يمكن استخدام هذا التطبيق المبسط للفحص المجهري داخل الحيوية للأوردة المساريق في الفئران في نماذج مختلفة من الالتهاب لمراقبة تفاعلات الكريات البيض والبطانية والصفائح الدموية والكريات البيض.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التفاعلات حيوي داخلي المجهري من خلايا الدم البيضاء-البطانية وصفائح الدم الكريات البيض في المساريقية الأوردة في الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
intravital المجهري هو طريقة التي يمكن استخدامها للتحقيق في عمليات مختلفة في مناطق مختلفة والسفن في الحيوانات الحية. في هذا البروتوكول، وصفنا intravital المجهري الأوردة مساريق. هذا لا يمكن أن يؤديها في فترة قصيرة من الوقت مع نتائج استنساخه تظهر تفاعلات الكريات البيض البطاني في الجسم الحي. وصفنا بيئة التهابات بعد التحدي LPS من البطانة. ولكن في هذا نموذج واحد يمكن تطبيق العديد من أنواع مختلفة من حالات الالتهابات، مثل بكتيريا أو كيميائية أو بيولوجية والتحقيق في إدارة المخدرات وآثارها المباشرة على الحيوانات الحية وتأثيرها على تجنيد الكريات البيض. وقد تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح لعدد من العلاجات المختلفة من الفئران وآثارها على الاستجابة للالتهابات في الأوعية. هنا، نحن تصف التصور من الكريات البيضاء والصفائح الدموية التي وصفها fluorescently هذه مع رودامين 6G. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لأي التصوير معين يكون المؤسسة العامةrformed باستخدام استهداف جزيئات fluorescently المسمى.
المقدمة
والغرض من هذا البروتوكول هو لوصف أسلوب مبسط لintravital المجهري الأوردة مساريق في الفئران التي تعيش على الملاحظة المباشرة للتفاعلات الكريات البيض البطانية والكريات البيض الصفيحات في ظل ظروف التهابات.
وقد وضعت intravital المجهري لدراسة التفاعلات الكريات البيض البطاني في الجسم الحي في ظل ظروف التهابات 1،2، وهي ليست تافهة ولكنها مهمة لفهم التوظيف الكريات البيض الالتهابية وظيفة. تم تطوير طريقة وصفنا في هذا البروتوكول على أساس المنشورات التي تم نشرها مسبقا. على غرار تصور الصفائح الدموية التأسيس في خثرة المتزايد 3 وبالتوازي مع ما تم نشره في وقت سابق من 4، يتم فحص لمساريق الوريد exteriorized التي تنتقل عن طريق المجهر الضوئي. وهناك نماذج أخرى مختلفة من المجهري داخل حيوية مثل العضلات المشمرة الجرذان 5 أو كبد الفأر والجرذان 6.
وقد تم تطوير intravital المجهري من مساريق الوريد وتطبيقها في دراسات سابقة من قبل عدة مجموعات. وقد استخدمنا هذه التقنية لمراقبة الاختلافات في التوظيف الكريات البيض بين الفئران نوع البرية وhydroxylase1 تريبتوفان (Tph1) - / - الفئران التي تعاني من نقص السيروتونين غير العصبية ومقارنة النتائج مع الفئران التي تم المنضب دواء من قبل على المدى الطويل السيروتونين الصفائح الدموية تطبيق على امتصاص السيروتونين الانتقائية المانع فلوكستين 7. لقد درست أيضا التفاعلات الكريات البيض البطانية بعد العلاج فلوكستين الحادة 8.
في هذا البروتوكول ونحن نركز على intravital المجهري الأوردة مساريق، لأن هذا النموذج لا يمكن أن يؤديها بسرعة، ويسمح القياسات الصحيحة من التفاعلات الكريات البيض البطانية والصفيحات الكريات البيض. وهذا هو أكثر من ذلك بكثير صعبة وintravital المجهري من الأجهزة الأخرى، مثل العظام والكبد والجلد، أو العضلات المشمرة تستغرق وقتا طويلا. وضعل الموصوفة هنا هو المثل الأعلى للتقييم استنساخه من التهابات التفاعل خلية خلية بعد challengeing مع حافز التهابات، مثل حقن داخل الصفاق من lipopolysaccharide في.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد أجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا لقانون حماية الحيوان الألماني (TierSchG). وتم إيواء الفئران والتعامل معها وفقا للممارسة الحيوان جيدة كما حددتها FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) وهيئة الرفق بالحيوان الوطنية GV-سولاس (www.gv-solas.de/index.html). وافقت لجنة رعاية الحيوان من جامعة فرايبورغ وكذلك السلطات المحلية (Regierungspräsidium فرايبورغ) جميع التجارب على الحيوانات.
1. التعامل مع الحيوان، إعداد وتحريض التهاب
- استخدام 4-6 الاسبوع الفئران الذكور القديم مع مجموعة وزن 16-20 جم. ملاحظة: إذا كانت الفئران الأكبر سنا أو أثقل ما يقدمونه الدهون الزائدة المحيطة السفينة، مما يحد من الملاحظة المجهرية.
- تعقيم جميع الأدوات والجدول المجهر قبل الجراحة.
- حقن 20 ملغ / كغ LPS (lipopolysaccharide في) البريتونى 4 ساعات قبل المجهري في فأر حي للحث على inflamm البكتيريةأوجه.
- Prewarm محلول ملحي 0.9٪ في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لترطيب الغرفة البلاستيكية والأنسجة مساريق.
- تخدير الفأر مع حقن داخل الصفاق من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (5 ملغ / كلغ) الحق قبل إجراء الفحص المجهري. التخدير بديلة يمكن استخدامها، على سبيل المثال، 2٪ استنشاق الأيزوفلورين. تأكيد التخدير المناسبة عن فقدان استجابة لتحفيز رد الفعل (أخمص القدمين أو قرصة الذيل مع الضغط الثابت).
- يزيل الشعر البطن باستخدام آلة الحلاقة وإزالة الشعر فضفاضة مع الشاش مشبعة الايثانول 70٪.
- تطبيق مرهم التعليم والتدريب المهني على العينين من الماوس لمنع جفاف، في حين تحت التخدير.
2. جراحة
- تعقيم البطن باستخدام الايثانول 70٪. هذه الطريقة ليست طريقة عقيمة، ويمكن أن تكون قاتلة في نهاية التجربة.
- إجراء عملية فتح البطن وسيطة: فتح جلد البطن استخدام، ملقط منحنية الصغيرة ومقص صغير. التعرف على برنامج التحصين الموسعسفن gastrical وفتح الغشاء البريتوني في منطقة ألبا، لحماية السفن.
- تطبيق بضع قطرات من المياه المالحة prewarmed في تجويف البطن للحفاظ على الأنسجة رطبة.
- كريات الدم البيضاء والصفائح الدموية التسمية التي fluorescently حقن 50 ميكرولتر رودامين 6G (1 ملغ / مل) الرجعية orbitally كما هو موضح قبل 9،10.
- من الداخل للظاهر حلقة من مكان ileumand ذلك في petridish التي يبلغ قطرها 10 سم والتأكد من الحفاظ على الأنسجة رطبة عن طريق تطبيق 37 ° C prewarmed محلول ملحي (0.9٪) في كل دقيقة أخرى.
3. حيوي داخلي المجهر
- ضع الماوس تحت المجهر وتحقيق الوريد مساريق التي يبلغ قطرها 200-300 ميكرون في وسط الرأي. اختيار سفينة بلا محيط الدهون المرئية.
- لا تلمس السفن مساريق بالتالي تجنب تحفيز البطانة. التعامل مع حلقة الدقاق بحذر.
- تصور الدم خلايا البطانية التفاعلاتمع مجهر مقلوب أو تستقيم وكاميرا باستخدام برنامج المجهر. سجل الدم التفاعلات خلية البطانية لمدة 1 دقيقة في 4 عروق مختلفة في الماوس.
- الموت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم بعد الانتهاء من تجارب التصوير.
تحليل 4.
- إجراء تحليل للاتصال وأعمى لجميع المعلمات. إجراء تحليل باستخدام أي برنامج مناسب.
- تأكيد ظروف مستقرة وقابلة للمقارنة interindividually تدفق الدم في ارتفاع الوقت قرار سينمائية مقاطع (معدل الإطار الأقصى) على داخل اللمعة تدفق خلايا الدم.
- تحديد عدد الكريات البيض المتداول. لذلك رسم خط عمودي عن طريق الوريد وعد كل الكريات البيض عبور هذا الخط في 1 دقيقة.
- تحديد سرعة المتداول عن طريق قياس الوقت تحتاج الكريات البيض واحدة واحدة لتمرير مسافة 50 ميكرون بينما المتداول ثابت على البطانة. للقيام بذلك، ووضع اثنين من خطوط عمودية في مسافة 50 ميكرون رhrough الوريد.
- قياس الوقت يحتاج إلى الكريات البيض تمثيلية للحصول من سطر واحد إلى other.Calculate سرعة الكريات البيض بقسمة 50 ميكرون من خلال الوقت اللازم (ميكرون / ثانية).
- قياس التصاق الكريات البيض في مجال 0،04 مم 2. للقيام بذلك، رسم مربع مع طول ضلع 200 ميكرون في الوريد.
- عد الكريات البيض ملتصقة حازمة، الذي يعرف بأنه أي تحرك ملموس لمدة 30 ثانية، في هذه الساحة.
- حساب عدد الصفائح الدموية بد أن الكريات البيض واحدة لتحديد التفاعلات الصفيحات الكريات البيض.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وأظهرت لمحة عامة عن وضع تجريبي الموصوفة في هذا البروتوكول في الشكل 1. ويظهر الماوس مع exteriorized الدقاق حلقة وسفنها، والتي يمكن ملاحظتها في intravital المجهري الشكل 2 يوضح درجة معينة من التنشيط في الحيوانات غير المعالجة نظرا ل الإجراء نفسه. ولكن هناك تقريبا أي المتداول بطيئة أو الالتصاق القوي من الكريات البيض بالمقارنة مع الفئران LPS المعاملة الشكل 2 يدل أيضا على نتائج مختلفة من intravital المجهري في الفئران wildtype إما تعامل م...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا نحن تصف إعداد وأداء intravital المجهري الأوردة مساريق الفئران في الجسم الحي. هذا الأسلوب يتيح لنا الفرصة لمراقبة الكريات البيض البطانية والصفائح الدموية البطانية التفاعلات 11 مباشرة في الكائن الحي.
كاستجابة مبكرة لالتهاب البطانة يحصل على تنشيط ويتفاعل مع كريات الدم البيضاء والصفائح الدموية مما أدى إلى المتداول، التصاق والتهجير 12. لكن الكريات البيض تتفاعل أيضا مع الصفائح الدموية...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| عديدات السكاريد الدهنية من الإشريكية القولونية 055: B5 | سيجما ألدريتش | L2637 |
المراجع
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316(2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. Immune functions of platelets. Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
