدت الدراسات transcriptomic على مستوى كامل الحي من خلال مقارنة بالربح أو الخسارة من وظيفة عامل محدد لمن النوع البري شرط ^4-7 أو على تشريح الأنسجة، مما يجعل ملامح التعبير الجيني يصعب تفسيرها. التطورات الحديثة في أدوات استهداف الخلايا، وتنقية تقارب وتحسن حساسية تسمح الآن لإجراء تحليلات واسعة الجينوم على السكان خلية أو خلايا صغيرة حتى واحدة في الكائن الحي.

في ذبابة الفاكهة، مجموعات كبيرة من خطوط المعدلة وراثيا تمكن محددة تستهدف الزمني والمكاني من الأنسجة المختلفة والفئات السكانية الخلية عن طريق نظام GAL4 / UAS ^10/08 العائد الكمي أكثر دقة من الآليات الجزيئية المطلوبة لوظيفة الخلية.

الحمار = "jove_content"> ومن بين المناهج المطورة حديثا polysome وقد وصفت التنميط التي كتبها تجزئة كوسيلة لالتقاط بنشاط-ترجمة RNA ^11. هذا الأسلوب يعتمد على السكروز التدرج الطرد المركزي يسمح اختيار جزء polysome وتحديد مرنا ترجمت على نطاق الجينوم عند تحليلها مع ميكروأرس أو التسلسل عميق. ويمكن أن يقترن Polysome العزلة مع نوكلياز الهضم لتحديد آثار أقدام الريباسي المقابلة لشظايا الحمض النووي الريبي التي يحميها ريبوسوم خلال عملية الترجمة ^12. البصمة الريباسي يزيد من دقة التحديد الكمي للترجمة RNA وقرار RNA على مستوى تسلسل وتحديد المواقع الريبوسوم، يجعل من الممكن لقياس معدل الترجمة. إلا أنه حتى اليوم لم يتم تطبيقه على عزل خلية محددة من translatomes، ويرجع ذلك أساسا إلى انخفاض قوي في الغلة RNA التي تم الحصول عليها في نهاية عملية البصمة الريبوسوم. وبالنظر إلى أن اختيار حجم RNA قد تولد المحتملين كاذبة صositives من RNPs المختلفة التي يمكن أيضا حماية RNA بطريقة مماثلة، وهناك حاجة إلى مزيد من التطورات لتحسين الريباسي البصمة وتكييفها مع النهج خلية محددة.

واحد من هذه الأساليب، ودعا وصفت في ترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية (TRAP) في عام 2008 من قبل هيمان وآخرون. وتطبق على عزل translatome من مجموعة فرعية من الخلايا العصبية في الفئران. قبل حاتمة العنونة بروتين الريباسي بطريقة الخلية من نوع معين، polysomes يمكن تنقيته بشكل انتقائي دون خطوة شاقة من التفكك الخلية والفرز. في هذه الحالة، 60S البروتين الريباسي L10a على سطح الريبوسوم كانت المعلمة مع EGFP ^13. منذ عام 2008، وقد استخدمت العديد من الدراسات هذه الطريقة في أنواع مختلفة من الفئران ^14-19 إلى العاشرة المورق ^{20،21، 22،23} الزرد ونبات الأرابيدوبسيس thaliana ^24. كما تم تكييف طريقة TRAP للنموذج ذبابة الفاكهة وتستخدم لبوريمن mRNAs من الخلايا العصبية ^{25 و 26} النجمية السنة المالية المحددة من نوع الخلية. تم استخدام ثنائي نظام GAL4 / UAS متعددة للتعبير عن RpL10A GFP الموسومة بطريقة الأنسجة محددة. تم تشريح رؤساء الذباب الكبار لأداء اختيار polysome من الخلايا العصبية (التي تستهدفها عموم العصبي سائق Elav-GAL4) والرنا المعزولة والتسلسل. يتفق عدد كبير من الجينات تنظم يصل إلى أن يعرف أن يتم التعبير عنها في الجهاز العصبي، مشيرا إلى أن النهج خصوصية جيدة ودفع لنا لتكييفه مع السكان الخلية نادرة (أقل من 1٪ من الخلايا) الحاضر في وضع الأجنة ذبابة الفاكهة .

ضمن نموذج ذبابة الفاكهة، والمرحلة الجنينية هي نموذج للاختيار لدراسة العمليات التنموية، والجهات الفاعلة الجزيئية والحركات التخلق يتم حفظها التطورية. وقد تم تنفيذ النهج transcriptomic الوحيدة الأنسجة محددة التي أجريت حتى الآن في هذا النموذج باستخدام خلايا أو حتى النوويةrting وكانت فقط قادرة على دراسة Transcriptome على الحالة المستقرة ^27-31، وخلق الحاجة إلى طرق مخصصة لالأنسجة / خلية محددة translatome التنميط في الجنين الطاير. نحن هنا تقرير أول بروتوكول TRAP مخصصة لأجنة ذبابة الفاكهة. مع هذا الأسلوب، وتشارك في الترجمة مرنا في السكان الخلية محدودة جدا من حوالي 100 خلايا العضلات في جنين تم عزل بنجاح مع جودة عالية وخصوصية. يتم استخدام GAL4 / نظام UAS ثنائي لدفع التعبير عن RpL10A الموسومة GFP في حيوانية من العضلات دون أي سمية، لا الظواهر الواضحة أو تأخر في النمو كما هو موضح سابقا ^25. أجنة ذبابة الفاكهة تمتلك 30 العضلات في hemisegment التي من شأنها أن تؤدي إلى الجهاز العضلي من اليرقة. باستخدام المنطقة التنظيمية التي اكتشفت في المنطقة المجاورة للهوية الجينات ترهل، 6 من 30 العضلات متعددة الأنوية هي المستهدفة. في هذا الاختبار، وثبتوا ريبوسوم على مرنا باستخدام استطالة الترجمةالمانع سيكلوهيكسيميد. ثم يتم استخدام مقتطفات عصاري خلوي لتنقية تقارب مع حبات مغناطيسية المغلفة الأجسام المضادة GFP. تم التحقق نوعية RNA تنقيته باستخدام bioanalyzer. وقد استخدم الكمي عكس النسخ PCR (RT-QPCR) لتحديد خصوصية وحساسية مرنا العزلة وأثبتت أن لدينا بروتوكول الأمثل هو كفاءة عالية.

1. يطير الجيل الخط

1. توليد اثنين من بنيات مختلفة. في بناء أول، RpL10A كدنا] (الريباسي البروتين الوحيدات L10a) يتم استنساخ المصب من GFP إلى pUASP-PL-GFP-Nter البلازميد (نسخة معدلة من ^32). استخدام المروج سلالة الجرثومية يسمح استخدام أكثر متعدد التكافؤ من خط المعدلة وراثيا.
   ملاحظة: الحصول على بناء الثاني عن طريق الاستنساخ التسلسل التنظيمي القيادة التعبير الأنسجة محددة من الجين ترهل المنبع من GAL4 (TF) باستخدام pPTGAL4 البلازميد.
2. حقن البلازميدات على حدة إلى ¹¹¹⁸ ث الذباب وإدراج يبني في الجينوم الذبابة التي كتبها P-عنصر الإدراج (وفقا للإجراءات القياسية) ^33.
3. اختر transformants من أجل استعادة خطوط الطيران مع يبني على اثنين من الكروموزومات مختلفة. يتم إنشاء خط TRAP النهائي من خلال الجمع بين هذين الخطين (الصلبان الوراثية) من أجل الحصول على خط واحد ثابت المزدوج المعدلة وراثيا. F0: W-. CYO، UAS EGFP :: RpL10A. MKRS / TM6Bس W-؛ CYO / المجلس الأعلى للجامعات، التهدل GAL4 / TM6B. F1: W-. CYO، UAS EGFP :: RpL10A. ترهل GAL4 / TM6B. كبير تضخيم هذا الخط، وجمع الأجنة نظموا المطلوب.

2. جمع الأجنة

1. إعداد 8 أقفاص السكان اسطوانية كبيرة تحتوي على حوالي 40 غراما من الذباب الشباب في قفص (حوالي 180،000 الذباب / القفص).
2. المضي قدما في ما يسمى ما قبل الأناشيد التي تسمح الذباب لمسح الأجنة النامية من ناقلة البيضات بهم. لذلك، ووضع الذباب لمدة 1 ساعة على طبقين 11 سم القطر بتري تحتوي على خليط من طدت أجار وعصير العنب وتغطية ⅓ من السطح مع طازجة من صنع عجينة الخميرة. بعد 3 تبادل العنب لوحات عصير جمع الأجنة حقيقية على مماثلة لوحات مصنوعة حديثا.
   وتختلف فترة حضانة وفقا لالتنموي الوقت النافذة درس: ملاحظة.
3. إزالة لوحات من أقفاص وتركهم في نفس درجة الحرارة للمدة الزمنية اللازمة للحصول على مرحلة تنموية الصحيحة (على سبيل المثال، 3 ساعة من وضع البيض + 10 ساعة من الخا IONAL حضانة يعطي الأجنة من مرحلة 10-13 ساعة بعد وضع البيض (AEL)). Resuspend والمحتوى لوحة (الأجنة، معجون الخميرة، الذباب الميت) مع 50 مل من الماء باستخدام الفرشاة.
4. تذهب من خلال سلسلة من المناخل (700 ميكرون، 355 ميكرون، 112 ميكرون) لفصل الأجنة من الذباب الميت وتبقى أجزاء الجسم وجمع الأجنة المتبقية على منخل قطرها أصغر، ثم تغسل لفترة وجيزة في الماء منزوع الأيونات. لا تستخدم أكثر من 18 لوحات في جمع لأنها يمكن أن تسد المناخل.
5. الأجنة Dechorionate في 4.5٪ التبييض في الماء منزوع الأيونات لمدة 2 دقيقة ويشطف جيدا بالماء منزوع الأيونات لمدة 30-60 ثانية. احتضان الأجنة في برنامج تلفزيوني 0.01٪ توين 20، 100 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد، لمدة 5-10 دقيقة في RT في إطار التحريض.
6. الأجنة الجافة على السليلوز ورقة ماصة ونقلها إلى أنابيب microcentrifuge. وزن الأنابيب وفلاش تجميد الأجنة عن طريق الغمر في النيتروجين السائل. في هذه المرحلة، والأجنة المجففة ويمكن تخزينها لعدة أشهر في -80 ° C.

الطبقة = "jove_title"> 3. إعداد الخرز المغناطيسي إلى جانب لGFP الضد

1. و resuspend بدقة بروتين G حبات مغناطيسية في زجاجة الأصلية عن طريق الإثارة لطيف.
2. نقل 90 ميكرولتر من الخرز لأنبوب ريبونوكلياز خالية وجمعها على المغناطيس (30-60 ثانية). 90 ميكرولتر من الخرز ضروري لأداء مناعي (IP) مع 1 مل من المحللة التي تحتوي على 60-80 ملغ / مل البروتينات. احترام نسب لمنع حبة التشبع. استخدام العديد من الأنابيب وفقا لكمية البروتين.
3. تغسل حبات مع 1 × PBS 0.01٪ توين 20 (500 ميكرولتر) وجمع حبات على مغناطيس لتجاهل طاف. إضافة 30 ميكروغرام من GFP الأضداد في 350 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 0.01٪ توين 20 إلى الخرز واحتضان مع نهاية بطيئة على نهاية خلط لمدة 30 دقيقة في RT.
4. جمع حبات على مغناطيس (30-60 ثانية)، ونبذ طاف وشطف في 500 ميكرولتر من استخراج العازلة polysome (HEPES 10 مم، 150 مم بوكل، MgCl ₂ 5 ملم، DTT 0.5 ملم، تريتون 1٪، سيكلوهيكسيميد 100 ميكروغرام / مل ، العلاقات العامةotease المانع 1 ×، ريبونوكلياز المانع 100 U).
5. جمع حبات على مغناطيس وإضافة 500 ميكرولتر من عرقلة العازلة (BSA 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر، الحمض الريبي النووي النقال الخميرة 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر، جليكوجين 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر في polysome استخراج العازلة).
6. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT وكرر هذه الخطوة مرة واحدة مع عازلة تمنع الطازجة.
7. جمع حبات على مغناطيس وشطف في 500 ميكرولتر من استخراج العازلة polysome، ثم يتذكر الخرز والشروع فورا في خطوة immunopurification (المادة 6).

4. المحللة التحضير

1. قبل البدء، وإعداد البرنامج على حبات السرعة متعددة الاتجاهات طاحونة: 2 × 10 ثانية في 5000 دورة في الدقيقة، 15 ثانية وقفة. نقل الأجنة المجففة (1.5 غرام) إلى 15 مل أنابيب prechilled على الجليد التي تحتوي على استخراج العازلة polysome، والتجانس على الفور. التجانس 1.5 غرام من الأجنة في 4 مل من استخراج العازلة polysome.
2. انتشار المتجانس الأجنة في اثنين prechilled 2 مل أنابيب وطحن امبرينظام التشغيل عن طريق تشغيل برنامج الخالط. نقل المحللة إلى أنابيب microcentrifuge prechilled جديدة على الجليد وإعداد طاف خلف النواة بواسطة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 2000 غرام.
3. نقل طاف لأنبوب microcentrifuge prechilled جديدة على الجليد، إضافة 1/100 حجم العينة من 10٪ Nonidet P-40 لطاف (تركيز النهائي = 0.1٪)، وتخلط برفق بواسطة قلب الأنبوب.
4. نبض الطرد المركزي العينة في minifuge لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب، إضافة 09/01 حجم عينة من 300 ملي 1،2-Diheptanoyl-SN-Glycero-3-Phosphocholine (DHPC) (تركيز النهائي = 30 ملم )، ومزجها بلطف بواسطة قلب الأنبوب، واحتضان الخليط على الجليد لمدة 5 دقائق (مزيج من قبل قلب عدة مرات خلال الحضانة).
5. إعداد طاف بعد الميتوكوندريا بواسطة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 20000 ز. قياس تركيز البروتين بواسطة الأسلوب برادفورد: يجب أن يكون التركيز في المحللة بين 60-80 ملغ / مل. تيأك طاف لجديد أنبوب microcentrifuge prechilled جديدة والشروع فورا في الخطوة ما قبل امتصاص (القسم 5).

5. قبل امتصاص

1. تماما resuspend والخرز المغناطيسي من قبل الإثارة لطيف ونقل 30 ميكرولتر من الخرز في أنبوب microcentrifuge في RT (30 ميكرولتر من الخرز / 1 مل المحللة الجنينية).
2. جمع حبات على مغناطيس، ماصة قبالة طاف، و resuspend حبات في استخراج العازلة polysome (500 ميكرولتر). جمع حبات على مغناطيس، إضافة المحللة الجنينية، واحتضان لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية على محور دوار.
   1. إزالة الخرز والحفاظ على طاف على الجليد للخطوة immunopurification. قبل immunopurification، والحفاظ على 100 ميكرولتر من طاف (المدخلات) لمقارنة عينة الحمض النووي الريبي العالمية مع عينة الحمض النووي الريبي التي تم جمعها بعد immunopurification، من خلال RT-QPCR على سبيل المثال.

6. Immunopurification

1. إضافة 1 مل (الموافق 60-80 ملغ / مل بروتين) ل-استيعابها قبل المحللة إلى أنبوب خالية من ريبونوكلياز تحتوي على 90 ميكرولتر من الخرز منعت بالإضافة إلى GFP الأضداد. احتضان العينات عند 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع طيف خلط نهاية الإفراط في نهاية في محور دوار أنبوب. بدلا من ذلك، نفذ حضانة O / N عند 4 درجات مئوية.
2. بعد مرور فترة الحضانة، وجمع حبات على مغناطيس. استخدام minifuge لتدور باستمرار الخرز، resuspend ثم لهم في 500 ميكرولتر من غسل العازلة (HEPES 10MM، بوكل 350MM، MgCl ₂ 5MM، Nonidet P-40 1٪، DTT 0.5 ملم، سيكلوهيكسيميد 100 ميكروغرام / مل، ريبونوكلياز المانع 100 U ) وجمعها على المغناطيس. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
3. تغيير حبات لprechilled أنبوب ريبونوكلياز خالية الجديد ويغسل مرتين. جمع حبات على مغناطيس، والشروع في استخراج الحمض النووي الريبي بإضافة 1 مل TRiZol مباشرة إلى الخرز واتبع تعليمات الشركة الصانعة.

7. RNA التنظيف وتقييم الجودة

1. استخدام عدة RNeasy مايكرو حسب تعليمات الشركة الصانعة. في الإنجاز، elutالبريد RNA مع (س) ميكرولتر ريبونوكلياز خالية من المياه. دافئ لمدة 2 دقيقة عند 60 درجة مئوية، وتخزين العينات المجمدة الإضافية في -80 ° C. تحقق RNA الجودة باستخدام bioanalyzer (اتبع تعليمات الشركة الصانعة).
2. لاختبار خصوصية TRAPed RNA، نفذ النسخ العكسي في 3 نانوغرام من الحمض النووي الريبي المنقى (المدخلات وIP) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (مرتفع III). استخدام كدنا] التي تم الحصول عليها عن QPCR باستخدام مجموعات التمهيدي الجينات المحددة.

ويتكون نظام العضلات الجسدية الجنينية ذبابة الفاكهة من 30 العضلات في hemisegment، وكل العضلات لديها مجموعة محددة من خصائص: كود الجينات الهوية، والموقف، وعدد من الفعاليات الانصهار، ومواقع الحجز وتعصيب. وتحديد ترجم مرنا في مجموعة فرعية محددة من العضلات إعطاء معلومات عن البروتينات اللازمة لتشكيل هذه الخصائص محددة من العضلات. باستخدام طريقة القائم على TRAP، RNA من جزء من السكان من عضلات التعبير عن ترهل الجينات الهوية وتنقيته (الشكل 1A-B). ومصدر القلق الرئيسي لهذا النهج هو نوعية وخصوصية الحمض النووي الريبي معزولة. بروتوكول الأمثل ذكرت هنا مكن انتعاش منهجية عالية الجودة RNA المقررة مع التحليل bioanalyzer. وتظهر الصورة التي تم الحصول عليها أي تدهور الحمض النووي الريبي (الشكل 1C).

في الدراسات التي وضعت حول طريقة TRAP، أثيرت تساؤلات بشأن خصوصية البيانات. هنا نحن طmprove طريقة لقمع الخلفية المرتبطة ملزم من الحمض النووي الريبي لحبات أو أنابيب غير محددة والاستفادة المثلى من غسل العازلة. من أجل تقييم مستوى الخلفية وكفاءة عزل الخلايا، معربا عن ترهل، ونحن أدت التجارب RT-QPCR على 3 مكررات من نفس المرحلة الجنينية. أضعاف التخصيب من 4 جينات مختلفة (mef2، ترهل، بروسبيرو، soxNeuro) حسبت مقارنة المدخلات وتطبيع ضد الجين RpL32 (1D الشكل). وأظهرت هذه النتائج تخصيب 2.3 أضعاف من mef2 الجينات عموم العضلات وتخصيب 5.6 أضعاف من الجين ترهل. في المقابل، الجينين أعرب في النظام العصبي وقد المنضب مقارنة المدخلات. لوحظ تغيير القيم أضعاف مشابهة جدا على 3 مكررات البيولوجية، مما يدل على أن البروتوكول هو القوي. مع سائق التهدل-GAL4 وبدءا من 1.5 غرام، حول 1.5x10 ^ 6 أجنة تم الحصول عليها التي تحتوي على 100 خلية GFP / جنين (ما مجموعه 150 × 10 ^ 6 إيجابيةالخلايا).

بعد تشغيل التجربة TRAP، العائد حوالي 25-45 نانوغرام من الحمض النووي الريبي محدد اعتمادا على مرحلة من الفائدة. هذه المواد هي كافية لتشغيل تحليل ميكروأري أو RNA وما يليها باستخدام بروتوكول التضخيم لبناء مكتبة RNA وما يليها. سوف الكفاءة تعتمد بشدة على قوة السائق تستخدم للتعبير عن RpL10A-EGFP.

الشكل 1. الجودة وتقييم نوعية من الحمض النووي الريبي معزولة TRAP من التهدل-GAL4> الأجنة UASRpL10A-EGFP.

(AB) صور متحد البؤر لمرحلة 16 الجنين تظهر RpL10A-EGFP التعبير على وجه التحديد في ست خلايا العضلات التهدل في hemisegment (A). لوحظ شارك في توطين RpL10A-EGFP مع الجنرال علامة العضلات Beta3tubulin على الصورة دمج (B). (C) مراقبة الجودة من TRAPed RNA ران على bioanalyzer تبين سلامة مثالية للالريباسي 18S 28S و. تحليل (D) RT-QPCR يظهر نوعية عالية من التجارب مرنا معزولة TRAP في 3 مكررات البيولوجية المرحلة 16 الأجنة. ويتم احتساب تغيير أضعاف مقارنة المدخلات وتطبيع ضد الجين RpL32. Mef2 النصوص موجودة في كل الأنساب العضلات هي إثراء 2.3 أضعاف مقارنة لإدخال النصوص في حين ترهل أكثر تقييدا ​​هي المخصب 5.6 أضعاف. تنضب الخلايا العصبية معربا عن بروسبيرو والجينات soxN 2.2 أضعاف و 5.5 أضعاف على التوالي. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (ن = 3). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.