يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

المنهج الوراثي إلى الأمام للكشف عن الإجهاد الجينات المقاومة في الفئران - شاشة عالية الإنتاجية في خلايا ES

7.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53062

⸱

نوفمبر 11, 2015

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Colorado Denver

في هذه المقالة

ملخص

مقاومة الإجهاد هي واحدة من السمات المميزة لطول العمر وكما هو معروف أن تحكم وراثيا. هنا، قمنا بتطوير أسلوب الإنتاجية العالية متحيز للكشف عن الطفرات التي تمنح مقاومة الإجهاد في خلايا ES التي لتطوير نماذج الماوس للدراسات طول العمر.

الملخص

الشاشات الجينية التي تعتمد على النمط الظاهري في الفئران هي تقنية قوية للكشف عن وظائف الجينات ، ولكنها غالبا ما تعيقها التكاليف الباهظة للغاية ، مما يحد بشدة من إمكاناتها. نصف هنا استخدام الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (ES) كخلايا بديلة للكشف عن نمط ظاهري ذي أهمية ثم إدخال هذه الخلايا في جنين مضيف لتتطور إلى فأر حي يحمل النمط الظاهري. توفر هذه الطريقة (1) منصة فعالة من حيث التكلفة وعالية الإنتاجية للفحص الجيني في خلايا الثدييات ؛ (2) طريقة سريعة لتحديد الجينات المتحولة والتحقق من السببية ؛ و (3) اختصار لتطوير طفرات الفئران مباشرة من خلايا ES المختارة هذه للدراسات الحيوانية الكاملة. لقد أظهرنا استخدام الباراكوات (PQ) لاختيار الطفرات المقاومة وتحديد الطفرات التي تمنح مقاومة الإجهاد التأكسدي. يمكن أيضا استخدام الضغوطات الأخرى أو المركبات السامة للخلايا للكشف عن الطفرات المقاومة للكشف عن محددات وراثية جديدة لمجموعة متنوعة من مقاومة الإجهاد الخلوي.

المقدمة

طول العمر له علاقة حميمة مع مقاومة الإجهاد. بشكل عام، والأنواع المعمرة في كثير من الأحيان تبرهن زيادة مقاومة تجاه الضغوطات متعددة، مثل بيروكسيد الهيدروجين، الباراكوات (PQ) والأشعة فوق البنفسجية والحرارة والمعادن الثقيلة 1،2. في المقابل، زيادة الحساسية للإجهاد تميل إلى التنبؤ تقصير العمر الافتراضي و / أو عرضة للأمراض النمط الظاهري أكثر من ذلك. منذ فترة طويلة وتكهن مسح مسار مضادة للأكسدة للعب دورا رئيسيا في منح مقاومة الإجهاد للحيوان. ومع ذلك، مع استثناءات قليلة، دراسات من مجموعة متنوعة من الحيوانات المعدلة وراثيا مع التلاعب في مختلف الانزيمات المضادة للأكسدة (على سبيل المثال، SOD) تشير إلى أن زيادة مستوى أكسدة الانزيمات الكسح لا يزيد عمر أو فترة الصحية 3. وتشير هذه البيانات إلى أن مقاومة الإجهاد سمة احظ باستمرار في الحيوانات طويلة العمر بوساطة مسارات الخلوية الأخرى لم يتم الكشف عنها.

وقد اتخذنا الأمام متحيزنهج الجيني لتحديد الجينات التي عليها تحور، يمكن أن يضفي على النمط الظاهري المقاومة التوتر في الجذعية الجنينية مثقف (ES) الخلايا. خلايا ES تقدم اثنين من المزايا الرئيسية في هذه الدراسة: (1) هي التلاعب الجيني متطورة المتاحة لتعديل جينوم خلايا ES. و (2) أي خلايا ES مقاومة الإجهاد تعافى من الشاشة يمكن استخدامها مباشرة لإنتاج الماوس، مما يسمح للترجمة السريعة في الدراسات الحيوانية كلها لقياس مدى الحياة، ومدى صحة.

في هذا التقرير، وصفنا استخدام خط الخلية C9 ES، التي كانت الأليلات بلم تحت سيطرة عنصر استجابة التتراسيكلين. علاج الدوكسيسيكلين (دوكس) تحول عابر من التعبير عن بلم مما يؤدي إلى زيادة حادث تبادل chromatid الشقيقة. هذا على المدى القصير بلم خروج المغلوب يسمح لتوليد طفرات متماثل بين السكان متغايرة بحيث يمكن أن يتم القبض الطفرات المتنحية لمقاومة الإجهاد في عملية الفرز. نحنكما وصفت استخدام piggyBac (PB) ينقول كما المغير لادخال عشوائيا بولي-A فخ كاسيت (PB-UPA) على التحور الجينات في الجينوم. أصبحت الخلايا مع اختلال الجينات التي بولي-A فخ G418 مقاومة ويمكن استردادها بحيث يمكن تقديم مجموعة من الجينات فخ المسوخ (مكتبة الجينات شرك)، وفحص في وقت لاحق لاستنساخ متحولة التي كانت مقاومة الإجهاد.

يمكن وصف استنساخ مقاومة الإجهاد تعافى من الاختيار بدلا بسرعة عن طريق التقنيات الجزيئية في الشأن عدد من الملاحق (QPCR)، موقع الإدراج (splinkerette PCR)، وهوية الجينات تعطلت (انفجار)، ومستوى التعبير ( RT-QPCR). يمكن remobilized الإدراج PB التي كتبها التعبير عابر MPB transposase في استنساخ لاستعادة تسلسل الحمض النووي من النوع البري، وبالتالي اختبار لفقدان مقاومة الإجهاد. هذه هي وسائل قوية لتأكيد العلاقة السببية من الطفرة التي ينبغي القيام به قبلإلى إنتاج الماوس مكلفة. وأظهرت دراسات سابقة أن الخلايا تتعرض لضغوطات فقدت 4،5 تعدد القدرات الخاصة بهم. وهكذا، في هذا البروتوكول، والحفاظ على نسخة طبق الأصل مجموعة من خلايا متحولة، والتي لن يتم التعامل مع الضغوطات أمر بالغ الأهمية لإنتاج الماوس ناجحة.

لدينا مختبر تمت هندستها خط الخلية C9 ES وناقلات PB-UPA، وكلاهما متاح للمحققين آخرين بناء على طلبها. سوف بروتوكول ذكرت هنا يبدأ من جيل دي نوفو مكتبة خلايا المحاصرين الجينات ES مع PB-UPA (الشكل 1A)، تليها الطلاء الاصل واختيار الضغط لعزل الحيوانات المستنسخة مقاومة الإجهاد (الشكل 1B). أثبتنا التحديد مع الباراكوات، مولد الجذور الحرة قوية داخل الخلايا. عمليا، أي مجمع السامة للخلايا أو السم، على سبيل المثال، الضغوطات ER (على سبيل المثال، thapsigargin وtunicamycin)، أكسدة الخلايا العصبية (على سبيل المثال، MPP +، الدوبامين 6-هيدروكسي، وروتينون)، والحرارة، والثقيلةالمعادن (مثل الكادميوم، جنوب شرق)، ويمكن أن تتكيف مع أسلوب لتحديد لطفرات مقاومة منها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. المحاصرين جين ES خلية البناء المكتبة عن طريق piggyBac ينقول

  1. إعداد الماوس الأساسي الليفية الجنينية (PMEF) كما مغذيات لزراعة الخلايا ES
    1. ذوبان الجليد قارورة واحدة من ميتوميسين المعطل C PMEF (5.0 × 10 6) في حمام مائي 37 ° C. نقل الخلايا إلى 5 مل من المتوسط ​​الخلايا ES (DMEM تحتوي على 15٪ FBS، 1000 وحدة / مل من العوامل المثبطة اللوكيميا، و 100 ميكرومتر الأحماض الأمينية غير الأساسية، 2 ملي الجلوتامين، 55 ميكرومتر 2-المركابتويثانول، و 25 وحدة / البنسلين مل / الستربتومايسين )، وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
    2. نضح في وطاف resuspend الخلايا في 30 مل من المتوسط ​​الخلايا ES تليها توزيع إلى قسمين قوارير T25 (5 مل لكل منهما) واثنين من لوحات 100 ملم (10 مل لكل منهما). احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.
  2. الثقافة وتوسيع الخلايا C9 ES
    1. ذوبان الجليد قارورة واحدة من الخلايا C9 ES (2.5 × 10 6 الخلايا في 0.5 مل) في 37 ° C حمام الماء ونقلالخلايا في 5 مل من ES المتوسطة الخلية. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
    2. نضح طاف و resuspend الخلايا ES في 5 مل من ES المتوسطة الخلية يليه الطلاء في قارورة T25 المغذية. احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. استبدال ES المتوسطة الخلية يوميا.
    3. 2 بعد أيام من الثقافة، وينبغي أن تصبح خلايا ES ~ 80٪ متموجة، وعلى استعداد تام للpassaged. غسل الخلايا مع 5 مل من PBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+) ثم قم بإضافة 2.5 مل قبل تحسنت 0.25٪ التربسين-EDTA. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. إضافة 2.5 مل المتوسطة الخلايا ES لوقف التربسين. ماصة صعودا وهبوطا 15 مرات لتفتيت كتل الخلايا. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
    4. نضح خلايا وطاف resuspend في 4 مل من ES المتوسطة الخلية. نقل 1 مل من الخلايا لكل 100 ملم لوحة تحتوي على 9 مل ES المتوسطة الخلية؛ إعداد اثنين من 100 ملم لوحات. هذا هو 1: 8 المرور. تغذية الخلايا يوميا مع 10 مل ES المتوسطة الخلية.
  3. إعداد 96-جيدا لوحات المغذية للمكتبة
    1. كما هو موضح في 1.1.1، ذوبان الجليد ثلاث قوارير من ميتوميسين-C المعطل PMEF (تحتوي كل منها على 5 × 10 6 خلايا) وResuspend الخلايا من كل قارورة مع 33.3 مل ES المتوسطة الخلية. الجمع بين الخلايا لانتاج خلايا تعليق 100 مل.
    2. لوحة 100 خلية ميكرولتر لكل بئر على عشر لوحات 96-جيدا. وينبغي إعداد هذه اللوحات المغذية 96-جيدا يوم واحد على الأقل قبل بنقل العدوى إلى خلايا ES C9 ​​مع PB ينقول.
  4. Electroporation للخلايا ES C9 مع ناقلات PB-UPA
    1. يعرض للتريبسين وعدد الخلايا C9 ES موسعة باستخدام عداد الخلية الآلي. يغسل كل 100 ملم لوحة من الخلايا C9 ES مع 10 مل PBS. إضافة 8 مل قبل تحسنت 0.25٪ التربسين-EDTA واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    2. وقف التربسين بإضافة 2 مل ES المتوسطة الخلية. نقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل وماصة صعودا وهبوطا 15 مرات لتحطيم كتل الخلايا. أجهزة الطرد المركزي على الفور في 100 x ج لمدة 5 دقائق تليها الشفط طاف.
    3. الخلايا و resuspendالصورة في 10 المتوسطة خلية مل ES وعد خلايا ES باستخدام عدادة الكريات. إعداد ستة أنابيب 15 مل من تعليق خلية تحتوي كل منها على 5 × 10 6 خلايا ES. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق. نضح في وطاف resuspend كل بيليه خلية في 0.8 مل PBS.
    4. إعداد ستة cuvettes Electroporation لل(4 ملم الفجوة) التي يتم نقلها من 0.8 مل الخلايا. إلى كل كفيت، إضافة 1 ميكروغرام PB-UPA و 20 ميكروغرام MPB transposase (mPBase)؛ المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا. وضع cuvettes على الجليد. أداء Electroporation للمع electroporator باستخدام الإعداد المتسارع في 250 V، 500 μF، واللانهاية أوم.
      ملاحظة: عادة، ثابت الساعة حوالي 10 إلى 12 ميللي ثانية لElectroporation للنجاح، والتي تسفر عن 1500 إلى 2000 G418 transformants مقاومة في 5 × 10 6 خلايا.
    5. استرجاع وتجميع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إلى قارورة تحتوي على 98 مل T75 ES المتوسطة الخلية. مزج خلايا طيف من قبل pipetting ثم نقل الخلايا إلى خزان (50 مل). لناجي ماصة 12 قناة، ونقل 100 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر إلى 96 جيدا قبل إعداد لوحات التغذية (10 في المجموع). احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
    6. بعد 24 ساعة، تغذية الخلايا يوميا مع الطازجة ES المتوسطة الخلية التي تحتوي G418 (150 ميكروغرام / مل) لتحديد لاستنساخ الجينات المحاصرين.
      ملاحظة: عادة كل بئر وتحتوي على حوالي عشرة G418 المستعمرات مقاومة. عندما تنمو هذه المستعمرات إلى حجم كاف (عادة 5-7 أيام)، وسوف يتم نسخ لوحات 96-جيدا (المكتبة) إلى 2 مجموعات لتخزين والاختيار، على التوالي. يتم تعيين كل لوحة في المكتبة باسم 'شبه مكتبة، حتى في هذه الحالة، هناك 10 المكتبات الفرعية.

2. مكتبة النسخ المتماثل

  1. تكرار لوحات ماستر
    1. 24-48 ساعة قبل المستعمرات مقاومة G418 الوصول إلى 50-60٪ confluency، ذوبان الجليد ثلاث قوارير آخر من ميتوميسين المعطل C PMEF على عشر لوحات 96-كذلك مغذيات (راجع القسم 1.3). الجيلاتينإيزي عشر لوحات 96-جيدا التي يحتضنها 0.1٪ الجيلاتين (100 ميكرولتر / جيد) عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 15 - 30 دقيقة. O / N الحضانة مقبولة.
    2. إعداد تعليق خلية واحدة في لوحات 96-جيدا من قبل trypsinization. نضح المتوسطة من لوحات 96-جيدا ويغسل مرة واحدة مع حجم مساو من برنامج تلفزيوني (بدون الكالسيوم 2+، والمغنيسيوم 2+). إضافة 50 ميكرولتر من قبل تحسنت 0.25٪ التربسين-EDTA، في احتضان 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ لمدة 10 دقيقة. وقف التربسين مع 50 ميكرولتر من ES المتوسطة الخلية. تحطيم كتل الخلايا بواسطة pipetting صعودا وهبوطا 15 مرات مع ماصة الأقنية.
    3. نقل 50 ميكرولتر من تعليق خلية trypsinized إلى الصف المقابل للوحة التغذية (ماجستير) تحتوي بالفعل 150 ميكرولتر ES المتوسطة الخلية و50 ميكرولتر المتبقية إلى الصف المقابل للوحة مهيلم (طبق الأصل) التي تحتوي بالفعل 150 ميكرولتر ES المتوسطة الخلية. معالجة كل صف من الخلايا إلى لوحة الماجستير ومتماثلة. احتضان لوحات (التي تحتوي الآن على 200 ميكرولتر جحجم ulture) عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 O / N.
      ملاحظة: هناك الآن عشرين لوحات 96-جيدا.
    4. في اليوم التالي تغذية الخلايا مع 100 ميكرولتر الطازجة المتوسطة الخلايا ES تحتوي على 150 ميكروغرام / مل G418. استبدال المتوسطة يوميا حتى الآبار هي 80-90٪ متموجة.
  2. تجميد لوحات ماستر
    1. عندما لوحات رئيسية هي حوالي 80٪ متموجة، يعرض للتريبسين الخلايا كما هو موضح (يرجى الرجوع إلى القسم 2.1.2).
    2. إزالة لوحات ووقف رد الفعل التربسين مع 50 ميكرولتر من 2X تجميد المتوسطة (60٪ المتوسطة الخلايا ES، 20٪ FBS، 20٪ DMSO). ماصة صعودا وهبوطا 10 مرات مع ماصة الأقنية لضمان خلط الصحيح للتجميد المتوسطة.
    3. وضع لوحات 96-جيدا في مربع الستايروفوم مغلقة بإحكام ووضعه في الفريزر -80 درجة مئوية لتخزين ما يصل إلى أربعة أشهر. سوف أربعة أشهر إتاحة الوقت الكافي لإتمام اختيار الإجهاد وتحديد أي الآبار من لوحة ماستر تحتوي على الحيوانات المستنسخة من الفائدة.
      ملاحظة: التخزين في -80 & #176؛ وC أطول من 4 أشهر يؤدي إلى انخفاض بقاء الخلية. يمكن للمرء أن استخدام أنابيب البرد في شكل 96-جيدا التي يمكن تخزينها في مرحلة البخار من النيتروجين السائل لفترة طويلة من التخزين.
  3. إعداد لوحات DNA وأحواض فرعية المكتبة من لوحات طبق الأصل
    1. 24-48 ساعة قبل تكرار كذلك على لوحات DNA وأحواض فرعية المكتبة، وإعداد عشرة 100 ملم لوحات مع ميتوميسين المعطل C PMEF لتجمع شبه مكتبة، وعشرة مهيلم لوحات 96-جيدا لوحة DNA متماثلة. الرجوع إلى القسم 1.3 لإجراء عام.
    2. يعرض للتريبسين الخلايا في لوحات 96-جيدا الاصل (راجع القسم 2.1.2). خلال الخطوة trypsinization 10 دقيقة، نضح الجيلاتين من لوحات DNA واستبدالها مع 150 ميكرولتر ES المتوسطة الخلية التي تحتوي G418 (150 ميكروغرام / مل). أيضا، إعداد خزان يحتوي على 5 مل من ES المتوسطة الخلية لتجميع و"مكتبات فرعية 'إلى 100 ملم لوحة المغذية.
    3. وبعد trypsinization، والتوقف عن محاولةpsin مع 50 ميكرولتر من الخلايا ES المتوسط ​​صف واحد في وقت واحد باستخدام ماصة 12 قناة. ماصة صعودا وهبوطا 10 مرات لتحطيم كتل الخلايا.
    4. نقل 50 ميكرولتر من تعليق خلية إلى الصف المقابل للوحة DNA ونقل 50 ميكرولتر المتبقية إلى الخزان تحتوي على 5 مل ES المتوسطة الخلية. بعد الانتهاء من واحد كامل لوحة 96-جيدا، ونضح وسيلة لوحة المغذية 100 ملم التي يتم نقل الخلايا المجمعة. تصنف هذه الخلايا mutagenized المجمعة ك "مكتبة فرعية.
    5. كرر لتسع لوحات 96-جيدا المتبقية. تغذية لوحات DNA 96-جيدا ولوحات 100 ملم المجمعة الفرعي للمكتبة "يوميا مع ES المتوسطة الخلية التي تحتوي G418 (150 ميكروغرام / مل).
      ملاحظة: هناك الآن عشر لوحات 96-جيدا "DNA"، وعشرة 100 ملم لوحات 'شبه المكتبة.
  4. تجميد لوحات DNA. عندما الخلايا في لوحة DNA هي 80-90٪ متموجة، نضح المتوسطة، وغسل الخلايا مرتين مع 100ميكرولتر PBS وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة الحمض النووي الجيني لاحق العزلة 6. وسيتم عرض هذه اللوحات DNA بواسطة PCR لتحديد أي المقابلة بشكل جيد في لوحة 'ماستر' يحتوي على نسخة من الفائدة.

3. الناجم عن دوكسي المسوخ متماثل

  1. تجميد حمامات شبه مكتبة والخلايا مرور لتلقي العلاج الدوكسيسيكلين
    1. 24 ساعة قبل 100 ملم لوحات 'شبه مكتبة "وجود مستعمرات كبيرة بما فيه الكفاية لتحقق 70-80٪ confluency، وإعداد مجموعة من عشرة مهيلم لوحات 100 ملم لتلقي العلاج الدوكسيسيكلين.
    2. إعداد تعليق خلية واحدة من كل مكتبة فرعية (يرجى الرجوع إلى أقسام 1.4.1 و1.4.2 للحصول على التفاصيل). نقل 5 × 10 6 الخلايا إلى مهيلم 100 ملم لوحة مع الدوكسيسيكلين (1 ميكروغرام / مل)؛ احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. تجميد غير الدوكسيسيكلين المعالجة حمامات الفرعية المكتبة المتبقية في 5 × 10 6 خلايا في قارورة.
  2. خلايا مرور في وجودمن الدوكسيسيكلين لضرب بلم
    1. مرور المكتبات الفرعية في 1: 8 كل 2-3 أيام بحضور الدوكسيسيكلين (1 ميكروغرام / مل) لمدة تصل إلى أسبوعين، وهي الفترة التي دوكس التي يسببها خروج المغلوب من بلم شأنها أن تعزز فقدان تغاير في الخلية السكان، مما يسمح لجيل من المسوخ متماثل.

4. التأكيد على اختيار وعزل النسخ مقاومة

  1. الخلايا المعالجة الدوكسيسيكلين تخضع لاختيار الإجهاد
    1. 24 ساعة قبل الركض الدوكسيسيكلين الخلايا المعالجة لاختيار الإجهاد، وإعداد عشرة مهيلم لوحات 150 ملم، مكان في 37 ° C، 5٪ CO 2 حاضنة مرطب.
    2. إعداد تعليق خلية واحدة من كل مكتبة الفرعية التي trypsinization (راجع القسم 1.4.1 و 1.4.2 للحصول على التفاصيل). البذور 6.6 × 10 6 الخلايا على كل لوحة 150 ملم في 30 مل الحجم الكلي الثقافة وتوزيع الخلايا بالتساوي. احتضان الخلايا مع الضغوطات (10 ميكرومتر الباراكوات أو إغفال β المركابتويثانول،في ES المتوسطة الخلية التي تحتوي 7.5٪ الحرارة المعطل FBS) لمدة 7 أيام، وبعد ذلك استبدال العادي المتوسطة الخلايا ES السماح الخلايا على قيد الحياة لتنمو لتصبح مستعمرات للقطف.
    3. اختياري: تجميد اليسار على الخلايا المعالجة الدوكسيسيكلين عند 5.0 × 10 6 خلايا في قارورة.
  2. اختيار المستعمرات مقاومة الإجهاد
    1. بعد إعادة سائل الإعلام العادية لمدة أسبوع، نلاحظ كيف العديد الإجهاد موجودة المستعمرات مقاومة. اعتمادا على عدد من المستعمرات ويمكن الحصول عليها، وإعداد ما يكفي من الآبار مع ميتوميسين المعطل C PMEF على لوحات 96-جيدا يوم واحد مسبقا وفقا لذلك (راجع القسم 1.1 للحصول على التفاصيل).
    2. في يوم قطف، نضح واستبدال المتوسطة في لوحة التغذية 96-جيدا مع 100 ميكرولتر الطازجة المتوسطة الخلايا ES، المكان مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 حاضنة مرطب. في هذا الوقت، وإعداد U-أسفل لوحة 96-جيدا مع 50 ميكرولتر 0.25٪ التربسين-EDTA لكل بئر. نضح المتوسطة من 150 ملم لوحة مختارة من التوتر وإضافة البريدحجم التأهيلية من برنامج تلفزيوني.
    3. تعيين micropipette إلى 2 ميكرولتر، و "اختيار" على قيد الحياة المستعمرات في التربسين U-السفلي يحتوي على الآبار، واختيار مستعمرة واحدة لكل بئر. من المقبول السماح لوحة الجلوس في RT حتى تم انتقاؤها العدد المطلوب من المستعمرات. ثم، واحتضان لوحة أسفل U في 37 ° C، 5٪ CO 2 لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: عادة، ونحن نأخذ 1 ساعة لاختيار 96 المستعمرات.
    4. وقف رد الفعل التربسين صف واحد في وقت واحد مع 50 ميكرولتر ES المتوسطة الخلية باستخدام ماصة الأقنية. ماصة صعودا وهبوطا 15 مرات للحصول على تعليق خلية واحدة ونقل 100 ميكرولتر من الخلايا إلى الصف المقابل للوحة المغذية التي تحتوي بالفعل 100 ميكرولتر من ES المتوسطة الخلية. استكمال نقل لوحة كاملة. خلايا الثقافة O / N في 200 ميكرولتر. في صباح اليوم التالي، نضح المتوسطة واستبدالها مع 100 ميكرولتر ES المتوسطة الخلية.
  3. تكرار لوحات 96-جيدا
    1. عندما الآبار في المستعمرات التقطت هي 80-90٪ conflueالإقليم الشمالي، وتكرار إلى صفيحتين مطابقة، واحدة للعزل الحمض النووي والآخر للخلايا احتياطية. هذه اللوحات هي مهيلم ولا تحتوي على ميتوميسين المعطل C PMEF.
    2. نضح المتوسطة، ويغسل مع 100 ميكرولتر PBS. إضافة 50 ميكرولتر 0.25٪ التربسين-EDTA إلى كل بئر، في احتضان 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. وقف التربسين مع 150 ميكرولتر المتوسطة الخلايا ES، مزيج من قبل pipetting، ونقل 100 ميكرولتر من تعليق خلية إلى الصف المقابل لاثنين من لوحات 96-جيدا. تغيير المتوسطة يوميا.
    3. عندما لوحات هي 80-90٪ متموجة، وتجميد مجموعة واحدة من لوحات ك "احتياطية" (راجع القسم 2.2 للحصول على التفاصيل). مجموعة أخرى من لوحات يتم توسيع، كما هو مبين أدناه.
  4. توسيع خلايا لعزل الحمض النووي الجيني
    1. إعداد تعليق خلية واحدة في لوحة DNA 96-جيدا (يرجى الرجوع إلى 2.1.2 للحصول على التفاصيل).
    2. نقل تعليق خلية من كل بئر على حدة من لوحة 96-جيدا إلى بئر من 24-جيدا لوحة (4 الكل) باستخدام ميكرopipette. ضمان عدم وجود التلوث عبر أي الخلايا، كما المستعمرات اختار 'هي' نسيلي "في الأصل. خلايا الثقافة في 0.5 مل ES المتوسطة الخلية، وتغيير المتوسطة يوميا حتى الآبار هي 80-90٪ متموجة.
      ملاحظة: لوحة 24-جيدا تسمح العائد كافية من الحمض النووي الجيني لتحليل PCR.

5. التعرف على PB مواقع الإدراج والجينات المحاصرين

  1. عزل الحمض النووي الجيني من 24 لوحة جيدا: الخلايا ليز في 24 لوحة جيدا وعزل الحمض النووي الجيني خالية من الحمض النووي الريبي.
  2. أداء Splinkerette PCR (SpPCR) لتوليد شظايا تسلسل المرافقة الموقع التكامل ينقول PB كما هو موضح 7،8.
    ملاحظة: SpPCR هو عملية لمدة خمسة أيام، على الرغم من التدريب العملي على الوقت كل يوم هو الحد الأدنى.

6. تحليل الوراثية من النسخ المسخ

  1. تحديد الماجستير جيدا وتنقية نسخة من الفائدة.
    1. عندما كان موقع التكامل PBمعين، تصميم التمهيدي إلى الأمام المنبع من موقع التكامل للاستخدام مع التمهيدي العكسي PB (على سبيل المثال، PB3'-1) 8 وشاشة لوحة DNA المقابلة لنفس الفرعي للمكتبة "من الذي اختار استنساخ مقاومة الإجهاد. نتوقع أن نجد جيدا إيجابي واحدة فقط عبر كامل لوحة DNA 96-جيدا. ذوبان الجليد هذه البئر على وجه الدقة من لوحة "ماستر" لوحة 24-جيدا على مغذيات وتنمو الخلايا حتى 80-90٪ confluency.
      ملاحظة: عند هذه النقطة، وهذا جيد يحتوي على خليط من الحيوانات المستنسخة المحاصرين الجينات.
    2. عندما لوحة 24-جيدا هي 80-90٪ متموجة، يعرض للتريبسين الخلايا وخلايا ES 1000 لوحة في لوحة التغذية 100 ملم (ضمان تعليق خلية واحدة). مرور الخلايا المتبقية في قارورة T25 على مغذيات للتوسع. تجميد الخلايا من القارورة T25 عندما المستعمرات هي 80-90٪ متموجة. تجميد 4 قوارير T25 في قارورة ما يعود المنبثقة.
    3. السماح للمستعمرات أن ينمو لمدة 7 أيام، ثم اختيار 96 المستعمرات إلى 96 جيدا الحديدإيدير لوحة. الرجوع إلى القسم 4.2 لاختيار الإجراء. تكرار لوحة عندما جاهزة في لوحة "DNA" وتجميد البعض '2 الثانية -master' لوحة (راجع القسم 2.2 لتجميد).
    4. السماح المستعمرات لتصل إلى 80-90٪ confluency. شاشة لوحة DNA للعثور على الآبار التي تحتوي على استنساخ تنقيته من الفائدة. توسيع الخلايا من 96-جيدا لوحة 2 الثانية -master إلى 24 جيدا وبعد ذلك إلى قارورة T25 (كل شيء على مغذيات). تجميد 4 قوارير T25 في قارورة.
      ملاحظة: عند هذه النقطة، خط خلية المحاصرين الجين هو نسيلي، ولم يتعرض إلى الإجهاد، ومناسبة لإنتاج الماوس.
  2. تحديد عدد PB الإدراج: أذاب قارورة واحدة من خط خلية مقاومة الإجهاد وتوسيع الخلايا في قارورة T25 مهيلم. عزل الحمض النووي الجيني والتحقق من وجود عدد نسخة من ينقول PB. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق QPCR استهداف الجين بالنيوميسين.
  3. قياس مستوى التعبير الجيني: بعد confirming هناك حدث واحد التكامل PB في خط خلية من الاهتمام، وقياس مستوى التعبير عن الجينات محاصرين من قبل RT-QPCR باستخدام تحقيقات TAQMAN محددة لكل الجينات.
  4. تسلسل مرنا متحولة: إنشاء amplicon كدنا] بواسطة PCR باستخدام الصلب التمهيدي المنبع إلى اكسون والصلب التمهيدي المصب لتسلسل لصق متقبل من فخ الجينات الكاسيت. تسلسل جزء كدنا] للتأكيد على أن الربط المتوقع يحدث في الجين المحاصرين.
  5. إعادة تعبئة وينقول piggyBac لاختبار العلاقة السببية بين الجينات المحاصرين ومقاومة الإجهاد.
    1. 24-48 ساعة قبل ذوبان الخلايا لإعادة تحشد PB، ذوبان الجليد وصفيحة DR4 مغذيات على T25 واحد واثنين من قارورة 100 ملم لوحات. يوم واحد على الأقل بعد ومطلي مغذيات DR4 على قارورة T25، ذوبان الجليد قارورة واحدة من خط الخلية التي تحتوي على الإدراج PB ولوحة الخلايا في قارورة T25 التي تحتوي على مغذيات DR4. تنمو الخلايا في خلية ES المتوسطةلمدة 48 ساعة، وتغيير المتوسطة يوميا.
    2. إعداد تعليق خلية واحدة من خلايا ES. عد الخلايا مع عداد خلية الآلي، ونقل 5.0 × 10 6 خلايا ES لأنبوب 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج، و resuspend الخلايا في 800 ميكرولتر PBS. نقل تعليق إلى 4 ملم كفيت.
    3. إضافة 20 ميكروغرام mPBase بورو إلى كفيت، ومزيج من قبل pipetting، والخلايا electroporate (راجع القسم 1.4 للحصول على التفاصيل). توزيع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل على اثنين من 100 ملم لوحات DR4 المغذية. خلايا الثقافة O / N في ES المتوسطة الخلية.
    4. في صباح اليوم التالي، تغذية الخلايا مع ES المتوسطة مع / مل بوروميسين والثقافة الخلايا 1 ميكروغرام لمدة 48 ساعة. سحب اختيار بوروميسين والاستمرار في ثقافة الخلايا لمدة 5 أيام. عندما المستعمرات هي كبيرة بما يكفي لقطف، واختيار في لوحة التغذية 96-جيدا (راجع القسم 4.2).
    5. عندما وصلت إلى خلايا التقطت 80-90٪ confluency، وتقسيم 1/6 عشر من لوحة إلى لوحة DNA و06/01 عشر للرريأكلون في لوحة G418، وترك 2/3 طلقة من الخلايا في لوحة أصلية ليتم تجميدها (راجع القسم 2.2 لتجميد).
    6. الثقافة لوحة DNA في الخلايا ES المتوسطة لعزل الحمض النووي في وقت لاحق، وصفيحة G418 في 150 ميكروغرام / مل G418 لاختبار لفقدان المقاومة النيوميسين. الآبار مع عدم وجود خلايا قابلة للحياة بعد 72-96 ساعة في الثقافة التي تحتوي على G418 تشير إلى إعادة تحشد ناجحة للاحتباس الجينات PB ينقول.
    7. وسيتم فحص الآبار المقابلة في لوحة "DNA" من قبل PCR لتأكيد تمت إزالة ينقول PB. عندما لوحة DNA 90٪ متموجة، عزل الحمض النووي الجيني في 96-جيدا شكل لوحة (4) لفحص PCR لاستعادة تسلسل من النوع البري وغياب الجدد IRES كوسيلة لتأكيد الارتداد.
    8. ذوبان الجليد الآبار مطابقة من لوحة ماستر لوحة 24-جيدا والتوسع في قارورة T25 (مع كل مغذيات). تجميد أربع عبوات في T25 قارورة كما احتياطية.

    6. 7. الجيل ماوس المسوخ

    1. استعادة خلايا ES مقاومة من لوحات رئيسية واستخدامها لحقن الجنين لتوليد الوهم. يتم حقن حوالي 15-20 خلايا ES إلى الفردية C57BL / 6 الكيسة. نقل 15 الكيسات الأريمية في الماوس إلى رحم الأنثى pseudopregnant (سلالة ICR). تتزاوج الوهم الذكور (المشار إليها بواسطة ES خلايا محددة آغوطي لون المعطف) المستخرجة من القمامة مع العديد من الشباب عذراء C57BL / 6J الإناث لاختبار خط نقل الجرثومية، وإلى بناء مستعمرة فئرانا معدلة وراثيا.
    2. عزل والخلايا الليفية الجلد الذيل اختبار من الفئران متحولة F1 والبرية من نوع littermate عن أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) مستوى ومقاومة الباراكوات 9.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في تجربة الطفرات نموذجية، ويتكون ترنسفكأيشن ما مجموعه 3 × 10 7 خلايا ES مع PB-UPA وMPB transposase. وتتلخص أعداد خلايا ES-المحاصرين الجينات المولدة في تجربتين مستقلة في الجدول 1. وكفاءة الجينات انحباس حوالي 0.04٪. مكتبات الجينات فخ مجتمعة تحتوي على 22400 المسوخ المستقلة، حول التغطية الكاملة لجينوم الفأر (23،000 الجينات الترميز). ويمكن تحقيق التغطية المفرطة عن طريق توليد المزيد من المسوخ من خلال الطفرات المتكررة و / أو توسيع نطاق العملية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يسمح التحليل الجيني الأمامي باستجواب غير متحيز للجينوم بحثا عن الجينات المسؤولة عن نمط ظاهري معين. هذه الطريقة قوية جدا للكشف عن وظائف جينية جديدة. وقد تم استخدامه على نطاق واسع في الكائنات الحية المنخفضة ولكن ليس في الثدييات ، مثل الفأر ، ويرجع ذلك أساسا إلى التكلفة المرتفعة للغاية المرتبطة بالبنية التحتية والخدمات اللوجستية التي قد تنطوي عليها. هنا ، قمنا بنقل عملية الفحص الجيني إلى منصة زراعة الخلايا الجذعية الجنينية ، مما زاد بشكل كبير من الكفاءة والإنتاجية في توليد الطفرات وتحديد الطفرات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نود أن نشكر معهد Wellcome Trust Sanger على هدايا الينقولات piggyBac و piggyBac transposase. تم دعم هذا العمل من خلال منحة الجزار في كولورادو و NIH R01 AG041801 (WSC).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Vector< / strong>
PB-UPA
mPBase
mPBasePuro
Tissue Culture< / strong>
500 مل مرشحات StericupEMD MilliporeSCGPU05RE
250 مل مرشحات Stericupمرشحات EMD MilliporeSCGPU02RE
50 مل Steriflip-GVEMD MilliporeSE1M179M6
KO DMEMLife Technologies10829-018
DMEMSigma-AldrichD6429
FBSلثقافة الأنسجة البيولوجية104
FBS المعطلة بالحرارةسيجما-ألدريتشF4135-500
LIFEMD MilliporeESG1107
الأحماض الأمينية غير الأساسيةتقنيات الحياة11140-050
GlutaMAXLife Technologies35050-061
Pen / StrepLife Technologies15140148
& beta - MercaptoethanolLife Technologies21985-023
ثنائي كلوريد ميثيل فيولوجين ( باراكوات)سيجما ألدريتش856177
ميثيل سلفوكسيد Hybri-MAXسيجما-ألدريتشD2650
EmbryoMAX 0.1٪ جيلاتينEMD MilliporeES006B
DPBS /HyCloneالمعدل SH30028.02
0.25٪ Trypsin-EDTALife Technologies25200-056
T25 قارورةCorning353108
T75 قارورةكورنينج353135
100 مم   لوحةكورنينج353003
150 مم   لوحةكورنينج430599
96 بئر   لوحةكورنينج3585
96 بئر U لوح سفليكورنينج3799
لوح 24 بئركورنينج3526
خزان سعة 50 ملCorning4870
أنابيب 15 مل VWRInternational، LLC82050-276
الخلايا الليفية الجنينية الأولية للفأرEMD MilliporePMEF-NL
DR4 الخلايا الليفية الجنينية للفأرالمطبقة الخلايا الجذعيةASF-1001
Mitomycin CFisher BioResteroids  BP25312
Geneticin (G418)Life Technologies11811-023
DoxycyclineFisher BioReagents  BP26531
CryotubesThermo Scientific377267
الطرد المركزي   ؛Eppendorf5702
TC10 عداد الخلاياBio-Rad
Counting Slides (ل TC10)Bio-Rad1450011
Electroporation< / strong>
Gene Pulser XcellBio-Rad1652611
Gene Pulser Cuvettes (4 &# 160 ؛ فجوة مم)Bio-Rad1652088
<قوي>علم الأحياء الجزيئي < / قوي>
Thermal CyclerEppendorfMastercylcer ep Gradient   ؛ مجموعة S
Puregene Core BQiagen158745
Topo-TA Cloning kitLife Technologies 450030
مجموعة توليف (كدنا) عالية السعةللأنظمة الحيوية التطبيقية4368814
وكلوريد الصوديومفيشر الكواشف الحيوية BP358-212
100٪ الإيثانولديكون مختبرات ، Inc.2716
زراعة الأنسجة المعالجة المزدوجةسيجما ألدريتشW3500
Sau3A1نيو إنجلاند بيولوجيR0169L
T4 DNA Ligaseنيو إنجلاند BioLabsM0202T
EcoRVNew England BioLabsR3195S
96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al.< / em> 1992)
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
Fisher AcidBioRecodes   ؛A144-212
EDTASigma-AldrichE5134<
em>N< em>-Lauroylsarcosine ملح الصوديومSigma-AldrichL5777
Proteinase-KFisher BioRecodes  BP1700
electrophoreses< / strong>
mini-sub cell GTBio-Rad170-4469EDU
LE Agarose   ؛GeneMateE3120500
Ethidium Bromide فيشر الكواشف الحيوية BP1302
100 BP سلم الحمضالنووي نيو إنجلاند BioLabsN3231S
1 كيلو بايت سلم الحمضالنووي نيو إنجلاند BioLabsN3232S
2-log DNA سلمنيو إنجلاند BioLabsN3200L
ثنائي أجهزة الطرد المركزي مياه

المراجع

  1. Johnson, T. E., et al. Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease. J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).
  2. Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice. Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).
  3. Perez, V. I., et al. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell. 8, 73-75 (2009).
  4. Martin, G. M. Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging. Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).
  5. Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice. Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).
  6. Ramirez-Solis, R., et al. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).
  7. Uren, A. G., et al. A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites. Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).
  8. Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells. Genome Res. 19, 667-673 (2009).
  9. Chick, W. S., et al. Screening for stress-resistance mutations in the mouse. Front Genet. 5, 310(2014).
  10. Salmon, A. B., et al. Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).
  11. Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36, 543-544 (2015).
  12. Baker, K. E., Parker, R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression. Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).
  13. Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 33, e20(2004).
  14. Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling. Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

مسح جيني أماميخلايا جذعية جنينيةاختيار بالباراكواتاستراتيجية الزراعة التكراريةتوليد طفرات الفأرمسح عالي الإنتاجيةعملية حبس الجينمقاومة الإجهاد التأكسديمكتبات الخلايا الجذعية الجنينية
المنهج الوراثي إلى الأمام للكشف عن الإجهاد الجينات المقاومة في الفئران - شاشة عالية الإنتاجية في خلايا ES
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.