في هذه الدراسة ، تم تحسين تقنية مجهرية ضوئية مفصلة للمراقبة والتحليل في الوقت الفعلي لحركة أهداب CPEC خارج الجسم الحي جنبا إلى جنب مع طريقة مجهرية إلكترونية لتحليل البنية الفوقية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مراقبة الحركة الهدبية من الخلايا المشيمية الضفيرة طلائي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تقع الضفيرة المشيمية في جدار البطين في الدماغ ، ويعتقد أن وظيفتها الرئيسية هي إنتاج السائل النخاعي. تحتوي الخلايا الظهارية للضفيرة المشيمية (CPECs) التي تغطي سطح أنسجة الضفيرة المشيمية على العديد من الأهداب الفريدة ، ولكن لا يزال يتعين التحقيق في معظم وظائف هذه الأهداب. للكشف عن وظيفة أهداب CPEC مع الإشارة بشكل خاص إلى حركتها ، تم تطوير نظام مراقبة خارج الجسم الحي لمراقبة الحركة الهدبية خلال فترات الجنين والفترة المحيطة بالولادة وما بعد الولادة. تم تشريح الضفيرة المشيمية من بطين الدماغ ولاحظت تحت مجهر تباين محسن بالفيديو مزود بصريات تباين التداخل التفاضلي. في ظل هذه الحالة ، تم تطوير طريقة بسيطة وكمية لتحليل الملامح المتحركة لأهداب CPEC لعدة ساعات خارج الجسم الحي. بعد ذلك ، لوحظت التغيرات المورفولوجية للأهداب أثناء التطور عن طريق الفحص المجهري الإلكتروني لتوضيح العلاقة بين النضج المورفولوجي للأهداب والحركة. ومن المثير للاهتمام أن هذه الطريقة يمكن أن تحدد التغيرات في عدد وطول الأهداب ، والتي بلغت ذروتها في يوم ما بعد الولادة (P) 2 ، بينما وصل تواتر الضرب إلى الحد الأقصى عند P10 ، يليه توقف مفاجئ عند P14. ستمكن هذه التقنيات من توضيح وظائف الأهداب في الأنسجة المختلفة. بينما تم نشر التقنيات ذات الصلة في تقرير سابق1 ، تركز الدراسة الحالية على التقنيات التفصيلية لمراقبة حركة ومورفولوجيا أهداب CPEC خارج الجسم الحي.
المقدمة
الأهداب هي نتوءات تشبه الشعر على سطح معظم خلايا الفقاريات ، والتي جذبت انتباه الباحثين الطبيين بسبب فئة من الأمراض تسمى الاعتلال الأهدبي 2-4. على الرغم من التعبير المنتشر عن العضية في كل مكان ، فقد تم الإبلاغ عن مجموعة متنوعة من الوظائف الهدبية ، بما في ذلك الحركة والاستشعار الحيوي. على سبيل المثال ، تنقل الأهداب المتحركة على سطح الغشاء الظهاري المخاط5 والحطام الظهاري إلى مخرج المسالك ، وبالتالي منع المرض عن طريق تطهير سطح الظهارة. علاوة على ذلك ، خلال فترات النمو المبكرة والمراحل الجنينية ، تنظم الأهداب تكاثر الخلايا الجذعية6 ، وتشارك في تحديد عدم تناسق اليسار واليمين لجسم الفقاريات7.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على البروتوكولات واستخدام حيوانات التجارب رعاية الحيوان واستخدام اللجان المؤسسية في جامعة ياماناشي وجامعة واسيدا. وقد أجريت رعاية الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
1. إعداد CPEC
- إعداد الأجهزة والمواد التالية: المجهر ستيريو، ويفضل أن يكون قادرا على نقل الإضاءة من الأسفل. زوج من ملقط ساعاتي (دومون # 3 أو رقم 4)، تعقيم اللهب، مقص التشغيل على التوالي، تعقيم اللهب. اثنين العقيمة أطباق 10 سم من البلاستيك تحتوي على 20 مل الجليد الباردة يبوفيتش L-15 متوسطة. أ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويظهر لمحة عامة عن سير العمل في الشكل 1، بما في ذلك الصور من الأجهزة.
ملاحظات الحركة الحية من CPECs
فيلم 1 يظهر الفيلم من CPECs معزولة عن ماوس فترة ما حول الولادة، وفيلم 2 يبين وجهة نظر موسعة من الصور في الفيلم 1. وتجدر الإشارة إلى أن نصائح الهدبية الفردية هي أقل وضوحا في الصور .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وجهات النظر هذه الطريقة
على الرغم من أن تقنية الموضحة هنا لا تقدم تحليلا أكثر تفصيلا للأهداب من الطرق التي تم نشرها مسبقا، وأهمية هذه التقنية تكمن في بساطة النظام والفعالية من حيث التكلفة، والتي يمكن تطبيقها بسهولة على فحص أي نوع من الحركة الهدبية خارج الحي. على وجه الخصوص، TI طاولة العمل يوفر واجهة بسيطة وسهلة الاستعمال تمكن الباحثون إلى رصد وتحليل الهدبية الحركة أكثر سهولة. لم يتم وضعها فعالة طرق تتبع .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة. تهدف هذه الورقة إلى تقديم التقارير منهجية مفصلة لمراقبة الحركة من أهداب في الأنسجة الضفيرة المشيمية معزولة. وقد تم الإبلاغ عن المستجدات العلمية في الدراسات السابقة 1،8.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال مشروع للجامعات الخاصة: دعم صندوق مطابقة من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا (MEXT) في اليابان (T.I.) ومنح المعونة للبحث العلمي (C) من MEXT (S.T. و K.N).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم
الشركة
رقم فهرسي
التعليقات
< td colspan = "4" > لإعداد SEM < / قوي > الإيثانول اللامائي (PBS) عازلة الفوسفات الجاف < td colspan = "4" > أدوات ومواد للتشريح < / strong > < td colspan = "4" > لكل من التصوير المباشر وإعداد SEM < / مجهر قوي > ورقية مسطحةبلاستيكي 10 سم < td colspan = "4" > لتصوير الخلايا الحية < / طبقtd colspan = "4" ><قوي> لتحضير SEM < / معدنية قوية > دقيقة أسنان نقل العينة < td colspan = "4" ><قوية > معدات ومواد مجهرية < / strong > < td colspan = "4" > لتصوير الخلايا الحية < / مجهر قوي > يمكن استخدام مرشح طاولة عزل الاهتزاز مجموعات
| <قوي>الكواشف المطلوبة< / strong> | |||
|---|---|---|---|
| لتصوير الخلايا الحية< / قوي > | |||
| إيثانول | واكو كيماويات | 057-00456 | |
| Leibovitz L-15 تقنيات العمر المتوسط | 11415-064 | ||
| إيثانول | واكو كيماويات | 057-00456 | |
| محلول الملح المتوازن من هانك | Life Technologies | 14170112 | |
| paraformaldehyde | ميرك | 1040051000 | |
| الجلوتارالديهايد | Nacalai tesque | 17003-05 | |
| isoamyl acetate | Nacalai tesque | 02710-95 | |
| المناخل الجزيئية 4A 1/8 ؛ | واكو للكيماويات | 130-08655 | لتحضير |
| محلول ملحي عازل لفوسفات | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ، 0.1 م | لصنع 100 مل ، امزج 19.0 مل من 0.1 ؛ M NaH2PO4 و 81.0 مل من 0.1 M Na2< / sub>HPO4< / sub> | ||
| فوسفات أحادي الصوديوم (ثنائي هيدرات) | Nacalai tesque | 31718-15 | |
| فوسفات ثنائي الصوديوم (اللاماء) | Nacalai tesque | 31801-05 | |
| suclose | Nacalai tesque | 30406-25 | |
| رابع أكسيد الأوزميوم | Nisshin EM | 300 | |
| الثلج | |||
| [header] | |||
| ستيريو | Olympus | SZX7 | |
| منشفة | |||
| &Phi ؛ طبق | |||
| 100 مل دورق | |||
| مقص تشغيل مستقيم | Sansyo | S-2B | |
| صانع الساعات ملقط | Dumont | No.DU-3 أو -4 ، INOX | |
| سفلي قوي > زجاجي | ماتسونامي | زجاج D110300 < | |
| رقائق | |||
| قارورة زجاجية 5 مل مع غطاء بولي إيثيلين | Nichiden Rika-Glass | PS-5A | |
| ماصة نقل | Samco Scientific | SM251-1S | لعود |
| لنقل العينات | |||
| أيون الرش مع الذهب البلاديوم | هيتاشي | مجفف النقطة الحرجة E-1030 | |
| هيتاشي | HCP-2 | ||
| [header] | |||
| مقلوب | أوليمبوس | IX81 | |
| 100 واط مبيت مقطوع زئبق وإمدادات الطاقة | أوليمبوس | U-ULH و BH2-RFL-T3 | |
| 100 واط مصباح زئبق | Ushio | USH103D | |
| DIC مكثف ، NA 0.55 | Olympus | IX-LWUCD | |
| مصراع كهربائي | Vincent Associates | VS35S22M1R3-24 و VMM-D1 | مصراع يدوي. |
| مرشح تمرير النطاق (400-700 & nbsp ؛ نانومتر ، & فاي ؛ 45 مم) | Koshin Kagaku | C10-110621-1 | |
| ND (&Phi ؛ 45 مم) | أوليمبوس | 45ND6 ، 45ND25 | ، يتم استخدام مجموعة من مرشحات 25٪ و 6٪ ND |
| عدسة موضوعية (الغمر في الماء) مع عنصر DIC | Olympus | UApo 40XW / 340 ، NA ، 1.15 مع كاميرا فيديو عالية السرعة IX-DPAO40 | |
| Allied Vision Technologies | GE680 | & # 8805 ؛ 200 هرتز معدل الإطارات و 1 مللي ثانية تكشف الوقت | |
| الحصول على الصور / تحليل البرمجيات | في المنزل | TI Workbench | قادرة على الحصول على معدلات إطارات عالية. |
| كمبيوتر للتحكم في الكاميرا / تحليل | Apple Mac Pro | ||
| Meiritsu Seiki | AD0806 | ||
| الوزن للأنسجة | مرساة شريحة | Warner Instruments | يمكن صنعه بشبكة نايلون ملتصقة على شكل حرف U مطحون & 0.5 سلك بلاتيني مم. |
| غطاء زجاجي (وزن بديل للأنسجة) | ماتسونامي | مصنوع حسب الطلب | يمكن استخدام زجاج الغطاء كوزن للنسجة. |
| <قوي> ل SEM< / مجهر قوي > | |||
| مقلوب | Olympus | IX81 | |
| مجهر إلكتروني ماسح | JEOL | JSM-6510 |
المراجع
- Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period. Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).
- Bisgrove, B. W., Yost, H. J. The roles of cilia in d....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
