مقالة منهجية

TRAP-الصليب الأحمر، وترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية من بالسكان خلية نادر ذبابة الفاكهة الأجنة

DOI:

10.3791/52985

⸱

سبتمبر 10, 2015

 ,  ,  ,  , 
1University of Clermont-Ferrand, 2Memorial Sloan Kettering Cancer Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) قادرة على التقاط الترجمة الخاصة بنوع الخلية ل mRNA. نبلغ هنا عن أول بروتوكول TRAP مخصص لعزل mRNA في مجموعات الخلايا النادرة من أجنة ذبابة الفاكهة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر قياس مستويات mRNAs في عملية الترجمة في الخلايا الفردية معلومات عن البروتينات المشاركة في الوظائف الخلوية في وقت معين. البروتوكول الذي يطلق عليه اسم Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) قادر على التقاط عملية ترجمة mRNA هذه بطريقة خاصة بنوع الخلية. استنادا إلى تنقية تقارب البوليسومات التي تحمل وحدة فرعية ريبوسومية موسومة ، يمكن تطبيق TRAP على تحليلات الترجمة في الخلايا الفردية ، مما يجعل من الممكن مقارنة أنواع الخلايا أثناء العمليات التنموية أو تتبع تقدم تطور المرض وتأثير العلاجات المحتملة على المستوى الجزيئي. نبلغ هنا عن نسخة محسنة من بروتوكول TRAP ، تسمى TRAP-rc (الخلايا النادرة) ، مكرسة لتحديد الحمض النووي الريبي المشارك في الترجمة من مجموعات الخلايا النادرة. تم التحقق من صحة TRAP-rc باستخدام نظام الاستهداف Gal4 / UAS في مجموعة محدودة من خلايا العضلات في ذبابة الفاكهة الأجنة. يسمح هذا البروتوكول الجديد باستعادة الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية بكميات كافية لتحليلات التعبير الجيني العالمي مثل المصفوفات الدقيقة أو تسلسل الحمض النووي الريبي. إن متانة البروتوكول والمجموعات الكبيرة من برامج تشغيل Gal4 تجعل TRAP-rc نهجا متعدد الاستخدامات للغاية مع تطبيقات محتملة في الدراسات على مستوى الجينوم الخاص بالخلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فهم كيفية الخلايا تكتسب خصائص محددة خلال التنمية أمر بالغ الأهمية من أجل إدراك تعقيد الأجهزة وتطورها المحتمل تجاه الحالات المرضية. هناك دفعة كبيرة لبحث فك شبكات الجينات التنظيمية تشكل أساس مواصفات الخلايا والتمايز التي كتبها unrevealing ملامح التعبير الجيني العالمية، ووضع ملزمة بول الثاني، شغل النسخ عامل في تسلسل التنظيمية أو التعديلات بعد متعدية من الهستونات.

لتقييم التعبير الجيني في ميكروأرس على الصعيد العالمي وتستخدم نهج RNA وما يليها. ميكروأرس تسمح للكشف عن وفرة مرنا، في حين RNA وما يليها هو أفضل موجهة لإعلام على أنواع مختلفة من الرنا بما في ذلك الترميز وغير المرمزة noncoding الموجودة الرنا مثل microRNAs، lncRNAs أو snRNAs. ومع ذلك، يمكن لهذه التقنيات لا تفرق نسخه بنشاط، حالة استقرار مرنا، بنشاط-ترجمة مرنا، ومرنا دخول عملية التحلل. قياس ثابت-شارع تناولوا مستويات مرنا أنه من المعروف أن تقدير ضعف تكوين بروتيوم 1-3. في العكس من ذلك، تحديد بنشاط-ترجمة مرنا يعطي صورة أكثر دقة لإنتاج البروتين.

ومع ذلك، فقد تم أساسا أدت الدراسات transcriptomic على مستوى كامل الحي من خلال مقارنة بالربح أو الخسارة من وظيفة عامل محدد لمن النوع البري شرط 4-7 أو على تشريح الأنسجة، مما يجعل ملامح التعبير الجيني يصعب تفسيرها. التطورات الحديثة في أدوات استهداف الخلايا، وتنقية تقارب وتحسن حساسية تسمح الآن لإجراء تحليلات واسعة الجينوم على السكان خلية أو خلايا صغيرة حتى واحدة في الكائن الحي.

في ذبابة الفاكهة، مجموعات كبيرة من خطوط المعدلة وراثيا تمكن محددة تستهدف الزمني والمكاني من الأنسجة المختلفة والفئات السكانية الخلية عن طريق نظام GAL4 / UAS 10/08 العائد الكمي أكثر دقة من الآليات الجزيئية المطلوبة لوظيفة الخلية.

الحمار = "jove_content"> ومن بين المناهج المطورة حديثا polysome وقد وصفت التنميط التي كتبها تجزئة كوسيلة لالتقاط بنشاط-ترجمة RNA 11. هذا الأسلوب يعتمد على السكروز التدرج الطرد المركزي يسمح اختيار جزء polysome وتحديد مرنا ترجمت على نطاق الجينوم عند تحليلها مع ميكروأرس أو التسلسل عميق. ويمكن أن يقترن Polysome العزلة مع نوكلياز الهضم لتحديد آثار أقدام الريباسي المقابلة لشظايا الحمض النووي الريبي التي يحميها ريبوسوم خلال عملية الترجمة 12. البصمة الريباسي يزيد من دقة التحديد الكمي للترجمة RNA وقرار RNA على مستوى تسلسل وتحديد المواقع الريبوسوم، يجعل من الممكن لقياس معدل الترجمة. إلا أنه حتى اليوم لم يتم تطبيقه على عزل خلية محددة من translatomes، ويرجع ذلك أساسا إلى انخفاض قوي في الغلة RNA التي تم الحصول عليها في نهاية عملية البصمة الريبوسوم. وبالنظر إلى أن اختيار حجم RNA قد تولد المحتملين كاذبة صositives من RNPs المختلفة التي يمكن أيضا حماية RNA بطريقة مماثلة، وهناك حاجة إلى مزيد من التطورات لتحسين الريباسي البصمة وتكييفها مع النهج خلية محددة.

واحد من هذه الأساليب، ودعا وصفت في ترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية (TRAP) في عام 2008 من قبل هيمان وآخرون. وتطبق على عزل translatome من مجموعة فرعية من الخلايا العصبية في الفئران. قبل حاتمة العنونة بروتين الريباسي بطريقة الخلية من نوع معين، polysomes يمكن تنقيته بشكل انتقائي دون خطوة شاقة من التفكك الخلية والفرز. في هذه الحالة، 60S البروتين الريباسي L10a على سطح الريبوسوم كانت المعلمة مع EGFP 13. منذ عام 2008، وقد استخدمت العديد من الدراسات هذه الطريقة في أنواع مختلفة من الفئران 14-19 إلى العاشرة المورق 20،21، 22،23 الزرد ونبات الأرابيدوبسيس thaliana 24. كما تم تكييف طريقة TRAP للنموذج ذبابة الفاكهة وتستخدم لبوريمن mRNAs من الخلايا العصبية 25 و 26 النجمية السنة المالية المحددة من نوع الخلية. تم استخدام ثنائي نظام GAL4 / UAS متعددة للتعبير عن RpL10A GFP الموسومة بطريقة الأنسجة محددة. تم تشريح رؤساء الذباب الكبار لأداء اختيار polysome من الخلايا العصبية (التي تستهدفها عموم العصبي سائق Elav-GAL4) والرنا المعزولة والتسلسل. يتفق عدد كبير من الجينات تنظم يصل إلى أن يعرف أن يتم التعبير عنها في الجهاز العصبي، مشيرا إلى أن النهج خصوصية جيدة ودفع لنا لتكييفه مع السكان الخلية نادرة (أقل من 1٪ من الخلايا) الحاضر في وضع الأجنة ذبابة الفاكهة .

ضمن نموذج ذبابة الفاكهة، والمرحلة الجنينية هي نموذج للاختيار لدراسة العمليات التنموية، والجهات الفاعلة الجزيئية والحركات التخلق يتم حفظها التطورية. وقد تم تنفيذ النهج transcriptomic الوحيدة الأنسجة محددة التي أجريت حتى الآن في هذا النموذج باستخدام خلايا أو حتى النوويةrting وكانت فقط قادرة على دراسة Transcriptome على الحالة المستقرة 27-31، وخلق الحاجة إلى طرق مخصصة لالأنسجة / خلية محددة translatome التنميط في الجنين الطاير. نحن هنا تقرير أول بروتوكول TRAP مخصصة لأجنة ذبابة الفاكهة. مع هذا الأسلوب، وتشارك في الترجمة مرنا في السكان الخلية محدودة جدا من حوالي 100 خلايا العضلات في جنين تم عزل بنجاح مع جودة عالية وخصوصية. يتم استخدام GAL4 / نظام UAS ثنائي لدفع التعبير عن RpL10A الموسومة GFP في حيوانية من العضلات دون أي سمية، لا الظواهر الواضحة أو تأخر في النمو كما هو موضح سابقا 25. أجنة ذبابة الفاكهة تمتلك 30 العضلات في hemisegment التي من شأنها أن تؤدي إلى الجهاز العضلي من اليرقة. باستخدام المنطقة التنظيمية التي اكتشفت في المنطقة المجاورة للهوية الجينات ترهل، 6 من 30 العضلات متعددة الأنوية هي المستهدفة. في هذا الاختبار، وثبتوا ريبوسوم على مرنا باستخدام استطالة الترجمةالمانع سيكلوهيكسيميد. ثم يتم استخدام مقتطفات عصاري خلوي لتنقية تقارب مع حبات مغناطيسية المغلفة الأجسام المضادة GFP. تم التحقق نوعية RNA تنقيته باستخدام bioanalyzer. وقد استخدم الكمي عكس النسخ PCR (RT-QPCR) لتحديد خصوصية وحساسية مرنا العزلة وأثبتت أن لدينا بروتوكول الأمثل هو كفاءة عالية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. يطير الجيل الخط

  1. توليد اثنين من بنيات مختلفة. في بناء أول، RpL10A كدنا] (الريباسي البروتين الوحيدات L10a) يتم استنساخ المصب من GFP إلى pUASP-PL-GFP-Nter البلازميد (نسخة معدلة من 32). استخدام المروج سلالة الجرثومية يسمح استخدام أكثر متعدد التكافؤ من خط المعدلة وراثيا.
    ملاحظة: الحصول على بناء الثاني عن طريق الاستنساخ التسلسل التنظيمي القيادة التعبير الأنسجة محددة من الجين ترهل المنبع من GAL4 (TF) باستخدام pPTGAL4 البلازميد.
  2. حقن البلازميدات على حدة إلى 1118 ث الذباب وإدراج يبني في الجينوم الذبابة التي كتبها P-عنصر الإدراج (وفقا للإجراءات القياسية) 33.
  3. اختر transformants من أجل استعادة خطوط الطيران مع يبني على اثنين من الكروموزومات مختلفة. يتم إنشاء خط TRAP النهائي من خلال الجمع بين هذين الخطين (الصلبان الوراثية) من أجل الحصول على خط واحد ثابت المزدوج المعدلة وراثيا. F0: W-. CYO، UAS EGFP :: RpL10A. MKRS / TM6Bس W-؛ CYO / المجلس الأعلى للجامعات، التهدل GAL4 / TM6B. F1: W-. CYO، UAS EGFP :: RpL10A. ترهل GAL4 / TM6B. كبير تضخيم هذا الخط، وجمع الأجنة نظموا المطلوب.

2. جمع الأجنة

  1. إعداد 8 أقفاص السكان اسطوانية كبيرة تحتوي على حوالي 40 غراما من الذباب الشباب في قفص (حوالي 180،000 الذباب / القفص).
  2. المضي قدما في ما يسمى ما قبل الأناشيد التي تسمح الذباب لمسح الأجنة النامية من ناقلة البيضات بهم. لذلك، ووضع الذباب لمدة 1 ساعة على طبقين 11 سم القطر بتري تحتوي على خليط من طدت أجار وعصير العنب وتغطية ⅓ من السطح مع طازجة من صنع عجينة الخميرة. بعد 3 تبادل العنب لوحات عصير جمع الأجنة حقيقية على مماثلة لوحات مصنوعة حديثا.
    وتختلف فترة حضانة وفقا لالتنموي الوقت النافذة درس: ملاحظة.
  3. إزالة لوحات من أقفاص وتركهم في نفس درجة الحرارة للمدة الزمنية اللازمة للحصول على مرحلة تنموية الصحيحة (على سبيل المثال، 3 ساعة من وضع البيض + 10 ساعة من الخا IONAL حضانة يعطي الأجنة من مرحلة 10-13 ساعة بعد وضع البيض (AEL)). Resuspend والمحتوى لوحة (الأجنة، معجون الخميرة، الذباب الميت) مع 50 مل من الماء باستخدام الفرشاة.
  4. تذهب من خلال سلسلة من المناخل (700 ميكرون، 355 ميكرون، 112 ميكرون) لفصل الأجنة من الذباب الميت وتبقى أجزاء الجسم وجمع الأجنة المتبقية على منخل قطرها أصغر، ثم تغسل لفترة وجيزة في الماء منزوع الأيونات. لا تستخدم أكثر من 18 لوحات في جمع لأنها يمكن أن تسد المناخل.
  5. الأجنة Dechorionate في 4.5٪ التبييض في الماء منزوع الأيونات لمدة 2 دقيقة ويشطف جيدا بالماء منزوع الأيونات لمدة 30-60 ثانية. احتضان الأجنة في برنامج تلفزيوني 0.01٪ توين 20، 100 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد، لمدة 5-10 دقيقة في RT في إطار التحريض.
  6. الأجنة الجافة على السليلوز ورقة ماصة ونقلها إلى أنابيب microcentrifuge. وزن الأنابيب وفلاش تجميد الأجنة عن طريق الغمر في النيتروجين السائل. في هذه المرحلة، والأجنة المجففة ويمكن تخزينها لعدة أشهر في -80 ° C.

الطبقة = "jove_title"> 3. إعداد الخرز المغناطيسي إلى جانب لGFP الضد

  1. و resuspend بدقة بروتين G حبات مغناطيسية في زجاجة الأصلية عن طريق الإثارة لطيف.
  2. نقل 90 ميكرولتر من الخرز لأنبوب ريبونوكلياز خالية وجمعها على المغناطيس (30-60 ثانية). 90 ميكرولتر من الخرز ضروري لأداء مناعي (IP) مع 1 مل من المحللة التي تحتوي على 60-80 ملغ / مل البروتينات. احترام نسب لمنع حبة التشبع. استخدام العديد من الأنابيب وفقا لكمية البروتين.
  3. تغسل حبات مع 1 × PBS 0.01٪ توين 20 (500 ميكرولتر) وجمع حبات على مغناطيس لتجاهل طاف. إضافة 30 ميكروغرام من GFP الأضداد في 350 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 0.01٪ توين 20 إلى الخرز واحتضان مع نهاية بطيئة على نهاية خلط لمدة 30 دقيقة في RT.
  4. جمع حبات على مغناطيس (30-60 ثانية)، ونبذ طاف وشطف في 500 ميكرولتر من استخراج العازلة polysome (HEPES 10 مم، 150 مم بوكل، MgCl 2 5 ملم، DTT 0.5 ملم، تريتون 1٪، سيكلوهيكسيميد 100 ميكروغرام / مل ، العلاقات العامةotease المانع 1 ×، ريبونوكلياز المانع 100 U).
  5. جمع حبات على مغناطيس وإضافة 500 ميكرولتر من عرقلة العازلة (BSA 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر، الحمض الريبي النووي النقال الخميرة 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر، جليكوجين 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر في polysome استخراج العازلة).
  6. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT وكرر هذه الخطوة مرة واحدة مع عازلة تمنع الطازجة.
  7. جمع حبات على مغناطيس وشطف في 500 ميكرولتر من استخراج العازلة polysome، ثم يتذكر الخرز والشروع فورا في خطوة immunopurification (المادة 6).

4. المحللة التحضير

  1. قبل البدء، وإعداد البرنامج على حبات السرعة متعددة الاتجاهات طاحونة: 2 × 10 ثانية في 5000 دورة في الدقيقة، 15 ثانية وقفة. نقل الأجنة المجففة (1.5 غرام) إلى 15 مل أنابيب prechilled على الجليد التي تحتوي على استخراج العازلة polysome، والتجانس على الفور. التجانس 1.5 غرام من الأجنة في 4 مل من استخراج العازلة polysome.
  2. انتشار المتجانس الأجنة في اثنين prechilled 2 مل أنابيب وطحن امبرينظام التشغيل عن طريق تشغيل برنامج الخالط. نقل المحللة إلى أنابيب microcentrifuge prechilled جديدة على الجليد وإعداد طاف خلف النواة بواسطة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 2000 غرام.
  3. نقل طاف لأنبوب microcentrifuge prechilled جديدة على الجليد، إضافة 1/100 حجم العينة من 10٪ Nonidet P-40 لطاف (تركيز النهائي = 0.1٪)، وتخلط برفق بواسطة قلب الأنبوب.
  4. نبض الطرد المركزي العينة في minifuge لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب، إضافة 09/01 حجم عينة من 300 ملي 1،2-Diheptanoyl-SN-Glycero-3-Phosphocholine (DHPC) (تركيز النهائي = 30 ملم )، ومزجها بلطف بواسطة قلب الأنبوب، واحتضان الخليط على الجليد لمدة 5 دقائق (مزيج من قبل قلب عدة مرات خلال الحضانة).
  5. إعداد طاف بعد الميتوكوندريا بواسطة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 20000 ز. قياس تركيز البروتين بواسطة الأسلوب برادفورد: يجب أن يكون التركيز في المحللة بين 60-80 ملغ / مل. تيأك طاف لجديد أنبوب microcentrifuge prechilled جديدة والشروع فورا في الخطوة ما قبل امتصاص (القسم 5).

5. قبل امتصاص

  1. تماما resuspend والخرز المغناطيسي من قبل الإثارة لطيف ونقل 30 ميكرولتر من الخرز في أنبوب microcentrifuge في RT (30 ميكرولتر من الخرز / 1 مل المحللة الجنينية).
  2. جمع حبات على مغناطيس، ماصة قبالة طاف، و resuspend حبات في استخراج العازلة polysome (500 ميكرولتر). جمع حبات على مغناطيس، إضافة المحللة الجنينية، واحتضان لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية على محور دوار.
    1. إزالة الخرز والحفاظ على طاف على الجليد للخطوة immunopurification. قبل immunopurification، والحفاظ على 100 ميكرولتر من طاف (المدخلات) لمقارنة عينة الحمض النووي الريبي العالمية مع عينة الحمض النووي الريبي التي تم جمعها بعد immunopurification، من خلال RT-QPCR على سبيل المثال.

6. Immunopurification

  1. إضافة 1 مل (الموافق 60-80 ملغ / مل بروتين) ل-استيعابها قبل المحللة إلى أنبوب خالية من ريبونوكلياز تحتوي على 90 ميكرولتر من الخرز منعت بالإضافة إلى GFP الأضداد. احتضان العينات عند 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع طيف خلط نهاية الإفراط في نهاية في محور دوار أنبوب. بدلا من ذلك، نفذ حضانة O / N عند 4 درجات مئوية.
  2. بعد مرور فترة الحضانة، وجمع حبات على مغناطيس. استخدام minifuge لتدور باستمرار الخرز، resuspend ثم لهم في 500 ميكرولتر من غسل العازلة (HEPES 10MM، بوكل 350MM، MgCl 2 5MM، Nonidet P-40 1٪، DTT 0.5 ملم، سيكلوهيكسيميد 100 ميكروغرام / مل، ريبونوكلياز المانع 100 U ) وجمعها على المغناطيس. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
  3. تغيير حبات لprechilled أنبوب ريبونوكلياز خالية الجديد ويغسل مرتين. جمع حبات على مغناطيس، والشروع في استخراج الحمض النووي الريبي بإضافة 1 مل TRiZol مباشرة إلى الخرز واتبع تعليمات الشركة الصانعة.

7. RNA التنظيف وتقييم الجودة

  1. استخدام عدة RNeasy مايكرو حسب تعليمات الشركة الصانعة. في الإنجاز، elutالبريد RNA مع (س) ميكرولتر ريبونوكلياز خالية من المياه. دافئ لمدة 2 دقيقة عند 60 درجة مئوية، وتخزين العينات المجمدة الإضافية في -80 ° C. تحقق RNA الجودة باستخدام bioanalyzer (اتبع تعليمات الشركة الصانعة).
  2. لاختبار خصوصية TRAPed RNA، نفذ النسخ العكسي في 3 نانوغرام من الحمض النووي الريبي المنقى (المدخلات وIP) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (مرتفع III). استخدام كدنا] التي تم الحصول عليها عن QPCR باستخدام مجموعات التمهيدي الجينات المحددة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتكون نظام العضلات الجسدية الجنينية ذبابة الفاكهة من 30 العضلات في hemisegment، وكل العضلات لديها مجموعة محددة من خصائص: كود الجينات الهوية، والموقف، وعدد من الفعاليات الانصهار، ومواقع الحجز وتعصيب. وتحديد ترجم مرنا في مجموعة فرعية محددة من العضلات إعطاء معلومات عن البروتينات اللازمة لتشكيل هذه الخصائص محددة من العضلات. باستخدام طريقة القائم على TRAP، RNA من جزء من السكان من عضلات التعبير عن ترهل الجينات الهوية وتنقيته (الشكل 1A-B). ومصدر القلق الرئيسي لهذا النهج هو نوعية وخصوصية الحمض النووي الريبي معزولة. بروتوكول الأمثل ذكرت هنا مكن انتعاش منهجية عالية الجودة RNA المقررة مع التحليل bioanalyzer. وتظهر الصورة التي تم الحصول عليها أي تدهور الحمض النووي الريبي (الشكل 1C).

في الدراسات التي وضعت حول طريقة TRAP، أثيرت تساؤلات بشأن خصوصية البيانات. هنا نحن طmprove طريقة لقمع الخلفية المرتبطة ملزم من الحمض النووي الريبي لحبات أو أنابيب غير محددة والاستفادة المثلى من غسل العازلة. من أجل تقييم مستوى الخلفية وكفاءة عزل الخلايا، معربا عن ترهل، ونحن أدت التجارب RT-QPCR على 3 مكررات من نفس المرحلة الجنينية. أضعاف التخصيب من 4 جينات مختلفة (mef2، ترهل، بروسبيرو، soxNeuro) حسبت مقارنة المدخلات وتطبيع ضد الجين RpL32 (1D الشكل). وأظهرت هذه النتائج تخصيب 2.3 أضعاف من mef2 الجينات عموم العضلات وتخصيب 5.6 أضعاف من الجين ترهل. في المقابل، الجينين أعرب في النظام العصبي وقد المنضب مقارنة المدخلات. لوحظ تغيير القيم أضعاف مشابهة جدا على 3 مكررات البيولوجية، مما يدل على أن البروتوكول هو القوي. مع سائق التهدل-GAL4 وبدءا من 1.5 غرام، حول 1.5x10 ^ 6 أجنة تم الحصول عليها التي تحتوي على 100 خلية GFP / جنين (ما مجموعه 150 × 10 ^ 6 إيجابيةالخلايا).

بعد تشغيل التجربة TRAP، العائد حوالي 25-45 نانوغرام من الحمض النووي الريبي محدد اعتمادا على مرحلة من الفائدة. هذه المواد هي كافية لتشغيل تحليل ميكروأري أو RNA وما يليها باستخدام بروتوكول التضخيم لبناء مكتبة RNA وما يليها. سوف الكفاءة تعتمد بشدة على قوة السائق تستخدم للتعبير عن RpL10A-EGFP.

figure-results-1
الشكل 1. الجودة وتقييم نوعية من الحمض النووي الريبي معزولة TRAP من التهدل-GAL4> الأجنة UASRpL10A-EGFP.

(AB) صور متحد البؤر لمرحلة 16 الجنين تظهر RpL10A-EGFP التعبير على وجه التحديد في ست خلايا العضلات التهدل في hemisegment (A). لوحظ شارك في توطين RpL10A-EGFP مع الجنرال علامة العضلات Beta3tubulin على الصورة دمج (B). (C) مراقبة الجودة من TRAPed RNA ران على bioanalyzer تبين سلامة مثالية للالريباسي 18S 28S و. تحليل (D) RT-QPCR يظهر نوعية عالية من التجارب مرنا معزولة TRAP في 3 مكررات البيولوجية المرحلة 16 الأجنة. ويتم احتساب تغيير أضعاف مقارنة المدخلات وتطبيع ضد الجين RpL32. Mef2 النصوص موجودة في كل الأنساب العضلات هي إثراء 2.3 أضعاف مقارنة لإدخال النصوص في حين ترهل أكثر تقييدا ​​هي المخصب 5.6 أضعاف. تنضب الخلايا العصبية معربا عن بروسبيرو والجينات soxN 2.2 أضعاف و 5.5 أضعاف على التوالي. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (ن = 3). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه الورقة المعدلة الترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية البروتوكول (يطلق عليها اسم "TRAP-الصليب الأحمر") مخصصة لدراسة السكان الخلية نادرة في الأجنة ذبابة الفاكهة. يتم توفير معلومات عن الخطوات الرئيسية لعزل ناجحة من الحمض النووي الريبي معين مع تحقيق عائد مناسب لميكروأري أو تحليل الحمض النووي الريبي وما يليها، أي 1) كمية من المواد البيولوجية المطلوبة وإجراء الأمثل للتحلل الجنين واستخراج polysome. 2) الخرز / نسب للمناعي الأمثل المحللة الأجسام المضادة ل؛ 3) خطوات السماح الحد من الخلفية بما في ذلك غسل تكوين عازلة وذلك لتشغيل تجارب TRAP RC مع خصوصية عالية وحساسية.

هذا البروتوكول غلة البيانات استنساخه مما يجعل تطبيقها بسهولة إلى أي نوع من أنواع الخلايا الأخرى. هذا الأسلوب يجعل من الممكن لتحليل الفرق التعبير الجيني على مستوى مرنا بنشاط-ترجمة وبالتالي تمهيد الطريق لفهم البروتين التعبير في المواصفات IFIC نوع من الخلايا في إطار زمني محدد. ومع ذلك نلاحظ أن وفرة البروتين سيعتمد على معدل عمليات الترجمة والتدهور. العيوب الرئيسية للطريقة TRAP هو عدم قدرتها على قياس محتوى البروتين بطريقة كمية دقيقة أو للكشف عن تعديل آخر متعدية. يمكن تحسين الكمي عن طريق قياس كثافة الريبوسوم على طول الجسم مرنا، وعند القيام بذلك، بطريقة الخلية من نوع معين جعل TRAP جنبا إلى جنب مع الريبوسوم البصمة أداة قوية جدا. في ورقة حديثة 34، تم إجراء هذا المزيج في الجنينية الكلى 293 الخلايا البشرية. ونشرت الكتاب البصمة نوكلياز تليها تنقية تقارب من شكل المعقدة البيروكسيديز محرض من RpL10A باستخدام الخرز streptavidin. هذا هو دليل على مبدأ أنه من الممكن لأداء البصمة الريبوسوم في الحي كله في حين استهدفت نوع خلية معينة، وتقييد يجري كمية المواد البيولوجية اللازمة لهذا الغرض.

"> إجراء التجارب TRAP بالتوازي مع التحليلات transcriptomic العالمية سوف تجعل من الممكن لتتبع النسب بين حديثا كتب وactively- ترجمة RNA، وهذا سيكون بالمعلومات عميق لآليات ما بعد النسخي المحتملة التي تجري في سياقات تنموية محددة أو السكان خلية معينة microRNAs بقلم على سبيل المثال.

في الختام، TRAP يعد طريقة فعالة للغاية ومحددة وحساسة لتحديد الرنا بد أن بنشاط-ترجمة ريبوسوم بطريقة خلية محددة. هذه الطريقة يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من الكائنات الحية وأنواع الأنسجة. وكان محسن بروتوكول TRAP-الصليب الأحمر الجديد هو موضح هنا للالسكان الخلية نادرة (أقل من 1٪ من إجمالي عدد الخلايا) وكمية من المواد النهائية كافية للتحليلات لاحقة على مستوى كامل الجينوم.

A الحد الممكن من هذا الأسلوب هو شرط دافعا قويا لإنتاج ريبوسوم الموسومة في كمية كافية لتراكبمؤسسة التدريب الأوروبية بأخرى لازال المحلية في نوع من الخلايا المستهدفة. في دراسة حديثة 25، قدرت الكتاب إلى 10-30٪ نسبة الموسومة مقابل ريبوسوم لازال.

للتغلب على هذه المشكلة زيادة UAS-RpL10A-EGFP عدد نسخة من شأنه أن يحسن بشكل كبير هذا التوازن. بدلا من ذلك، إضافة إلى خلفية وراثية وصف التحوير UAS-GAL4 وتضخيم إنتاج البروتين GAL4 وغير مباشرة زيادة التعبير عن RpL10A-EGFP. وهذا ينبغي أن تحبذ عقد الإشغال أفضل للريبوسوم الموسومة على مرنا.

لاحظ أن هذا نهج فعال بالفعل ويمكن إجراء أكثر قوة وتكييف الأساليب المكملة لجلب المزيد من الجانب الكمي أو لاكتشاف وكشف الآليات الجزيئية التي تعد ضرورية للسيطرة على التعبير الجيني.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون نيكولاس أليغري ومود بيني وجان فيليب دا بونتي على مساعدتهم الفنية الممتازة. تم دعم هذا العمل من قبل الوكالة الوطنية للبحوث (ANR-JC-CARDIAC-SPE) ، ومنحة INSERM الابتدائية ، ومنحة ANR ID-CELL-SPE ، و Equipe FRM ومنحة AFM 15845.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
HEPESSigma H4034-1006
1،2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine أفانتي القطبية للدهون850306P
الجليكوجينالحراري العلمي R0561
تنقية BSA 100X & nbsp ؛BiolabsB9001
الخميرة tRNA   ؛سيجماR5636
سوبر RNase في استنساخ الأجسام المضادة AmbionAM2694
GFP N86 / 38UC DAVIS / NIH Neuromab كلية الأجسام المضادة المدمجة75-132   ؛
Nonidet P40  Roche11754595001
Precellys 24 Lysis homogenisation بيرتين تكنولوجي
خالية من المياه نوكليز Nalgene
Dynabeads ProteinGInvitrogen10004D
كلوريد البوتاسيوم (KCl)النظام الحيوي التطبيقي  AM96406
كلوريد المغنيسيوم (MgCl2)   ؛النظام الحيوي التطبيقي AM95306
السليلوز والدين غير المبيض VWR115-2597 
المناخل 112, 355, 710 um Retsch
TRiZol Invitrogen15596-018
MagRack 6GE HealthCare 28948964
نصائح مرشح منخفضة الربط   ؛ClearLine
Rnase الخالي من الأنبوب 1.5 مل  ClearLine390689DD
Tween 20 فيشر بيورېكائن BP337-500
Cycloheximide  سيجما الإنزيم C1985
، Mini-Complete ، خالية من EDTA  ؛روش11836170001
أنبوب أقراص مثبطات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).">Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).
  2. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples. FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).">Maier, T., Guell, M., Serrano, L. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples. FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).
  3. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (1038).">Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (1038).
  4. Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors. Genes. 21, 3163-3180 (2007).">Junion, G., et al. Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors. Genes. 21, 3163-3180 (2007).
  5. Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network. Genes. 21, 2448-2460 (2007).">Jakobsen, J. S., et al. Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network. Genes. 21, 2448-2460 (2007).
  6. Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity. PLoS genetics. 6, e1001014(2010).">Cunha, P. M., et al. Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity. PLoS genetics. 6, e1001014(2010).
  7. A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster. Genes, & development. 21, 436-449 (2007).">Sandmann, T., et al. A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster. Genes, & development. 21, 436-449 (2007).
  8. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512, 91-95 (2014).">Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512, 91-95 (2014).
  9. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).">Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).
  10. REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila. Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).">Gallo, S. M., et al. REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila. Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).
  11. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).">Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
  12. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).">Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).
  13. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).">Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
  14. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135, 749-762 (2008).">Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135, 749-762 (2008).
  15. Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells. Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).">Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells. Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).
  16. Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression. PloS one. 6, e20605(2011).">Fomchenko, E. I., et al. Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression. PloS one. 6, e20605(2011).
  17. Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo. PloS one. 7, e46965(2012).">Helmy, K., et al. Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo. PloS one. 7, e46965(2012).
  18. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).">Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  19. A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system. Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82(2014).">Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system. Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82(2014).
  20. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).">Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  21. Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).">Watson, F. L., et al. Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).
  22. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).">Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).
  23. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).">Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
  24. Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control. Molecular systems biology. 6, 419(2010).">Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control. Molecular systems biology. 6, 419(2010).
  25. A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila. PloS one. 7, e40276(2012).">Thomas, A., et al. A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila. PloS one. 7, e40276(2012).
  26. Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles. G3. , (2015).">Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles. G3. , (2015).
  27. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genome Res. 22, 766-777 (2012).">Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genome Res. 22, 766-777 (2012).
  28. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).">Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).
  29. Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity. Cell reports. 8, 858-870 (2014).">Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity. Cell reports. 8, 858-870 (2014).
  30. Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis. Fly. 5, 261-265 (2011).">Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis. Fly. 5, 261-265 (2011).
  31. Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity. Development. 139, 1164-1174 (2012).">Busser, B. W., et al. Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity. Development. 139, 1164-1174 (2012).
  32. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).">Rorth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).
  33. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).">Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  34. Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes. Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).">Ingolia, N. T., et al. Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes. Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

TRAP rc GFP Bioanalyzer RT QPCR

مقالات ذات صلة