مقالة منهجية

تفاعل الثقافات 3D المهندسة العصبية لمايكرو الكهربائي صالحة: مبتكر في المختبر نموذج تجريبي

DOI:

10.3791/53080

⸱

أكتوبر 18, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Informatics, Bioengineering, Robotics and System Engineering (DIBRIS), University of Genova, 2Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Department of Cognitive Neuroscience, Radboud University Medical Center, 3Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia (IIT)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا العمل ، يتم بناء نموذج تجريبي جديد تقترن فيه الثقافات العصبية ثلاثية الأبعاد بمصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة المستوية (MEAs) presented. 3D يتم بناء الشبكات عن طريق زرع الخلايا العصبية في سقالة مكونة من حبيبات زجاجية تنمو عليها الخلايا العصبية وتشكل هياكل ثلاثية الأبعاد مترابطة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حاليا ، تعد الشبكات واسعة النطاق المشتقة من الخلايا العصبية المنفصلة التي تنمو وتتطور في المختبر على أجهزة محول الطاقة الدقيقة خارج الخلية نموذجا تجريبيا قياسيا ذهبيا لدراسة الآليات الفيزيولوجية العصبية الأساسية المشاركة في تكوين وصيانة تجمعات الخلايا العصبية. ومع ذلك ، اقتصرت الدراسات المختبرية على تسجيل النشاط الفيزيولوجي الكهربي الناتج عن الشبكات العصبية ثنائية الأبعاد (2D). ومع ذلك ، نظرا للعلاقة المعقدة بين الهيكل والديناميكيات ، من الضروري إجراء تحسين كبير للتحقيق في تكوين وديناميكيات تطوير الشبكات ثلاثية الأبعاد (3D). في هذا العمل ، يتم تقديم منصة تجريبية جديدة تقترن فيها شبكات الحصين أو القشرة ثلاثية الأبعاد بمصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة المستوية (MEAs). تتحقق الشبكات ثلاثية الأبعاد عن طريق زرع الخلايا العصبية في سقالة مكونة من ميكروبيدات زجاجية (قطرها 30-40 ميكرومتر) والتي يمكن للخلايا العصبية أن تنمو عليها وتشكل تجمعات ثلاثية الأبعاد معقدة مترابطة. بهذه الطريقة ، من الممكن تصميم شبكات ثلاثية الأبعاد هندسية مكونة من 5-8 طبقات بكثافة خلية نهائية متوقعة. يؤدي التعقيد المتزايد في التنظيم المورفولوجي للتجميع ثلاثي الأبعاد إلى تعزيز الأنماط الفيزيولوجية الكهربية التي يعرضها هذا النوع من الشبكات. بالمقارنة مع الشبكات ثنائية الأبعاد القياسية ، حيث يظهر نشاط انفجار نمطي للغاية ، فإن الهيكل ثلاثي الأبعاد يغير نشاط الانفجار من حيث المدة والتردد ، كما أنه يسمح بمراقبة المزيد من نشاط الارتفاع العشوائي. بهذا المعنى ، يشبه النموذج ثلاثي الأبعاد المطور إلى حد كبير الشبكات العصبية في الجسم الحي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في المختبر ثنائية الأبعاد (2D) الشبكات العصبية بالإضافة إلى مايكرو الكهربائي صالحة (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) arethe نموذج تجريبي الذهب القياسية المعتمدة لدراسة التفاعل بين الديناميات العصبية والربط الأساسي. خلال تطوير وإعادة الخلايا العصبية الشبكات المعقدة التي تعرض جيدا definedspatio-temporalpatternsof النشاط 1،2 (أي رشقات نارية، رشقات نارية الشبكة، والنشاط ارتفاعه عشوائي). الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تسجل النشاط الكهربية من العديد من المواقع (من عشرات الآلاف من الميكروية)، والسماح لتحقيق مفصل لديناميات أعرب على مستوى الشبكة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الثقافات فصلها يجعل المحتملة التي لتصميم الشبكات الهندسية. فمن الأسهل للفهم بهذه الطريقة العلاقات الوظيفية بين النشاط الكهربية تسجيلها والمعلمات من تنظيم الشبكة مثل كثافة الخلية 3، ودرجة نمطية 4،5، وجود غير متجانسة البوب ​​العصبيةulations 6، وما إلى ذلك، تقوم كل الدراسات في المختبر على خلايا المستزرعة نأت على 2D الشبكات العصبية. هذا النهج يؤدي إلى التبسيط فيما يتعلق (في جوهرها 3-الأبعاد، 3D) نظام في الجسم الحي: (ط) في 2D هي بالارض نموذج، somata والنمو الأقماع وثمرة المحاور-التشعبات لا يمكن أن تنتشر في كل الاتجاهات 7. (ب) نمطية 2D في المختبر شبكات المعرض ديناميات الكهربية التي تهيمن عليها تنفجر نشاط يشمل معظم الخلايا العصبية للشبكة 8.

مؤخرا، تم وضع حلول مختلفة للسماح للبناء في المختبر فصل 3D الشبكات العصبية. تتكون فكرة مشتركة في خلق سقالة حيث يمكن للخلايا العصبية تنمو بطريقة 3D. لا يمكن أن تتحقق هذه سقالة مع المواد الهلامية البوليمر والمصفوفات التي يسهل اختراقها الصلبة 13/09. من خلال استغلال الخواص الميكانيكية للبوليمرات، فمن الممكن تضمين الخلايا داخل تساهياكل البريد عن طريق تحديد كتلة موحدة من الثقافات 3D من neurospheres 11. الميزة الرئيسية لهذا النهج هي ملك الميكانيكية الصارمة للneurospheres 9،12. ومع ذلك، فإن هذه المواد المسامية محدودة، وأنها لا نضمن هجرة الخلايا داخل المصفوفة. للتغلب على هذا العائق، حلا ممكنا يتكون تشريح المصفوفة إلى 'وحدة' وحدات في. لسوء الحظ، يمكن أن حجم وشكل تنوع الجسيمات تعوق التعبئة في الهياكل الطبقات العادية. في 7، كولين وزملاء العمل بتصميم بناء الخلايا العصبية 3D تتكون من الخلايا العصبية و / أو النجمية ضمن الخلية سقالة القائم على المصفوفة النشطة بيولوجيا. هذه الأنسجة العصبية المهندسة سمحت في التحقيقات المختبر لدراسة ومعالجة استجابات العصبية الحيوية داخل البيئات الصغرى 3D. يتكون هذا النموذج من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية توزع في جميع أنحاء المصفوفة خارج الخلية (ECM) و / أو السقالات هيدروجيل (500-600 ميكرون سميكة). في هذا التعاونتم العثور على ndition، وبقاء الخلية المثلى (أكبر من 90٪) من خلال طلاء الخلايا في مناطق ذات كثافة النهائية حول 3750 - 5000 خلية / ملم 3. وتجدر الإشارة إلى أن هذه القيمة كثافة أقل بكثير من واحد في حالة في الجسم الحي، حيث الكثافة خلية من خلايا القشرة مخ الفأر حوالي 90000 خلية / ملم 3 14. للتغلب على هذا القيد Pautot وزملاء العمل 15 حققت 3D في المختبر نظام حيث يتم التحكم في كثافة الخلايا والاتصال بالشبكة تشبه في ظروف الجسم الحي في حين تمكن في الوقت الحقيقي التصوير من الشبكة. عمليا، يقوم هذا الأسلوب على مفهوم فصل الخلايا العصبية مثقف هي قادرة على النمو على بلي السيليكا. توفر هذه الخرز سطح نمو كبيرة بما يكفي لأجسام الخلايا العصبية على الالتزام وarborizations على النمو، وناضجة، تمديد، وتحديد الاتصالات متشابك على الخلايا العصبية الأخرى. هذا الأسلوب يستغل خصائص التجمع العفوي من الخرز فرقت أحادية لFOالطبقات جمهورية مقدونيا 3D صفائف سداسية تحتوي على مجموعات فرعية متميزة من الخلايا العصبية في طبقات مختلفة مع اتصال مقيدة بين الخلايا العصبية في حبات مختلفة. كانت كثافة الخلايا التي تحققت مع هذا الأسلوب عن 75000 خلية / مم 3.

في الآونة الأخيرة، ونحن تكيفت طريقة Pautot في الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف 16: وتظهر النتائج أن النشاط الكهربية 3D يعرض ذخيرة واسعة من الأنشطة من واحد التي أعربت عنها الشبكات 2D. ثقافات ناضجة 3D يحمل ديناميكية معززة فيه كل انفجار شبكة وعشوائي تصاعد النشاط جنبا إلى جنب. وبالمثل، تانغ Schomer وزملاء العمل 17 أدرك سقالة مسامية على البروتين والحرير الذي يحافظ على الثقافة القشرية الأولية في المختبر لعدة أشهر، وسجلت النشاط الكهربية عن طريق التنغستن القطب.

في هذا العمل، والإجراءات التجريبية لبناء الشبكات العصبية 3D بالإضافة إلى الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف ويمكن وصفها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتمت الموافقة على بروتوكول تجريبي بموجب التشريع الأوروبي رعاية الحيوان (2010/63 / EU)، من قبل وزارة الصحة الإيطالية وفقا للDL 116/1992 وفقا للمبادئ التوجيهية للجامعة جنوى (بروت. N. 13130، مايو 2011). تم بذل كل الجهود للحد من عدد الحيوانات للمشروع والتقليل من معاناتهم.

1. إعداد المواد ويدعم

  1. بناء قالب لبناء PDMS (بولي ميثيل-Siloxane) القيد عن طريق CNC (الكمبيوتر التحكم العددي) آلة الطحن. ويتحقق هذا العفن في البولي مع الاسطوانة المركزية في تترافلوروإيثيلين (PTFE). هذه المواد يسمح لاستخراج أسهل من القناع مرة واحدة وقد تصلب PDMS.
    ملاحظة: تصميم القالب تم يؤديها بمساعدة الحاسوب التصميم (CAD) ومن ثم تسليمها إلى آلة طحن CNC.
  2. إعداد المطاط الصناعي PDMS. PDMS هو بوليمر عضوي. وهو يتألف من عنصرينوكيل علاج والبوليمر. مزجها من قبل نسبة حجم 01:10، جزء واحد من وكيل علاج وتسعة أجزاء من البوليمر. وضع هذين العنصرين في طبق بيتري، ويهز إدراج المزيج في فراغ الغرفة لمدة 10 دقيقة للقضاء على فقاعات الهواء. 3 غرام من PDMS كافية لعقبة واحدة.
  3. بناء القيد PDMS. إدراج مادة PDMS في أبلى ووضعها في الفرن لمدة 30 دقيقة في 120 درجة مئوية. القيد PDMS ديه على شكل اسطوانة مثالية مع القطر الخارجي والداخلي 22.0 و 3.0 ملم على التوالي وارتفاع 650 ميكرون.
  4. قبل يوم من الطلاء، واثنين من قناع لمنطقة نشطة من المصفوفات الدقيقة الكهربائي (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) عن طريق منتاش تحت stereomicroscope وتعقيم قناع PDMS في الفرن على 120 درجة مئوية.
  5. تعقيم بلي زجاجي دقيق (القطر الاسمي من 40 ± 2 ميكرون، شهادة قطر متوسط ​​42.3 ± 1.1 ميكرون) في 70٪ من الإيثانول لمدة 2 ساعة في قارورة المخروطية وتدوير EVريها 30 دقيقة للكشف عن بلي.
  6. إزالة حل الإيثانول من القارورة وشطف بلي مرتين بالماء المعقم.
  7. شرط الجزء المركزي من منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا محددة بواسطة قناع PDMS (قطر يساوي 3.0 مم) مع 24 ميكرولتر من محلول خليط من بولي-D-ليسين و laminin في 0.05 ميكروغرام / مل.
  8. معطف بلي مع بروتينات الالتصاق، Laminin وبولي-D-ليسين في 0.05 ميكروغرام / مل وترك لهم بين عشية وضحاها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، للحصول على الشبكة العصبية مستقرة وطويلة الأمد.
  9. إزالة عوامل التصاق كلا من السطح الزجاجي لMEA ومن بلي زجاجي دقيق. نضح ما يقرب من 95٪ من الحل طلاء مع ماصة وتطبيق volume- صغيرة 24μl- من الماء المعقم على سطح MEA. نضح مرة أخرى أكثر من 95٪ من المياه، والسماح للMEA الجافة تحت غطاء محرك السيارة الصفحي لمدة 1 ساعة قبل طلاء الخلايا.
    ملاحظة: في حالة بلي بدلا من ذلك، نضح طلاءحل وجعل غسل الأولى مع الماء المعقم وثانية واحدة مع المتوسط ​​القاعدية وملحقها مثل B27، من أجل تلطيف سطح الزجاج حيث سيتم مطلي الخلايا العصبية. لا تدع بلي الجافة. تركها في تعليق في مستنبت داخل القارورة.
  10. توزيع، عن طريق ماصة -200 μl-، تعليق بلي المعالجة (حوالي 32،000) على طبق من ذهب multiwell مع إدراج غشاء (المسام قطرها 0.4 ميكرون) حيث سيتم تجميع الذاتي تشكيل طبقة موحدة.
  11. ملء كل بئر من الغشاء مع 0.5 مل من المتوسط ​​وضعه في الحاضنة (T = 37.0 درجة مئوية، CO 2 = 5٪) حتى الخلايا العصبية على استعداد لتكون مطلية (3.2).

2. تشريح الأجنة وتفكك النسيج

  1. بيت الكبار إناث الفئران (200-250 ز) في درجة حرارة ثابتة (22 ± 1 درجة مئوية) ورطوبة نسبية (50٪) في إطار جدول زمني للضوء الظلام العادي (الضوء على 07:00 حتي 07:00) فيمنشأة الحيوان. ضمان أن المواد الغذائية وهي المياه المتاحة بحرية.
  2. تخدير الفئران الإناث الحوامل بعد 18 يوما من وضع (E18) باستخدام 3٪ الأيزوفلورين. ثم، التضحية الحيوانية خلع عنق الرحم.
  3. إزالة الحصين من كل جنين فأر ووضعها في محلول ملحي متوازن الجليد الباردة هانك دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+. في يوم 18 من الحصين التنمية وأنسجة القشرة لينة جدا ولست بحاجة إلى أن تقطع الى قطع صغيرة. مزيد من التفاصيل يمكن الاطلاع على 18،19.
  4. فصل الأنسجة في 0.125٪ من حل التربسين / هانك تحتوي على 0.05٪ من الدناز عن 18-20 دقيقة عند 37 ° C.
  5. إزالة الحل طاف مع ماصة باستور ووقف الهضم الأنزيمي بإضافة المتوسطة مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) لمدة 5 دقائق.
  6. إزالة المتوسطة مع FBS ويغسل مرة واحدة مع المتوسط ​​مع ملحقها، 1٪ L-الجلوتامين، جنتاميسين 10 ميكروغرام / مل. إزالة مرة أخرى على المدى المتوسط ​​مع نقطة باستورETTE وإعادة ملء مرة أخرى مع كمية صغيرة (500 ميكرولتر) من متوسط ​​النمو مع ملحقها، 1٪ L-الجلوتامين، جنتاميسين 10 ميكروغرام / مل.
  7. فصل بيليه الأنسجة ميكانيكيا مع ماصة باستور الضيقة حتى تعليق حليبي الخلايا هو واضح. ليس من الضروري أن أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية.
  8. تمييع كمية صغيرة من تعليق الخلية مع متوسط ​​النمو للحصول على الحجم النهائي من 2.0 مل. عد تركيز الخلوية التي تم الحصول عليها مع غرفة عدادة الكريات. تمييع هذا التركيز في 1: 5 من أجل الحصول على تركيز الخلية المطلوبة من 600-700 خلية / ميكروليتر.

3. خلية التصفيحات

  1. لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة حوالي 2000 خلية / ملم 2 على منطقة نشطة للMEA، التي يحددها القيد PDMS لإنشاء شبكة العصبية 2D.
    ملاحظة: كل الحصين يحتوي على حوالي 5 × 10 5 خلايا (1 × 10 6 لجنين واحد). تشريح 6 الأجنة للحصول على المبلغ الإجمالي لل6 × 106 الخلايا في 2 مل، وتركيز قدر من 3000 خلية / ميكرولتر. تمييع هذا التركيز في 1: 5 من أجل الحصول على تركيز الخلية المطلوبة وصفيحة حول 600-700 خلية / ميكروليتر. إذا كانت المنطقة MEA محدد بواسطة القيد PDMS حوالي 7.065 مم 2، والعدد الكلي للخلايا مطلي 600 خلية / ميكرولتر × 24 ميكرولتر = 14،400 الخلايا، وكثافة الأخيرة من 2038 خلية / ملم 2.
  2. وضع أجهزة MEA في حاضنة مع ترطيب CO 2 الغلاف الجوي (5٪) عند 37 درجة مئوية.
  3. توزيع 160 ميكرولتر من تعليق مع تركيز خلية من خلايا 600-700 / ميكرولتر (حوالي 100،000 الخلايا) على سطح أحادي الطبقة بلي المتمركزة داخل لوحات multiwell لاستكمال خطوة تمهيدية لبناء ثقافة ثلاثية الأبعاد. وضع لوحات multiwell في الحاضنة مع ترطيب CO 2 الغلاف الجوي (5٪) عند 37 درجة مئوية.

البناء 4. 3D الشبكة العصبية

  1. 6-8 ساعة بعد الطلاء، ونقل تعليق (بلي مع الخلايا العصبية) من لوحات multiwell بعناية فائقة داخل منطقة محددة من قبل القيد PDMS باستخدام ماصة مجموعة لحجم حوالي 30-40 ميكرولتر. بعد كل عملية تحويل، الانتظار لمدة نصف دقيقة، للسماح للبلي في التجمع الذاتي في هيكل مدمج سداسية.
  2. مرة واحدة يتم إيداع جميع الطبقات وعفوية تجميعها، إعادة ملء مع انخفاض كبير حوالي 300 ميكرولتر من المتوسطة الجزء العلوي من منطقة محددة من قبل القيد PDMS.
  3. وضع هيكل 3D بالإضافة إلى MEA في حاضنة (T = 37.0 درجة مئوية، CO 2 = 5٪) لمدة 48 ساعة قبل أن يضيف الحجم النهائي (حوالي 1 مل) من النمو مستنبت مع ملحقها.
    ملاحظة: النظر في عدد من الخرز على لوحات multiwell مع إدراج غشاء (30000) وعدد من الخرز على طبقة واحدة على الجهاز MEA (6000). ويتكون هيكل 3D الناتجة من 5 طبقات من ميلcrobeads والخلايا. مع الأخذ بعين الاعتبار أن الشبكة العصبية 3D ليست مثالية هندسيا، يمكن أن يتألف هيكل 3D الناتجة من 5-8 طبقات.
  4. اليوم بعد الطلاء، إضافة إلى الحجم النهائي من المتوسط ​​(حوالي 900 ميكرولتر) داخل الحلبة MEA بعناية. الحفاظ على الثقافات 3D في ترطيب CO 2 الغلاف الجوي (5٪) عند 37 درجة مئوية لمدة 4-5 أسابيع. استبدال نصف المتوسط ​​مرة واحدة في الأسبوع.

5. متحد البؤر المجهري شراء

  1. إصلاح العينات البيولوجية إلى مرحلة المجهر في حامل. ضبط الليزر (الأرجون، 496-555 نانومتر)، وسرعة المسح الضوئي (400 هرتز) الذي لالتقاط الصور، وكسب وتعويض (-0.3٪) من PMT لكل صورة لالتقاط الصحيح مرشح الانبعاثات وعرض النطاق الترددي من أجل لتجنب التشبع وزيادة إشارة إلى نسبة الضوضاء. تقارير قسم النتائج والقيم المستخدمة للحصول على الصور من الشكل 4.
  2. لاقتناء ض -stack تسلسل، والتنوبالحادي وتحديد، وقيمة موقف Z من أعلى وأسفل طبقة من العينة، ثم حدد حجم الخطوة إلى جعل عملية الاستحواذ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. في هذا الإجراء التجريبي، لعبت دورا ذات الصلة من قبل بلي التي تحدد سقالة الميكانيكية لنمو الشبكة العصبية 3D أرقام 1A و B عرض الترتيب من بلي (القطر الاسمي من 40 ± 2 ميكرون، شهادة يبلغ متوسط ​​قطر 42.3 ± 1.1 ميكرون) في الطائرة. خصوصية هذه الهياكل هي أن بلي عفويا التجمع الذاتي تعريف الهندسة سداسية المدمجة (1B الشكل وC). السقالة ولدت حتى تضمن سطح نموا ثابتا لneurites التي والفضاء الخلالي كبيرة بما فيه الكفاية لتبادل التمثيل الغذائي للأجسام الخلايا. ه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا العمل، وهو تجريبية جديدة في منصة المختبر تتكون من 3D هندستها الثقافات العصبية بالإضافة إلى تم تقديمه الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف لشبكة الكهربية. وقد تم استخدام بلي كما سقالة للسماح ثمرة التهاب الأعصاب على طول ض -axis مصممة لتكون متكاملة مع MEA مستو. في هذه الطريقة، والحصول على نتائج نظام الجزئي في المختبر في نموذج 3D صحيح وموثوق بها لدراسة ديناميات الكهربية الناشئة 16.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أشكر جورجيو كرليني للدعم الفني في تطوير بنية الحبس وDOTT. أورنيلا LoBrutto لمراجعة شاملة للمخطوطة. تلقت البحوث المؤدية إلى هذه النتائج بتمويل من البرنامج الإطاري ال 7 للاتحاد الأوروبي (ICT-FET FP7 / 2007-2013، FET يونغ مخطط المستكشفين) بموجب اتفاقية منحة 284772 BRAIN BOW (www.brainbowproject.eu).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
LamininSigma-AldrichL20200.05 & micro; جم / مل
بولي دي ليسينسيجما ألدريتشP64070.05 ومايكرو ؛ جم / مل
TrypsinGibco25050-0140.125٪ مخفف 1: 2 في HBSS w \ o CA++< / sup> ، MG++< / sup>
DNAaseSigma-AldrichD50250.05٪ مخفف   في محلول هانكس
NeurobasalGibco Invitrogen21103049وسط ثقافة
B27Gibco Invitrogen175040442٪ متوسط الإمداد
مصل الأبقار الجنيني (FBS)سيجما ألدريتشF-244210٪
Glutamax-I & nbsp ؛جيبكو350500380.5 ملي مولار
جنتاميسينسيجما-ألدريتشG.12725 مجم / لتر
بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS)كورنينج سيجما481939عامل معالجة ومصفوفات البوليمر
الكهربائيةالدقيقة متعددة القنوات (MCS)60MEA200 / 30-Ti-prMEA مع: شبكة القطب الكهربائي 8x8 ؛ تباعد القطب الكهربائي وقطره 200 و 30 & م ، على التوالي ؛ حلقة بلاستيكية بدون خيط
MicrobeadDistrilab-Duke Scientific9040  1 غرام جزء زجاجي بحجم STDS 40 & micro ؛ م
لوحات ترانسويلكوستار سيجماCLS 3413متعددة الآبار مع إدراج غشاء (قطر 6.5 مم مسامي 0.4 وميكرو ؛ م)
HBSS مع Ca < sup > + + < / sup> ، Mg < sup> + + < / sup>   ؛Gibco Invitrogen14175-052
Hanks Buffer Solution سيجما H8264
تفلونسيجما430935-5Gبولي تترافلورو إيثيلين
الجرذسبراغ داوليويستار الجرذ
المجهري متحد البؤر تستقيملايكاTCS SP5 AOBS
20.0x0.50 هدف الماءلايكاHCX APO L U-V-I 
40.0x0.80 هدف المياهلايكاHCX APO L U-V-I 
25.0x0.95 الهدف المائيلايكاHCX IRAPO L

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
  2. Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
  3. Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
  4. Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
  5. Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
  6. Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
  7. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
  8. Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
  9. Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
  10. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
  11. Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
  12. Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
  13. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
  14. Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
  15. Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
  16. Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
  17. Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
  18. Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cell. , 2nd edition, MIT Press. (1998).
  19. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
  20. Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
  21. Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
  22. 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PDMS

مقالات ذات صلة