مقالة منهجية

طبقة تلو طبقة الكولاجين ترسب في أجهزة ميكروفلويديك لMicrotissue لتحقيق الاستقرار

DOI:

10.3791/53078

⸱

سبتمبر 29, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospitals for Children-Boston

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب إنشاء الأنسجة الدقيقة الوظيفية داخل أجهزة الموائع الدقيقة تثبيت الأنماط الظاهرية للخلايا من خلال تكييف تقنيات زراعة الخلايا التقليدية مع الأبعاد المكانية المحدودة في الأجهزة الدقيقة. يسمح تعديل الكولاجين بترسب طبقة تلو الأخرى لتجميعات الكولاجين فائقة النحافة التي يمكنها تثبيت الخلايا الأولية ، مثل خلايا الكبد ، كنماذج للأنسجة الموائع الدقيقة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن الموائع الدقيقة توفر تحكما رائعا في البيئة الخلوية المكروية ، إلا أن زراعة الخلايا داخل أجهزة الموائع الدقيقة يمكن أن تكون challenging. 3D زراعة الخلايا في المواد الهلامية من النوع الأول من الكولاجين تساعد على استقرار مورفولوجيا الخلية ووظيفتها ، وهو أمر ضروري لإنشاء نماذج أنسجة الموائع الدقيقة في الأجهزة الدقيقة. غالبا ما يكون من الصعب ترجمة تقنيات الاستزراع ثلاثية الأبعاد التقليدية لألواح زراعة الأنسجة إلى أجهزة الموائع الدقيقة بسبب أبعاد القناة المحدودة. في هذه الطريقة ، نصف تقنية لتعديل الكولاجين الأصلي من النوع الأول لتوليد محاليل كولاجين متعددة الكتل ومتعددة الأنيونيات يمكن استخدامها مع ترسب طبقة تلو الأخرى لإنشاء مجموعات كولاجين رقيقة للغاية فوق الخلايا المزروعة في أجهزة الموائع الدقيقة. تعمل طبقات الكولاجين الرقيقة هذه على استقرار مورفولوجيا الخلية ووظيفتها ، كما هو موضح باستخدام خلايا الكبد الأولية كمثال للخلية ، مما يسمح بزراعة الأنسجة الدقيقة على المدى الطويل في أجهزة الموائع الدقيقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن الموائع الدقيقة تسمح بالتحكم الرائع في البيئة المكروية الخلوية ، إلا أن زراعة الخلايا ، وخاصة الخلايا الأولية ، داخل أجهزة الموائع الدقيقة يمكن أن يكون أمرا صعبا. تم تطوير العديد من تقنيات زراعة الخلايا التقليدية للحفاظ على وظيفة الخلية وتثبيتها عند زراعتها في ألواح زراعة الأنسجة ، ولكن غالبا ما يكون من الصعب ترجمة هذه التقنيات إلى أجهزة موائع دقيقة.

إحدى هذه التقنيات هي ثقافة الخلايا على المواد الهلامية الكولاجينية أو المحصورة بينها كنموذج لبيئة الخلايا الفسيولوجية ثلاثية الأبعاد. 1 الكولاجين من النوع الأول هو أحد أكثر البروتينات استخداما لتطبيقات المواد الحيوية بسبب انتشاره في كل مكان في المصفوفة خارج الخلية ، والوفرة الطبيعية ، ومواقع ارتباط الخلايا القوية ، والتوافق الحيوي. 2 تستفيد العديد من الخلايا من الثقافة ثلاثية الأبعاد مع الكولاجين ، بما في ذلك الخلايا السرطانية3،45 ، والخلايا البطانية للأوعية الدمويةالدقيقة 6 ، وخلايا الكبد7 ، من بين أمور أخرى. في حين أن استخدام المواد الهلامية الكولاجين سهل في الأشكال المفتوحة ، مثل ألواح زراعة الأنسجة ، فإن أبعاد القناة المحدودة والطبيعة المغلقة لأجهزة الموائع الدقيقة تجعل استخدام السوائل التي تصنع هلام غير عملي دون سد القناة بأكملها.

للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا بدمج تقنية الترسيب طبقة تلو الأخرى8 مع التعديلات الكيميائية لمحاليل الكولاجين الأصلية لإنشاء مجموعات كولاجين فائقة النحافة فوق الخلايا المزروعة في أجهزة الموائع الدقيقة. يمكن لهذه الطبقات أن تعمل على استقرار مورفولوجيا الخلية وتعمل بشكل مشابه للمواد الهلامية الكولاجين ويمكن ترسيبها على الخلايا في أجهزة الموائع الدقيقة دون سد القنوات بمصفوفة مبلمرة. الهدف من هذه الطريقة هو تعديل الكولاجين الأصلي لإنشاء محاليل الكولاجين متعددة الأجزاء والبوليانيون وتثبيت الخلايا في ثقافة الموائع الدقيقة عن طريق ترسيب مجموعات مصفوفة الكولاجين الرقيقة على الخلايا. تم استخدام هذه التقنية لتحقيق الاستقرار في مورفولوجيا ووظيفة خلايا الكبد الأولية في أجهزة الموائع الدقيقة. 9

< p class = 'jove_content'> على الرغم من أنه تم الإبلاغ سابقا عن ترسب طبقة تلو الأخرى باستخدام الإلكتروليتات الطبيعية والاصطناعية10 لتغطية خلايا الكبد في زراعة الصفائح11،12 وكطبقة بذر لخلايا الكبد في أجهزة الموائع الدقيقة13،14 ، تصف هذه الطريقة ترسب طبقة كولاجين نقية فوق خلايا الكبد ، تحاكي تقنيات زراعة الكولاجين ثلاثية الأبعاد. في هذا البروتوكول ، نستخدم خلايا الكبد كمثال على الخلايا التي يمكن الحفاظ عليها باستخدام طبقات الكولاجين ثلاثية الأبعاد. قد تستفيد الأنواع العديدة الأخرى من الخلايا التي تستفيد من الثقافة ثلاثية الأبعاد في الكولاجين بالمثل من الثقافة بعد ترسب طبقة تلو الأخرى لمجموعة مصفوفة الكولاجين فائقة النحافة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الحل الأصلية القابلة للذوبان الكولاجين

  1. إعداد أو شراء 200 ملغ من حمض، القابلة للذوبان، النوع الأول الكولاجين من ذيول الفئران في 1-3 ملغ / 15 مل باستخدام بروتوكولات العزلة القياسية، مثل ذكرت من قبل Piez وآخرون.
  2. تسلق كمية من المواد ابتداء على أساس حجم الغاية المرجوة من الحلول الكولاجين تعديلها. حوالي جعل 25-30 مل من مميثل و25-30 مل من الحلول الكولاجين succinylated، كل في 3 ملغ / مل، من 200 ملغ من الكولاجين الأصلي للذوبان.

2. الكولاجين مثلأيشن

  1. تمييع 100 ملغ من، المحمضة (درجة الحموضة 2-3) حل الكولاجين الأصلي إلى تركيز 0.5 ملغ / مل مع الماء المعقم الجليد البارد والحفاظ على حل على الجليد لمنع دبق.
  2. ضبط درجة الحموضة من الحل الكولاجين ل10/09 مع بضع قطرات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم ويقلب في RT لمدة 30 دقيقة. مراقبة راسب الكولاجين، مما تسبب في حل ليصبح غائما.
  3. تدور باستمرار الحل الكولاجين عجلت في 3000 × ز لمدة 25 دقيقة. وينبغي أن يكون واضحا، مثل هلام يعجل مرئية في الجزء السفلي من الأنابيب. نضح والتخلص السليم من السوائل طاف.
  4. Resuspend والكولاجين عجلت في 200 مل من الميثانول بنسبة 0.1 N حمض الهيدروكلوريك والسماح للرد فعل مثيلة لتحدث مع التحريك في RT لمدة 4 أيام. والكولاجين لا يحل، ولكن يجب أن تتفكك إلى قطع صغيرة جدا واضحة من شأنها أن تجعل الحل غائم.
  5. بعد مثيلة، الطرد المركزي الحل في 3000 × ز لمدة 25 دقيقة لتكوير الكولاجين الميثيلي. نضح والتخلص من طاف الميثانول المحمض.
  6. حل الكولاجين ميثليته في 25 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة، وإعطاء تركيز حوالي 3 ملغ / مل، مع pipetting لالمتكررة، وتصفية حل من خلال مصفاة الخلية 60 ميكرومتر. ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 7،3-7،4 باستخدام 20 ميكرولتر الزيادات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم.
  7. تقييم concentratioن من الحل باستخدام الكولاجين الفئران التجاري ELISA عدة أو هيدروكسي عدة الفحص. تمييع الحل إلى 3 ملغ / مل مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
  8. تعقيم الحل الكولاجين ميثليته من قبل نقلها إلى زجاجة مع غطاء المسمار، طبقات بعناية 3 مل من الكلوروفورم في الجزء السفلي من القمقم، والسماح للزجاجة لضبط O / N عند 4 درجات مئوية، ثم جو معقم و مطهر إزالة وتخزين الطبقة العليا، وهو الكولاجين الميثيلي.
  9. تخزين الحل في 4 درجات مئوية لاستخدامها في غضون شهر 1.

3. الكولاجين Succinylation

  1. تمييع الآخر 100 ملغ من، المحمضة (درجة الحموضة 2-3) حل الكولاجين الأصلي إلى تركيز 0.5 ملغ / مل مع الماء المعقم الجليد البارد والحفاظ على حل على الجليد لمنع دبق.
  2. ضبط درجة الحموضة من الحل الكولاجين ل10/09 مع بضع قطرات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم ويقلب في RT لمدة 30 دقيقة. الكولاجين يجب أن يعجل، مما تسبب في حل ليصبح غائما.
  3. حل 40 ملغ من يمثcinic أنهيدريد (0.4 ملغ لكل ملغ من الكولاجين) في 10 مل من الأسيتون (1/20 عشر حجم الحل الكولاجين). ببطء (في ما يقرب من 0.5 مل الزيادات) إضافة هذا الخليط إلى حل الكولاجين مع التحريك في حين رصد مستمر لدرجة الحموضة. الحفاظ على درجة الحموضة فوق 9.0 عن طريق إضافة 1 أو 2 قطرات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم مع اقتراب الرقم الهيدروجيني 9.0.
  4. تواصل اثارة في RT لمدة 120 دقيقة بعد إضافة كل من السكسينك في الأسيتون. مراقبة الحل لتصبح واضحة كما يذوب الكولاجين succinylated. فحص دوري الرقم الهيدروجيني للتأكد من أنها لا تزال فوق 9.0.
  5. ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 4.0 مع 20 الزيادات ميكرولتر من 1 N حمض الهيدروكلوريك. مراقبة الحل غائم مرة أخرى، كما يترسب الكولاجين succinylated.
  6. بعد succinylation، الطرد المركزي الحل في 3000 × ز لمدة 25 دقيقة لتكوير الكولاجين succinylated. نضح والتخلص من طاف المحمضة مع السكسينك غير المتفاعل.
  7. حل الكولاجين succinylatedفي 25 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة، وإعطاء تركيز حوالي 3 ملغ / مل، مع pipetting لالمتكررة، وتصفية حل من خلال مصفاة الخلية 60 ميكرومتر. ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 7،3-7،4 باستخدام 20 ميكرولتر الزيادات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم.
  8. تقييم تركيز المحلول باستخدام الفئران الكولاجين التجاري ELISA عدة أو هيدروكسي عدة الفحص. تمييع الحل إلى 3 ملغ / مل مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
  9. تعقيم الحل الكولاجين succinylated من قبل نقلها إلى زجاجة مع غطاء المسمار، طبقات بعناية 3 مل من الكلوروفورم في الجزء السفلي من القمقم، والسماح للزجاجة لضبط O / N عند 4 درجات مئوية، ثم جو معقم و مطهر إزالة وتخزين الطبقة العليا، وهو الكولاجين succinylated.
  10. تخزين الحل في 4 درجات مئوية لاستخدامها في غضون شهر 1.

4. التحقق من الكولاجين التعديلات

  1. إعداد 1 مل عينات من كل الحلول الكولاجين الأم، مثيلة، وsuccinylated وتمييع إلى اضربentration من 0.1 ملغ / مل مع الماء النقي المعقم لأيون الهيدروجين المعايرة. وعلاوة على ذلك تمييع عازلة على الأقل 1000 أضعاف خلال غسيل الكلى ضد المياه من خلال 10 كيلو دالتون قطع membraneusing 3 تغييرات حل للا يقل عن 4 ساعة لكل منهما.
  2. ضبط درجة الحموضة من الحلول إلى 7.3 مع كميات صغيرة من هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك. باستخدام الرقم الهيدروجيني 7.3 باعتبارها مرجعية التعسفي، نفذ الهيدروجين أيون المعايرة على كل من العينات كما وصفها Tanford 16 لإنشاء منحنيات المعايرة للحلول الكولاجين الأم، مثيلة، وsuccinylated.
  3. رسم التغير في الرقم الهيدروجيني في حجم حمض أضاف مقابل عدد من H ملزمة + الأيونات في الجزيء. درجة الحموضة العالية "الأمينية" مجموعة يجب أن تظهر تحولا في الكولاجين succinylated نحو نقطة محايدة (فقدان مجموعات أمين)، وانخفاض الرقم الهيدروجيني "الكربوكسيل" مجموعة يجب أن تظهر تحولا نحو اليسار في الكولاجين الميثيلي (خسارة مجموعات الكربوكسيل ) والتحول نحو اليمين في الكولاجين succinylated (مكاسب في مجموعة الكربوكسيلالصورة)، بالمقارنة مع الكولاجين الأصلي.
  4. تقييم فعالية رد الفعل succinylation من خلال تحديد٪ من المجموعات الأمينية في الكولاجين الأصلي استبداله succinylation باستخدام حامض 2،4،6-trinitrobenzenesulfonic (TNBA) الطريقة اللونية، بعد بروتوكولات موحدة 17،18.

5. تصنيع أجهزة ميكروفلويديك والبذر الخلية

  1. صنع أجهزة ميكروفلويديك باستخدام الأساليب القياسية 9. استخدام صب متماثلة PDMS من SU-8 سادة على السيليكون تعريفها باستخدام ضوئيه لخلق ميكروفلويديك غرف زراعة الخلايا مع 100 ميكرون طويل القامة، 0،4-1،5 مم، و1-10 ملم قنوات طويلة لنمو الخلايا.
  2. استخدام منظف البلازما لأكسدة أسطح الجهاز وشريحة زجاجية، ثم اضغط معا لالسندات. بعد تعقيم الجهاز عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة على الأقل، وملء غرفة مع 50 ميكروغرام / مل فبرونيكتين في برنامج تلفزيوني العقيمة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
  3. البذور الجهاز مع الخلايا، مثل الفئران الأساسي أو خلايا الكبد البشرية، والتي تتطلب جل الكولاجين لتحقيق الاستقرار في النمط الظاهري أو دولة التمايز. نحن نستخدم 20 ميكرولتر من طازجة معزولة خلايا الكبد في الفئران الابتدائي 7،19 أو المتاحة تجاريا cryopreserved خلايا الكبد البشرية الأساسية المصنف في 14 × 10 6 خلية / مل لكل جهاز.
  4. السماح للخلايا لنعلق لمدة 4-6 ساعة، ثم تغسل الخلايا غير مرتبط واستبدال وسائل الإعلام الطلاء مع وسائل الاعلام النمو. احتضان O / N لضمان خلية كاملة الانتشار وإنشاء أحادي الطبقة متموجة من الخلايا.

6. طبقة تلو طبقة الكولاجين ترسب

  1. في تدفق الصفحي غطاء نسيج الثقافة، وإعداد كميات كافية من الكولاجين حلول مثيلة وsuccinylated لمدة 10 تطبيقات كل حل لكل جهاز، فضلا عن عدد قليل من ملل من وسائل الاعلام. الحفاظ على الحلول على الجليد. نحن نستخدم 20 ميكرولتر (10-15 أضعاف حجم الجهاز الإجمالي) الكولاجين في طبقة لكل جهاز.
  2. يكونحلج مع ميثليته (polycationic) الحل البديل بيغ الأجهزة مع 20 ميكرولتر من مميثل ثم succinylated حلول الكولاجين، في انتظار 1 دقيقة بين كل تطبيق. مسح الجهاز ما مجموعه 10 مرات في الحل الذي ينبغي أن تأخذ حوالي 20 دقيقة. العمل بسرعة لتقليل مقدار الوقت الخلايا دون وسائل الاعلام.
  3. مراقبة الكولاجين تتراكم ببطء في مدخل / مخرج تبعا لحجمها. إذا كانت المقاومة ليزيد من تدفق السوائل، وطرد الجهاز مرة واحدة أو مرتين مع وسائل الإعلام، ومن ثم الاستمرار طبقات.
  4. بعد تطبيق جميع الطبقات، وشطف الجهاز مرتين مع وسائل الإعلام الجديدة والعودة إلى الحاضنة. اعتمادا على نوع من الخلايا، والتغيرات التي يسببها المصفوفة خارج الخلية الشكلية، مثل تعزيز الاستقطاب في خلايا الكبد، يجب أن تكون مرئية في غضون ساعات قليلة.
  5. إعداد التمثيلية الأجهزة للانتقال المجهر الإلكتروني باستخدام الأساليب القياسية 9 إلى التحقق من وجود مصفوفة الكولاجينالتجمع على الجزء العلوي من الخلايا المستزرعة.

7. لتحقيق الاستقرار من النمط الظاهري خلية وظيفة

  1. صورة مورفولوجيا الخلايا، والسلامة، والاستقطاب باستخدام أساليب موحدة لنوع من الخلايا. لخلايا الكبد، وجمع الصور أكثر من 14 أيام باستخدام المجهر المرحلة، ويعيش / تلطيخ الميت للبقاء، وCMFDA صبغ لاستقطاب القمي لإثبات آثار ترسب الكولاجين.
  2. لمورفولوجيا الخلايا، مسح الجهاز من خلال مدخل بواسطة ماصة مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لشطف، وضخ 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، وصورة الجهاز باستخدام النقيض من المرحلة المجهري.
  3. لايف / تلطيخ الميت، مسح الجهاز من خلال مدخل بواسطة ماصة مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لشطف، وضخ 20 ميكرولتر من حي / حل تلطيخ الميت مع دابي أعد باتباع إرشادات الشركة المصنعة، واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 ° C، وشطف الجهاز مرة أخرى مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، وصورة الجهاز باستخدام المجهر مضان.
  4. لالصفراء كاناليتلطيخ culi، مسح الجهاز من خلال مدخل بواسطة ماصة مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لشطف، وضخ 20 ميكرولتر من 2 ميكرومتر CMFDA حل تلطيخ مع دابي أعد باتباع إرشادات الشركة المصنعة، واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 ° C، شطف الجهاز مرة أخرى مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، وصورة الجهاز باستخدام المجهر مضان.
  5. جمع وسائل الإعلام المستهلك وقياس منتجات الأيض الخلوية في نقطة زمنية مناسبة خلال مدة الثقافة لتحديد وظيفة الخلية. لخلايا الكبد، وقياس كمية الزلال واليوريا في وسائل الإعلام المستهلك.
  6. إجراء تحليلات وظيفية نقطة النهاية على الخلايا نفسها، مثل تقييم مستويات انزيم النشاط، تلوين الأجسام المضادة، أو تحليل الحمض النووي الريبي. لخلايا الكبد، وحمل وقياس إنزيم السيتوكروم P450 الأنشطة أو المرحلة الثانية الاقتران أنزيم الجلوتاثيون S-ترانسفيراز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تعديل الكولاجين الأصلي باستخدام مثيلة وsuccinylation لإيجاد حلول الكولاجين polycationic وpolyanionic لاستخدامها في طبقة تلو طبقة ترسب. Succinylation يعدل مجموعات ε الأمينية الكولاجين الأصلي مع مجموعات succinyl، ومثيلة تعديل مجموعة الكربوكسيل الكولاجين الأصلي مع مجموعة الميثيل (الشكل 1A). هذه التعديلات على بروتين الكولاجين السلاسل الجانبية الأحماض الأمينية تغير منحنيات درجة الحموضة المعايرة للحلول. Succinylation يقلل من عدد من المجموعات الأمينية ويزيد من عدد م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن إيداع سامسونج المجالس الكولاجين النقي على الخلايا مشحونة أو أسطح المواد باستخدام طبقة تلو طبقة ترسب الكولاجين تعديلها. وتظهر نتائج هذه الدراسة أن مثيلة وsuccinylation الكولاجين الأصلي إيجاد حلول الكولاجين polycationic وpolyanionic (الشكل 1) التي يمكن استخدامها مع تقنية طبقة تلو طبقة لإيداع سامسونج المجالس الكولاجين مصفوفة على الخلايا (الشكل 2) أو غيرها مشحونة السطوح المادية. هذه الطبقات مصفوفة سامسونج يمكن تحقيق الاستقرار في التشكل، والسلامة،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة ، بما في ذلك منحة اتحاد أنظمة الفيزيولوجيا الدقيقة من المركز الوطني للنهوض بالعلوم الانتقالية (UH2TR000503) ، وزمالة ما بعد الدكتوراه لجائزة Ruth L. Kirschstein National Research Service (F32DK098905 ل WJM) وجائزة Pathway to Independence (DK095984 ل AB) من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكولاجين من النوع الأول ، ذيل الفئرانLife TechnologiesA1048301 خيار للكولاجين المركز ذيل الفئران
من النوع الأول ، ذيل الجرذSigma-AldrichC3867-1VLللكولاجين مركز ذيل الفئران
من النوع الأول ، ذيل الفئرانEMD Millipore08-115خيار الكولاجين المركز ذيل الفئران
من النوع الأول ، ذيل الفئران٪ D أنظمة3440-100-01خيار لذيل الفئران المركز الكولاجين
السكسينيك أنهيدريدسيجما ألدريتش239690-50Gكاشف الميثانول
اللامائيسيجما ألدريتش322415-100 ملكاشف المثيلة
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتشS5881-500Gكاشف الأس
الهيدروكلوريك حمض الهيدروكلوريكسيجما ألدريتش320331-500 ملكاشف ترسيب الأس الهيدروجيني
كولاجين الفئران من النوع الأول ELISAChondrex6013خيار للكشف عن محتوى الكولاجين
مجموعة فحص هيدروكسي برولينSigma-AldrichMAK008-1KTللكشف عن محتوى الكولاجين
مجموعة فحص هيدروكسي برولينخيار Quickzyme BiosciencesQZBtotcol1للكشف عن محتوى الكولاجين
خيار R خيار

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pedersen, J. A., Swartz, M. A. Mechanobiology in the third dimension. Ann Biomed Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
  2. Glowacki, J., Mizuno, S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers. 89 (5), 338-344 (2008).
  3. Vescio, R. A., et al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. PNAS. 84, 5029-5033 (1987).
  4. Chandrasekaran, S., Guo, N. -h, Rodrigues, R. G., Kaiser, J., Roberts, D. D. Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by α3β1 integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98. J Biol Chem. 274 (16), 11408-11416 (1999).
  5. Chen, S. S., et al. Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three‐dimensional culture systems. Stem Cells. 21 (3), 281-295 (2003).
  6. Whelan, M. C., Senger, D. R. Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A. J Biol Chem. 278 (1), 327-334 (2003).
  7. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol Prog. 7 (3), 237-245 (1991).
  8. Decher, G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science. 277, 1232-1237 (1997).
  9. McCarty, W. J., et al. A novel ultrathin collagen nanolayer assembly for 3-D microtissue engineering: Layer-by-layer collagen deposition for long-term stable microfluidic hepatocyte culture. TECHNOLOGY. 2 (01), 67-74 (2014).
  10. Swierczewska, M., et al. Cellular response to nanoscale elastin-like polypeptide polyelectrolyte multilayers. Acta Biomater. 4 (4), 827-837 (2008).
  11. Kim, Y., Larkin, A. L., Davis, R. M., Rajagopalan, P. The design of in vitro liver sinusoid mimics using chitosan-hyaluronic acid polyelectrolyte multilayers. Tissue Eng Pt A. 16 (9), 2731-2741 (2010).
  12. Larkin, A. L., Rodrigues, R. R., Murali, T., Rajagopalan, P. Designing a Multicellular Organotypic 3D Liver Model with a Detachable, Nanoscale Polymeric Space of Disse. Tissue Eng Pt C. 19 (11), 875-884 (2013).
  13. Kidambi, S., et al. Patterned Co‐Culture of Primary Hepatocytes and Fibroblasts Using Polyelectrolyte Multilayer Templates. Macromol Biosci. 7 (3), 344-353 (2007).
  14. Janorkar, A. V., Rajagopalan, P., Yarmush, M. L., Megeed, Z. The use of elastin-like polypeptide-polyelectrolyte complexes to control hepatocyte morphology and function in vitro. Biomaterials. 29 (6), 625-632 (2008).
  15. Piez, K. A., Eigner, E. A., Lewis, M. S. The Chromatographic Separation and Amino Acid Composition of the Subunits of Several Collagens*. Biochemistry. 2 (1), 58-66 (1963).
  16. Tanford, C. The interpretation of hydrogen ion titration curves of proteins. Adv Protein Chem. 17, 69-165 (1962).
  17. Cayot, P., Tainturier, G. The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination. Anal Biochem. 249 (2), 184-200 (1997).
  18. Kakade, M. L., Liener, I. E. Determination of available lysine in proteins. Anal Biochem. 27 (2), 273-280 (1969).
  19. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Collagen DepositionMicrofluidic DevicesLayer by Layer AssemblyHepatocyte CultureCollagen ModificationMethylated CollagenSuccinated CollagenCell PolaritySecretory FunctionThin Collagen Layers

مقالات ذات صلة