مقالة منهجية

الجزيئية التحقيق الأمثل لتحديد معدل الوفيات خلية في الكائن الضوئي ( Microcystis الزنجارية) باستخدام التدفق الخلوي

DOI:

10.3791/53036

⸱

يناير 29, 2016

 ,  , 
1Department of Life and Environmental Sciences, Faculty of Science and Technology, Bournemouth University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السكان الميكروبية تحتوي على التجانس الخلية كبيرا، وهو ما يمكن أن تملي السلوك العام. تحليل المسبار الجزيئي من خلال التدفق الخلوي يمكن تحديد الدول الفسيولوجية للخلايا، ولكن تطبيقه يختلف بين الأنواع. وتقدم هذه الدراسة بروتوكول لتحديد بدقة وفيات خلية ضمن مجموعة من السكان cyanobacterium، دون التقليل أو تسجيل نتائج إيجابية كاذبة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد ثبت القطعان الميكروبية في الدراسات الميدانية والمختبرية لعرض التجانس عالية في المعلمات المورفولوجية والفسيولوجية. تحديد الدولة في الوقت الحقيقي من خلية الميكروبية تتجاوز فئات حية أو ميتة، والميكروبات يمكن أن توجد في حالة سبات، حيث يتم تخفيض انقسام الخلايا والأنشطة الأيضية. نظرا للحاجة إلى الكشف وتقدير من الميكروبات، التدفق الخلوي (FCM) مع تحقيقات الجزيئية يوفر طريقة سريعة ودقيقة للمساعدة في تحديد قابلية السكان عموما. باستخدام SYTOX الأخضر والبرتقالي SYTOX في البكتيريا الزرقاء نموذج Microcystis الزنجارية للكشف عن سلامة الغشاء، ونحن نطور طريقة تحويل للدلالة السريع وفيات خلية واحدة. سيتم إحالة تحقيقات الجزيئية المستخدمة في هذه المجلة لتحقيقات الحمض النووي الخضراء كما أو البرتقال على التوالي (على الرغم من أن هناك منتجات أخرى مماثلة مع الإثارة وانبعاث موجات التي لديها وسائط قابلة للمقارنة من التدبير العمومين، ونحن على وجه التحديد الرجوع إلى ذكر في المقدمة تحقيقات). البروتوكولات باستخدام المجسات الجزيئية تختلف بين الأنواع، واختلاف أساسي في التركيز وحضانة مرات. بعد هذا البروتوكول المبينة على M.aeruginosa وكان محسن الأخضر التحقيق الحمض النووي بتركيزات من 0.5 ميكرومتر بعد 30 دقيقة من الحضانة والتحقيق الحمض النووي البرتقال في 1 ميكرومتر بعد 10 دقيقة. في كل تحقيقات تركيزات أقل من المستوى الأمثل ذكرت أدى إلى تحت الإبلاغ عن الخلايا مع الضرر الغشاء. على العكس، 5 ميكرومتر تركيزات وأعلى في كل من التحقيقات أظهرت نوع من تلطيخ غير محددة، حيث الخلايا الحية 'أنتجت مضان المستهدفة، مما يؤدي إلى تمثيل أكثر من الأرقام "غير قابلة للحياة" الخلية. قدمت الضوابط الإيجابية (قتل الحرارة) الكتلة الحيوية الميتة قابلة للاختبار، على الرغم من ملاءمة الجيل السيطرة لا تزال تخضع للمناقشة. من خلال إظهار تسلسل منطقي من الخطوات لتحسين الأخضر والبرتقالي تحقيقات الحمض النووي دي نحنmonstrate كيفية إنشاء بروتوكول التي يمكن استخدامها لتحليل الحالة الفسيولوجية السيانوبكتيريا على نحو فعال.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلية هي نظام معقد، الذي يستجيب باستمرار على البيئة عن طريق تعديل المعلمات الفسيولوجية وتغيير وظيفتها. تتأثر ديناميات السكان السكان الميكروبية إسوي سواء في طبيعة والمختبر من خلال تطوير القطعان، والتي تحدث حتى في ظل الظروف البيئية ثابتة نسبيا 1-3. تباين المجتمعات الميكروبية الطبيعية ينشأ بسبب الطبيعة المتغيرة للغاية من الظروف البيئية. هذه العمليات العشوائية وأحيانا ما تنتج في وقت لاحق القطعان التي هي مختلفة جدا إلى متوسط ​​عدد السكان. وكشفت أدلة حديثة أن هذه القطعان الفسيولوجية تستجيب بشكل مختلف للظروف البيئية، ويمكن أن تنتج مركبات إشارة أو مثبطات التي تؤثر بشكل كبير والتأثير على 3،4 إجمالي عدد السكان.

إنشاء وسيلة لتحديد عدم التجانس بين السكان هو المفتاح لبرنامج الأمم المتحدةderstanding البيئة الميكروبات في بيئات مختلفة وضروري عند بناء المعرفة من البكتيريا الزرقاء إزعاج، مثل Microcystis السامة، مما يؤثر بشكل كبير على الأمن المائي البشري. الأنواع مثل أنابينا عرض التجانس الشكلي في استجابة لتقلبات البيئة، وتطوير خلايا متخصصة مثل heterocysts وakinetes 2. في المقابل، خلايا Microcystis لا تعرض التجانس الشكلي واضحا خلال الاستجابة للضغط النفسي. التمييز بين خلايا قابلة للحياة وغير قابلة للحياة هو الجانب الأكثر أهمية التمايز الفسيولوجية ويسمح فهم أفضل للديناميات السكانية الميكروبية. ومع ذلك، تبقى المشكلة المفاهيمية للبقاء البكتيرية نفسها صعبة وسيئة تتميز 1،5،6.

التدفق الخلوي (FCM) هي طريقة موثوقة وسريعة لتحليل الخلايا الفردية. لزيادة فهم طبيب خلية واحدةبليد الحركة من خلال FCM، وقد استخدمت تحقيقات الجزيئية للتمييز عدد من الأيض والعمليات الحيوية (7). وقد أدى ذلك إلى زيادة المعرفة الأنواع على المستوى الخلوي والسكان، وهذا بدوره ساعد في إدارة الموارد المائية 8،9. ومع ذلك، الكائنات الحية تختلف من حيث الجزيئي امتصاص التحقيق وهروب رأس المال بسبب المسام ومضخات في الجدران الخلوية والأغشية، والتي أدت إلى عدد من الجزيئية تصميم التحقيق وتنفيذ بروتوكول 6،10،11. وغالبا ما زودت الاختبارات الجزيئية المتاحة لأغراض تجارية والبحوث مع بروتوكول عام والتي يمكن أن تنطبق على نوع من الخلايا مختلفة جدا. يجب على المرء أن يكون حذرا جدا في نقل البروتوكولات وضعت لنوع خلية واحدة إلى 6 آخر، وبالتالي هو المهمة الأساسية لتحسين تحقيقات الجزيئية فعال قبل الاستخدام.

تحقيقات الحمض النووي الأخضر والبرتقالي ربط إلى كل من الأحماض النووية مزدوجة ومفردة الذين تقطعت بهم السبل مع الحد الأدنى من قاعدة حددتستخدم ivity وتقييم سلامة الغشاء البلازمي للخلايا. التحقيق الحمض النووي الأخضر يحتوي على طرأ تحسن ملحوظ على وضع العلامات الخلية إشارة مضان مقارنة تحقيقات الجزيئية الأخرى، مثل مركبات القائم على يوديد propidium 12، والتي يمكن أيضا بمثابة مؤشر على بقاء الخلية. مصطلح "بقاء الخلية" هنا يفترض أن تدهور الحمض النووي يحدث بعد فقدان النزاهة غشاء البلازما. تحقيقات الحمض النووي هي cyanine الأصباغ غير متماثل مع ثلاثة الشحنات الموجبة، ولا يمكن دخول الخلايا مع أغشية سالمة تحت تركيزات تتميز، في كل من حقيقيات النوى 11،13 و 14،15 بدائية النواة الكائنات الحية. يمكن ربط مسبار الحمض النووي للأحماض النووية يؤدي إلى ما يصل إلى> 500 أضعاف من انبعاثات مضان من الإشارات المحلية في الخلايا التي تحتوي سلامة غشاء للخطر. على الرغم من أن تحقيقات الجزيئية مثل الأخضر التحقيق الحمض النووي يمكن أن يكون مؤشرا جيدا لعلم وظائف الأعضاء خلية واحدة، هناك حاجة رس تحسين كل التحقيق مع كائن الهدف المقصود، كما اختلفت الأوقات الحضانة من 7 دقيقة - 30 دقيقة، وتركيز يتراوح من 0.1 ميكرومتر - 0.5 ميكرومتر في التجارب Microcystis وحده 15-19.

هنا نقدم بروتوكول لتعظيم المقايسات cytometric من اللون الأخضر والبرتقالي تحقيقات الحمض النووي جديدة نسبيا (والتي حتى الآن لم يتم اختباره على أنواع السيانوبكتيريا M.aeruginosa). ويمكن بعد ذلك نقل المنهجية المتقدمة التالية إلى الأنواع الأخرى، وتستخدم كمنصة لتحسين البروتوكولات في تحقيقات الجزيئية الأخرى، وبالتالي زيادة فهم الميكروبات والسلوك البيئي الخاصة بهم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد المسبار الجزيئي وقياس التدفق الخلوي

  1. تمييع الحلول الأسهم من تحقيقات الحمض النووي، والتي يتم توفيرها كحل 5 ملم في dimethylsulfoxide (DMSO) إلى aliquots من التركيزات المطلوبة في عالى النقاء H 2 O. تصفيتها
  2. تخزين تحقيقات الحمض النووي في الظروف المظلمة بين -5 درجة مئوية و- 25 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. بدوره على تدفق عداد الكريات وحزمة برامج تحميل (انظر جدول المواد / معدات لمواصفات FCM).
  4. وضع أنبوب انحلال الدم الخالي (12 × 75 ملم) على التحقيق حقن العينة (SIP)، انقر فوق تنشيط ثم تدفق مرة أخرى لبدء عملية التنظيف FCM.
    ملاحظة: يمكن لبعض المراحل عينة لSIP استيعاب عدة أنواع من الأنابيب بما في ذلك أنابيب microcentrifuge. والجزيئي مخفف التحقيق وغمد السائل المستخدمة في أجهزة FCM هو من الصف التحليلي "نوع 1" 0.22 ميكرومتر غشاء مصدر تصفيتها.
  5. مكانأنبوب انحلال الدم الطازج مع 2 مل من عالى النقاء تصفيتها H 2 O على SIP، تحدد سقفا زمنيا لمدة 10 - 15 دقيقة وسرعة الموائعية الصيام (أو معدل تدفق> 66 ميكرولتر / دقيقة).
  6. حدد خلية البيانات الجديدة، وطرح على عتبات ذات الصلة لمضان وقنوات مبعثر الخفيفة للحد من الضوضاء الخلفية، وانقر فوق "تشغيل".
  7. إذا كان مجموع الأحداث في الثانية ليست أقل من توصية الصانعين، ثم قم بتشغيل عينة 2 مل من محلول تطهير لمدة 2 دقيقة على السريع ثم كرر الخطوات 1.4 و 1.5.
    ملاحظة: يرجى مراجعة توصيات الصانعين لFCM بدء تنظيف البروتوكولات، كما أنها يمكن أن تختلف بين النماذج. اختبار للعتبات محددة يحتاج أيضا ليكون في خط مع النموذج FCM عن بعض المعدات التي تسمح للمستخدم لتطبيق الفولتية مكاسب للأنابيب مضخم (هذه الفرق) تعزيز أو تقليل إشارة كهربائية المسجلة من أجهزة الكشف الضوئية. نموذج FCM المستخدمة في هذا من experiمنة وحددت هذه الفرق الجهد واستخدام عتبة 80،000 الضوء المبعثر إلى الأمام (FSC-H) لاستبعاد جسيمات أصغر من 2.0 ميكرومتر والضوضاء الإلكترونية.

2. التحضير للثقافات وعدد الخلايا الأولية

  1. الأوتوكلاف 98 مل من عالى النقاء تصفيتها H 2 O و 2 مل من وسائل الإعلام الطحالب (تركيز X50) في كوب 250 مل لمدة 20 دقيقة في 120 درجة مئوية.
  2. من الأحادية الأولي من M.aeruginosa (PCC 7806) في ارتفاع مطرد الدولة مكان الكثافة 2 مل من العينة إلى أنبوب تحت SIP. تفصيل أي تشكيل مستعمرة من قبل vortexing أو صوتنة 20 و تأكيد خلايا فرقت بالتساوي من خلال المجهر الضوئي.
    ملاحظة: التعرض المفرط للموجات فوق الصوتية يمكن أن يؤدي إلى تحلل الخلايا ويجب استخدامها بحذر. منذ صوتنة يمكن أن ينهار الحويصلات الغاز (كما هو موجود في بعض الأنواع مثل M.aeruginosa) المخرجات مثل ضوء الجانب مبعثر (SSC-H) كثافة يمكن أن تصبح أكثر ذاتهاnsitive.
  3. في داخل البرنامج FCM، حدد مؤامرة الرسم البياني لتسجيل البيانات من الأمام ضوء مبعثر (FSC-H) وتكوين المواصفات مؤامرة بالنقر على "تسجيل" لعرض في نطاق سجل على المحور.
  4. في الناتج منفصل، حدد الرسم البياني آخر (تسجيل محور) لتسجيل مضان الطبيعية مثل الإكسسوارات فيكوسيانين الضوئي الصباغ (FL4-H، 675 ± 12.5 نانومتر)، وجدت في M.aeruginosa.
  5. استخدام مصدر الضوء الذي يمكن أن تثير فيكوسيانين وكاشف التي يمكن أن تصنف الانبعاثات من مضان الناتجة عن ذلك.
    ملاحظة: الضوئي الصباغ مثل الكلوروفيل يمكن أن يكون سعيدا مع يشيع استخدامها 488 نانومتر الليزر الأزرق، في حين فيكوسيانين هو متحمس أكثر من 600 نانومتر، وسوف يتم الكشف فقط مع مصدر الضوء الأحمر 21. تحقق مع الشركة المصنعة للأجهزة قياس التدفق الخلوي لمصادر الضوء الإثارة والأطياف للكشف عن الانبعاثات، هنا كل من 488 نانومتر و 640 نانومتر ليزر تم استخدامها جنبا إلى جنب معمن 675 ± 12.5 مرشح بصري نانومتر.
  6. لتسجيل أعلى دقة حدد الإعدادات الأقرب إلى حجم الأساسية للكائن الحي الهدف (10 ميكرون)، ومعدل التدفق البطيء نسبيا (14 ميكرولتر / دقيقة).
    يجب تشغيل للحصول على أفضل العينات وفقا لقرار بتصنيع توصية من الأحداث في الثانية: ملاحظة.
  7. قبل صدور بيانات اكتساب تستخدم عتبة إلى بوابة الخروج ضوء مبعثر و / أو إشارات مضان التي تنتج عن ضجيج الخلفية الإلكتروني أو الحطام عينة الخلية.
  8. حدد خلية بيانات جديدة، وخلق مؤامرة الكثافة مع FSC-H وSSC-H المعلمات على نطاق وسجل ثم انقر فوق تشغيل.
  9. إذا كثافة العينة يؤدي إلى معدل الحدث المفرط، يمكن اتخاذ خطوات تخفيف لزيادة الدقة والإحكام.
  10. على مؤامرة كثافة تطبيق البوابات البرنامج من الرسم البياني السابق لاستبعاد انخفاض مستوى الإشارات مبعثر، التي تنتجها الضوضاء في الخلفية أو الحطام (FSC <320،000). وعلى العكس من بوابة مضان النسبي العاليوتشمل إشارات فيكوسيانين من الخلايا وفقط هذه الأحداث (FL4، 56000 - 1950000).
  11. استخدام عدد الخلايا المسجلة في المناطق المعزولة ونقسمه على الحجم الكلي للعينة التي مرت من خلال FCM، للعمل على كيفية العديد من الخلايا لكل مل.
    ملاحظة: النموذج FCM المستخدمة هنا ديها المعالجات الدقيقة التي تسيطر عليها نظام مضخة تحوي يسمح حجم العينة يحدد لاحقا. قد تتطلب معدات أخرى FCM تعليق حبة معايرة أو حساب H 2 O الخلافات الوزن / الحجم للتحقق من إجمالي حجم العينة.
  12. إضافة حجم المطلوب من الخلايا إلى وسائل الإعلام طازجة من أجل البدء في دورة نمو دفعة (250،000 خلية / مل) من M.aeruginosa.
    ملاحظة: سوف الأنواع تختلف في معدلات النمو اعتمادا على من المعلمات بيئة في الموقع وتوافر المواد الغذائية، لذلك دورة دفعة وينبغي قبل تسجيله لتحديد مراحل دورة الحياة.

3. OPTIMسعودة الجزيئية التحقيق امتصاص الخلية

  1. حصاد نصف ثقافة M.aeruginosa أعدت في الخطوة 2 من المرحلة الأسية واستخدام كعنصر تحكم 'الحية'.
    ملاحظة: عينات المخفف من ثقافة عالية الكثافة مباشرة إلى مرحلة الأسي قد تؤثر على النتائج الأمثل من خلال دوران خلية ميتة، مقارنة بما كان عليه من الثقافات تلقيح من مرحلة متخلفة / الاستقراء الأولي.
  2. إعداد النصف الآخر كوسيلة لمراقبة 'الميت' باستخدام أساليب مثل الايثانول 70٪، وعينات التدفئة في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، لامتصاص العرق أو 4٪ الفورمالديهايد لمدة 30 دقيقة 6،11،22. تحقق اختلافات في عينات المكروية (على سبيل المثال، ودرجة الحموضة).
    ملاحظة:، قتلت الحرارة، 'الميت' مراقبة إيجابية في M.aeruginosa هي متميزة من عينة 'الحية' من خلال انخفاضه في إشارات فيكوسيانين. حمل فيات بواسطة طرق أخرى قد لا يؤدي إلى نفس المخرج، وسوف VARذ في الأنواع.
  3. إعداد عينات مختلطة استخدام نسب مختلفة من 'يعيش' وعينات 'الميت' (على سبيل المثال، 0٪، 25٪، 50٪، 100٪).
  4. تفصيل تشكيل مستعمرة من قبل vortexing أو صوتنة وتحقق من الرقم الهيدروجيني.
  5. حدد ليزر 488 نانومتر إلى جانب الكشف عن التي يمكن أن تسجل مضان من الأخضر (FL1، 530 ± 15 نانومتر) والبرتقالي (FL2، 585 ± 20 نانومتر) تحقيقات الحمض النووي والليزر 640 نانومتر لتسجيل إشارات فيكوسيانين من خلال كشف الخاصة به.
    ملاحظة: عندما يرتبط الحمض النووي، والأخضر التحقيق الحمض النووي لديه تقريبي الطول الموجي مضان الإثارة من 504 نانومتر، والحدود القصوى للانبعاثات من 523 نانومتر، في حين أن البرتقال التحقيق الحمض النووي له طول موجة الإثارة من 547 نانومتر، والانبعاثات قصوى تبلغ 570 نانومتر. ويمكن استخدام 488 نانومتر الأرجون ليزر الحالة الصلبة ايون لإثارة كلا تحقيقات الجزيئية، ومع ذلك، فإن الليزر الأخضر (إلى 547 نانومتر) تنتج مضان البرتقال العالي.
  6. كنقطة انطلاق، ويعرضالمسبار الجزيئي مع الشركات المصنعة وأوصى التركيز على الثقافة 'الميت' 50٪ 'حية' و 50٪ واحتضان في الظلام.
  7. حدد خلية البيانات الجديدة، ضع العينة تحت SIP مع العتبات ومشغلات من شأنها أن تقلل من الضوضاء في الخلفية (FSC-H 80000).
  8. خلق مؤامرة الكثافة مع FSC-H وSSC-H المعلمات، وثلاثة رسوم بيانية. واحد الرسم البياني باستخدام المسبار الجزيئي قناة كشف بصري منها (FL1 أو 2)، واحدة للكشف عن انبعاث فيكوسيانين (FL4-H) وغيرها من FSC-H، كل على نطاق السجل.
  9. احتضان عينات من M.aeruginosa مع تحقيقات الحمض النووي في الظلام لمدة تصل إلى 60 دقيقة، تسجيل في الخلايا بيانات منفصلة، ​​في عدد من النقاط الزمنية (1، 5، 10، 15، 30 و 60 دقيقة).
    ملاحظة: عند ضبط المعلمات مثل الاختيار درجة الحموضة مع المصنوعات لردود الفعل المحتملة من بعض المواد الكيميائية (للحمض النووي اختبار تحقيقات لا يمكن أن تحتوي منطقة عازلة الفوسفات أو مستويات عالية من التكافؤ أو مغنيةالكاتيونات قدم، كما سيتم تخفيض الربط مع DNA).
  10. تطبيق بوابة البرامج لتشمل فقط FSC-H الرسم البياني (320،000 - 1،500،000) للهدف من الكائنات حجم الخلية، في كل منها التحقيق مضان قناة الرسم البياني.
    ملاحظة: التركيزات المستخدمة في هذا البروتوكول كانت 0.05، 0.1، 0.5، 1، 5، 10، 50 و 100 ميكرومتر، والتي يمكن أن تتغير من زيادة أو تقليل حجم العينة M.aeruginosa أو محلول المخزون الأولي للتحقيقات النووية.
  11. في القناة التحقيق مضان، وتطبيق بوابة أخرى برنامج شامل لأعلى قمة في الرسم البياني (الأخضر FL1-H، 240،000 - 1،650،000 والبرتقالي FL2-H، 30000 - 165000)، وبعد ذلك البوابة التي مسبار إيجابي مضان في المؤامرة الكثافة.
  12. تشغيل الخطوات 3،1-3،11 مع 100٪ "الحية"، و 100٪ 'الميت' وجميع العينات ثقافة مختلطة، وتعديل تركيزات التحقيق الجزيئية (مثل X 0.1 إلى x 10) و / أو درجة الحرارة ومستويات الحموضة إذا لزم الأمر.
    13. <لى> قارن بين عدد من الإشارات الإيجابية الجزيئي التحقيق مضان لكثافة الخلايا الأصلية من الخلايا الميتة (مأخوذة من نصف مجموع FSC-H أو 100٪ ثقافة 'الميت') للعثور على النسبة الإجمالية للخلايا ملطخة الحمض النووي تحقيقات.
  13. هل كل هذا لفترة زمنية في كل تركيز للعثور على بروتوكول الأمثل لتحقيق أعلى نسبة من نوكليك خلية التحقيق امتصاص دون إنتاج تلطيخ غير محدد (استخدام الوسائل في اتجاه واحد أنوفا أو كروسكال واليس تحليل التباين الأحادي، إذا كانت البيانات غير حدودي).

4. الجزيئية التحقيق الإسفار التمييز

  1. لاختبار تدخل مضان / التداخل من جوهري أو غير محددة تلطيخ الخلايا حدد 50٪ 'حية' و 50٪ 'الميت' بيانات ثقافة مختلطة وخلع جميع البوابات.
  2. تطبيق بوابة البرامج لتشمل فقط FSC-H الرسم البياني (320،000 - 1،500،000) للهدف من الكائنات حجم الخلية، في فيكوسيانينقناة الرسم البياني.
  3. بوابة أعلى قمة فيكوسيانين والتسمية باسم 'يعيش'، مع إضافة أدنى الذروة وصفت بانها "القتلى".
  4. أداء خطوة بوابة أخرى في الجزيئية التحقيق مضان قناة الرسم البياني منها، وذلك باستخدام واحد في وقت واحد، و'يعيش' ثم فيكوسيانين 'الميت' (FL4) إشارات، وتسجيل كل من الأطوال الموجية المتوسطة.
    وقد تم وضع لإحداث وفيات في هذه التجربة من خلال المعالجة الحرارية، والتي بموجب هذا البروتوكول يقلل بشكل واضح إشارات فيكوسيانين: ملاحظة. طرق أخرى للسكان المنتجة من الخلايا الميتة قد تنتج مخرجات مختلفة في أشواط المكتسبة.
  5. نسبة موجات متوسط ​​الإيجابية في مضان الجزيئية التحقيق ('ميت') والجوهرية / إشارة غير محددة ('الحية') لتحديد حساسية البروتوكول.
    ملاحظة: تحسين التمييز مضان من "حي" وبوبول 'الميت'بالجمع، وزيادة مصدر الكربون لامتصاص وصمة عار نشط في المغذيات المنضب الخلايا أو ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) لتحسين نفاذية جدار الخلية وما ينتج عنها من إشارات مضان 6. تعويض محدود في بعض النماذج FCM عن التداخل الطيفي يمكن أن يؤديها تصحيح البشرى الذي يتلاعب به المستخدم أثناء اكتساب عينة (التغييرات PMT الجهد) أو من البرمجيات المتخصصة بعد التحليلي.
  6. حدد البروتوكول الأمثل حيث تم ملطخة أكبر قدر من الخلايا الميتة دون وقوع غير محددة تلطيخ. إذا كان عدد من اختبار لها نتائج مماثلة تقبل بروتوكول مع أقل تركيز والحضانة الوقت، جنبا إلى جنب مع حسن التمييز إشارة مضان. متابعة بتصنيع تعليمات لإجراء اغلاق الكريات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الضوء المبعثر إلى الأمام (FSC) وضوء الجانب مبعثر (SSC) المخرجات من ثقافة دفعة M.aeruginosa في المرحلة الأسي يقدم معلومات عن حجم الخلية (قطر) وتحبب الداخلية على التوالي (الشكل 1A). FSC يمكن أن تميز الخلايا التي تكون كبيرة جدا و / أو صغيرة أن تكون M.aeruginosa. ويمكن أن يتم هذا التمييز أو النابضة ببيانات تكرير بين نقاط معينة من الانتاج FSC (الشكل 1C). فيكوسيانين، دستور كبيرا من M.aeruginosa...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأعداد المتزايدة من المنشورات باستخدام المجسات الجزيئية تشير إلى أن بيانات موثوق بها وغنية بالمعلومات ويمكن الحصول على 5،6،8 - 15،19،22،23. اعتبارا من بعد ليس هناك وصمة عار مثالية لبقاء الخلية التي يمكن أن تكون فعالة في جميع الأنواع مع نفس التركيز وحضانة الساعة 6،10. حتى نفس النوع من التحقيق مع انبعاثات مضان المعدلة يظهر الحاجة إلى إنشاء التركيز وحضانة الصحيح الوقت (الجدولين 1 و 3). كما رأينا عند استخدام هذا البروتوكول،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أن نعترف طالب دكتوراه ديف هارتنل وجامعة بورنموث للحصول على الدعم والتمويل للبحوث والمرافق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
البكتيريا الزرقاء وسائل الإعلامسيجما-ألدريتشC3061-500MLBG-11 محلول مركز للمياه العذبة (تخفيف x50)
سائل إزالة التلوثBD Biosciences653155تشغيل لمدة دقيقتين عندما تكون المخرجات أكثر من 12 حدثا في الثانية بسرعة أو معدل تدفق 66 وميكرو ؛ لتر / دقيقة  تليها دقيقتان من غمد H2< / sub>O.
مقياس التدفقBD Biosciencesحسب الطلبBD Accuri C6
SYTOX GreenLife TechnologiesS7020صبغة الحمض النووي &ndash ؛ محلول 5 ملي مولار في DMSO
SYTOX OrangeLife TechnologiesS11368صبغة الحمض النووي &ndash ؛ محلول 5 ملي مولار في DMSO
الخلوي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues. Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).
  2. Adams, D. G., Duggan, P. S. Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria. New Phytol. 144 (1), 3-33 (1999).
  3. Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior. Nat. Chem. Biol. 6 (10), 705-712 (2010).
  4. Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures. Environ. Microbiol. 8 (1), 30-36 (2006).
  5. Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry. Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).
  6. Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Appl. Environ. Microb. 77 (16), 5571-5576 (2011).
  7. Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. Practical Flow Cytometry. , 273-410 (2003).
  8. Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes. Water Res. 42 (1-2), 269-277 (2008).
  9. Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology. Trends Biotechnol. 28 (8), 416-424 (2010).
  10. Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria. Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).
  11. Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton. J. Phycol. 47 (3), 692-702 (2011).
  12. Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain. Appl. Environ. Microbiol. 63 (6), (1997).
  13. Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana. Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57 (1), 305-317 (2012).
  14. Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment. Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2697-2700 (1998).
  15. Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria. Eur. J. Phycol. 47 (July), 195-206 (2012).
  16. Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain. Hydrobiologia. 517 (1-3), 107-120 (2004).
  17. Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis. Environ. toxicol. 19 (1), 20-25 (2004).
  18. Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations. Harmful Algae. 8 (6), 857-863 (2009).
  19. Bouchard, J. N., Purdie, D. A. Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis. J. Phycol. 47 (6), 1316-1325 (2011).
  20. Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. Enumeration of Natural Microcystis Populations. Br. Phycol. J. 13 (3), 269-277 (1978).
  21. Marie, D., Simon, N., Vaulot, D. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. Algal culturing techniques. Andersen, R. A. , Academic press. 253-268 (2005).
  22. Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae. Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).
  23. Davey, H. M., Kell, D. B. Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses. Microbiol. rev. 60 (4), 641-696 (1996).
  24. Franklin, D. J. Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division? J. Plankton Res. 36 (1), 11-17 (2013).
  25. Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting. Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1311-1316 (1996).
  26. Waggoner, A. Fluorescent probes for cytometry. Flow cytometry and sorting. Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. , 2nd, Wiley-Liss Inc. New York. 209-225 (1990).
  27. Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. "Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68 (2), 187-206 (2004).
  28. Keer, J. T., Birch, L. Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability. J. Microbiol. Methods. 53 (2), 175-183 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Molecular ProbesSYTOX GreenSYTOX OrangeNucleic Acid ProbesFluorescence DetectionCyanobacterial Physiology

مقالات ذات صلة