يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نموذج الثقافة 3D-الهرمون تستجيب للالغدة الثديية الظهارة الإنسان
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تتأثر عملية التشكل الظهاري للثدي بالهرمونات. تقتصر دراسة عمل الهرمونات على ظهارة الثدي باستخدام الثقافات ثنائية الأبعاد على تكاثر الخلايا ونقاط نهاية التعبير الجيني. ومع ذلك ، في الكائن الحي ، يحدث تشكل الثدي في بيئة ثلاثية الأبعاد. تساعد أنظمة الاستزراع ثلاثية الأبعاد على سد الفجوة بين زراعة الخلايا أحادية الطبقة (2D) وتعقيد الكائن الحي. هنا ، نصف نموذج ثقافة ثلاثي الأبعاد لظهارة الثدي البشري مناسب لدراسة عمل الهرمونات. يستخدم خط الخلايا الظهارية للثدي البشري المستجيب للهرمونات المتاح تجاريا ، T47D ، وكولاجين ذيل الفئران من النوع 1 كمصفوفة. يستجيب نموذج الثقافة ثلاثي الأبعاد هذا للهرمونات الشعاعية الرئيسية: الاستراديول والبروجستين والبرولاكتين. يمكن ملاحظة تأثير هذه الهرمونات على التشكل الظهاري بعد علاج لمدة أسبوع أو أسبوعين وفقا لنقطة النهاية. يمكن حصاد الثقافات ثلاثية الأبعاد لتحليل التشكل الظهاري وتكاثر الخلايا والتعبير الجيني.
المقدمة
على عكس الثقافات 2D القياسية، زراعة الخلايا 3D نماذج بديلة تسمح لدراسة سلوك الخلايا الظهارية في سياق ذي صلة من الناحية الفسيولوجية، واحدة تشبه الأنسجة. ساعدت الثقافات 3D من الغدة الثديية توضيح العديد من جوانب التنمية الغدة الثديية والأورام. ومع ذلك، فإن معظم نماذج الثقافة 3D المتاحة حاليا هي غير مناسب لدراسة عمل الهرمونات لأن خطوط الخلايا الظهارية البشرية المستخدمة للقيام بهذه المهمة وتفتقر مستقبلات هرمون التعبير 6،7،9.
هنا، نحن تصف نموذج الثقافة 3D من ظهارة الثدي الإنسان التي هي مناسبة لدراسة عمل الهرمونات 12. يستخدم هذا النموذج متاح تجا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الكواشف
- حل promegestone الاصطناعية progestagen (R5020) و 17 β استراديول (E2) في الإيثانول لجعل 10 -3 الحلول الأسهم M. حل البرولاكتين في الماء منزوع الأيونات المقطر لجعل 1 ملغ / مل محلول المخزون. حل مضاد الإستروجين ICI 182780 في DMSO لجعل M حل الأوراق المالية 10 -2. تخزين هذه الحلول في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
- الفحم ديكستران (CD) تجريد المصل وCDFBS المتوسطة:
- للح....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويلخص الشكل 1 إجراءات إعداد الثقافات 3D حساسة لهرمون. لوحظ الهياكل الظهارية في يتصاعد كاملة من المواد الهلامية تربيتها لمدة 2 أسابيع في وجود E2 حده، وبالاشتراك مع هرمونات أخرى. خلايا فقط واحدة أو مجموعة من 2-3 خلايا موجودة عند إضافة أي الهرمونات إلى مستنبت (CDFBS المتوسطة) (الشكل 2). تخدم هذه الحالة كوسيلة لمراقبة سلبية.
الخلايا في الهياكل شكل ثقافة 3D التي تختلف في الشكل والحجم،.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا ، نصف نموذج ثقافة ثلاثي الأبعاد حساس للهرمونات لاختبار عمل الهرمونات على ظهارة الثدي. يمكن تقييم الاستجابة للهرمونات في مورفولوجيا الأنسجة وتكاثر الخلايا ومستويات التعبير الجيني 12. أحد قيود هذه التقنية هو أن التصور خلال فترة الاستزراع يقتصر على الفحص المجهري الضوئي حيث تزرع الثقافات في صفيحة سفلية بلاستيكية. يمكن تكييف نظام الثقافة ثلاثي الأبعاد مع الألواح السفلية الزجاجية للسماح بالتصوير المباشر للثقافات 1.
يبدو أن الطريقة التي يتم بها الحفاظ على الخلايا حاسمة للاحت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نحن نقدر المساهمات التحريرية التي كتبها شيريل Schaeberle. وأيد هذا البحث من قبل آفون المنح # 02-2009-093 و02-2011-095، ومعهد علوم الصحة البيئية / المعاهد الوطنية للصحة ES 08314 لهيئة علماء المسلمين. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية أو المعاهد الوطنية للصحة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 12 بئر ألواح زراعة الأنسجة (فالكون) | فيشر سينتيفيك | 08-772-29 | |
| 15 مل أنابيب مخروطية من البوليسترين | فيشر سيانتيفيك | 14-959-49D | |
| الفحم المنشط | سيجما | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| كولاجيناز ، النوع 3 | ورثينجتون | S0C11784 | |
| مجهر متحد البؤر | Zeiss | LSM510 | مجهز بالليزر HeNe 633nm |
| Dextran, T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, بدون فينول أحمر | Life Technologies | 11339-021 | وسائط خالية من الفينول الأحمر للاستخدام الهرموني |
| DMEM ، جلوكوز منخفض ، بيروفات ، بدون جلوتامين ، لا فينول أحمر | Life Technologies | 11054-020 | وسائط خالية من الفينول الأحمر للاستخدام الهرموني |
| 17-& بيتا - استراديول | EMD Millipore | 3301 | مذاب في الإيثانول |
| إيثانول | Koptec | V1001 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Hyclone | SH30070.03 | للاستخدام مع الهرمونات ، يجب تجريد الفحم ديكستران ؛ |
| المرشحات (115 مل) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 ميكرون, على التوالي |
| الفورمالين ، 10٪ | فيشر العلمي | SF93-20 | |
| L-الجلوتامين (200 ملم) | لايف تكنولوجيز | 25030-081 | |
| ICI 182،780 (fulvestrant) | سيجما ألدريتش | I4409-25MG | مذاب في DMSO |
| Microtome ؛ | Leica | RM2155 | |
| وسائط تضمين الأنسجة | ماكورميك Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | مذاب في 10 مل من الماء المقطر منزوع الأيونات |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| فوسفات محلول ملحي مخزن درجة الحموضة 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | مذاب في الماء المقطر منزوع الأيونات |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | مذاب في |
| الإيثانول ذيل الفئران الكولاجين ؛ | كورنينج | 354236 | قد تحتوي القطع على تركيزات متفاوتة ، لاحظ وفقا لذلك |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| معالج الأنسجة شبه المغلقة | Leica | TP1020 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster فرشاة مضادة للكهرباء الساكنة | Amstat | C3500 | |
| Stripette الماصات المصلية | كورنينج | 4101 | |
| قوارير T-25 Corning | 430168 | ||
| كاسيت مناديل | فيشر Scientific | 15-200-403E | |
| قوارير ويتون ، زجاج ، 20 مل | فيشر ساينتفيك | 03-341-25D & nbsp ؛ | |
| زيلين | VWR | 95057-822 |
المراجع
- Barnes, C., et al. From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time. PLoS ONE. 9, e93325(2014).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
