مقالة منهجية

طرق لمنع البكتيرية Pyomelanin الإنتاج وتحديد الزيادة المقابلة في الحساسية للإجهاد التأكسدي

7.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53105

⸱

أغسطس 31, 2015

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Wisconsin Milwaukee

في هذه المقالة

ملخص

ينتج عن إنتاج البيوميلانين البكتيري زيادة مقاومة الإجهاد التأكسدي والضراوة. نبلغ عن التقنيات التي يمكن استخدامها لتحديد تثبيط إنتاج البيوميلانين وفحص الزيادة الناتجة في الحساسية للإجهاد التأكسدي في البكتيريا ، وكذلك تحديد الحد الأدنى لتركيز المضادات الحيوية المثبطة (MIC).

الملخص

Pyomelanin هو صبغة حمراء بنية خارج الخلية تنتجها العديد من الأنواع البكتيرية والفطرية. هذه الصبغة مشتقة من مسار تقويض التيروزين وتساهم في زيادة مقاومة الإجهاد التأكسدي. يتم تقليل إنتاج البيوميلانين في Pseudomonas aeruginosa بطريقة تعتمد على الجرعة من خلال العلاج ب 2-[2-nitro-4- (trifluoromethyl) benzoyl] -1،3-cyclohexanedione (NTBC). نصف طريقة المعايرة باستخدام تركيزات متعددة من NTBC لتحديد تركيز الدواء الذي سيقلل أو يلغي إنتاج البيوميلانين في البكتيريا. طريقة المعايرة بالتحليل الحجمي لها نتيجة يمكن قياسها بسهولة ، وهي انخفاض ملحوظ في إنتاج الصبغة مع زيادة تركيزات الأدوية. نصف أيضا طريقة صفيحة ميكروتيتر لفحص الحد الأدنى لتركيز المضادات الحيوية المثبطة (MIC) في البكتيريا. تستخدم هذه الطريقة الحد الأدنى من الموارد ويمكن توسيع نطاقها بسهولة لاختبار العديد من المضادات الحيوية في صفيحة ميكروتيتر واحدة لسلالة واحدة من البكتيريا. يمكن تكييف مقايسة MIC لاختبار تأثيرات المركبات غير المضادة للمضادات الحيوية على نمو البكتيريا بتركيزات محددة. أخيرا ، نصف طريقة لاختبار الحساسية البكتيرية للإجهاد التأكسدي عن طريق دمج H2O2 في ألواح أجار واكتشاف تخفيفات متعددة من البكتيريا على الألواح. يشار إلى الحساسية للإجهاد التأكسدي من خلال التخفيضات في عدد المستعمرة وحجمها للتخفيفات المختلفة على الألواح التي تحتوي على H2O2 مقارنة بالتحكم بدون H2O2. يستخدم اختبار لوحة بقعة الإجهاد التأكسدي الحد الأدنى من الموارد والتركيزات المنخفضة من H2O2. الأهم من ذلك ، أن لديها أيضا قابلية جيدة للتكاثر. يمكن تكييف مقايسة اللوحة الموضعية هذه لاختبار الحساسية البكتيرية للمركبات المختلفة عن طريق دمج المركبات في ألواح أجار وتوصيف نمو البكتيريا الناتج.

المقدمة

Pseudomonas aeruginosa هي بكتيريا سالبة الجرام تنتج مجموعة متنوعة من الأصباغ بما في ذلك البيوميلانين ، وهي صبغة حمراء بنية تساعد على توفير الحماية من الإجهاد التأكسدي1-4 وتربط مجموعة متنوعة من المركبات ، بما في ذلك المضادات الحيوية الأمينوغليكوزيدية5-7. يحدث إنتاج البيوميلانين بسبب عيب في مسار تقويض التيروزين4،8 ، إما من خلال عمليات حذف أو طفرات في الجين الذي يشفر homogentisate 1،2-dioxygenase (HmgA) 1،9 أو من خلال اختلالات في الإنزيمات المختلفة في المسار10. يتراكم Homogentisate بسبب تعطيل HmgA ، ويتم إفرازه وتأكسده لتكوين البيوميلانين11. يمكن إلغاء إنتاج البيوميلانين أو تقليله بطريقة تعتمد على الجرعة من خلال العلاج بمبيد الأعشاب 2- [2-nitro-4- (trifluoromethyl) benzoyl] -1،3-cyclohexanedione (NTBC) 12 ، الذي يثبط 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (Hpd) في مسار تقويض التيروزين13. Hpd مطلوب لتشكيل متجانس ، وبالتالي البيوميلانين11.

نصف بالتفصيل ثلاث تقنيات كانت مهمة في دراساتنا لعلاج NTBC للبيوميلانين المنتجة سلالات من المتصورة الزائجارية. تشمل هذه التقنيات معايرة NTBC لتحديد التركيزات التي ستلغي أو تقلل من إنتاج البيوميلانين في السلالات المنتجة للبيوميلانين المختبرية والسريرية ، وتحديد الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) للمضادات الحيوية عند معالجة البكتيريا ب NTBC ، والحساسية الناتجة للإجهاد التأكسدي مع علاج NTBC.

يخدم مقايسة المعايرة بالتحليل الحجمي التي طورناها غرضين. أولا ، سيسمح الفحص للمستخدم بتحديد ما إذا كان NTBC يمكن أن يلغي أو يقلل من إنتاج البيوميلانين في البكتيريا قيد الدراسة وعند أي تركيزات. سيسمح ذلك للمستخدم بتحديد الحساسية ل NTBC ، نظرا لأن سلالات مختلفة من البكتيريا قد يكون لها حساسيات مختلفة لهذا المركب ، كما لوحظ في P. aeruginosa12. ثانيا ، سيسمح اختبار المعايرة بالتحليل الحجمي NTBC للمستخدم بتحديد التركيز المناسب ل NTBC لاستخدامه في المقايسات اللاحقة ، مثل MIC للمضادات الحيوية ومقايسات الاستجابة للإجهاد التأكسدي ، إذا كان الهدف هو إلغاء أو تقليل إنتاج البيوميلانين وتحديد تأثيرات تقليل الصبغة.

يعمل مقايسة المعايرة بالتحليل الحجمي لأنه يمكن ملاحظة اختلاف واضح في إنتاج البيوميلانين في السلالات المعالجة ب NTBC والاختلافات في إنتاج البيوميلانين تعتمد على الجرعة12. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق هذه التقنية لدراسة المركبات الأخرى التي قد تقضي على إنتاج الصبغة في البكتيريا أو تعززها.

تستخدم < p class = 'jove_content'> MICs للمضادات الحيوية لتحديد حساسية البكتيريا للمضادات الحيوية. هناك عدة طرق لتحديد MICs ، بما في ذلك ألواح تخفيف الأجار وتخفيفات المرق14. يمكن إجراء تخفيفات المرق في أنابيب اختبار صغيرة أو في صفيحة ميكروتيتر 96 بئرا. ستسمح طريقة لوحة الميكروتيتر لتحديد MIC الموضحة هنا للمستخدم باختبار مجموعة واسعة من المضادات الحيوية باستخدام الحد الأدنى من الموارد. يوفر الاختبار قابلية التكاثر والمرونة في عدد المضادات الحيوية والسلالات التي تم اختبارها بهذه الطريقة. بالإضافة إلى ذلك ، مع دمج NTBC في الفحص ، يمكن للمستخدم تحديد ما إذا كان التخلص من إنتاج البيوميلانين أو تقليله يغير حساسية المضادات الحيوية في البكتيريا التي تنتج البيوميلانين.

يمكن اختبار الاستجابة البكتيرية للإجهاد التأكسدي بعدة طرق. الطرق الأكثر شيوعا الموصوفة هي إما الأعداد القابلة للتطبيق للبكتيريا المعرضة للإجهاد التأكسدي لفترة من الوقت1 ، أو فحوصات انتشار قرص الإجهاد التأكسدي15. تميل هذه الطرق إلى استخدام تركيزات عالية من الضغوطات التأكسدية لفحص آثار الإجهاد التأكسدي في البكتيريا ويمكن أن تكون النتائج متغيرة تماما بين التكرارات البيولوجية. يميل اختبار العد القابل للتطبيق أيضا إلى استخدام لوحات أجار أكثر من الطرق الأخرى. يستخدم اختبار اللوحة الموضعية الذي نصفه تركيزات منخفضة من H2O2 ويسمح للمستخدم باختبار استجابة الإجهاد التأكسدي لسلالات متعددة باستخدام الحد الأدنى من الألواح. كما يمكن تكرار الاختبار باستمرار بين التكرارات التقنية والبيولوجية. نظرا لأن البيوميلانين يشارك في مقاومة الإجهاد التأكسدي ، فإن دمج NTBC في الفحص يسمح للمستخدم بتحديد آثار التخلص من إنتاج البيوميلانين على مقاومة الإجهاد التأكسدي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام، والمضادات الحيوية، و2- [2-نيترو-4- (ترايفلوروميثيل) بيروكسايد] -1،3-cyclohexanedione (NTBC)

  1. جعل LB مرق (1٪ تريبتون، و 0.5٪ مستخلص الخميرة، 0.25٪ كلوريد الصوديوم في H 2 O) وقسامة في أحجام مناسبة. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف. يخزن في درجة حرارة الغرفة.
  2. جعل 100 مل LB أجار (1٪ تريبتون، و 0.5٪ مستخلص الخميرة، 0.25٪ كلوريد الصوديوم، 1.5٪ أجار في H 2 O) في 250 مل القوارير. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. ضمان آغار ذاب قبل صب في لوحات.
    ملاحظة: قوارير تحتوي على 100 مل من LB أجار سوف تسفر عن 4 لوحات. كمية LB أجار يمكن تغييرها لتتوافق مع عدد من لوحات اللازمة للفحص.
  3. جعل PBS (137 ملي كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4، 2 مم KH 2 PO 4) 16. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف أو الترشيح وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  4. إعداد الحلول الأسهم المضادات الحيوية للجنتاميسين، الكاناميسين، وهود التوبراميسين.
    1. إعداد تركيزات الأسهم المضادات الحيوية المناسبة لP. سلالات الزنجارية تحتوي على 100 ​​ملغ / مل جنتاميسين، 30 ملغ / مل الكانامايسين، و 10 ملغ / مل التوبراميسين. حل المضادات الحيوية في المياه، تعقيم فلتر (0.2 ميكرون)، وتخزينها في 4 درجات مئوية. تغيير المضادات الحيوية وتركيزات اعتمادا على البكتيريا التي شملتها الدراسة.
  5. إعداد الحلول الأسهم NTBC. حل 10 ملغ من NTBC في 400 ميكرولتر من DMSO. هذه تعطي تركيز 75.9 ملي NTBC. مخزن الحلول الأسهم NTBC في -20 ° C. حلول ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة حسب الحاجة.
    ملاحظة: مصادر مختلفة NTBC خلافات في الذوبان. تحديد الوسيلة المناسبة التي بحل NTBC بناء على توصيات الشركة الصانعة وضبط الخطوة 1.5 وفقا لذلك.

2. NTBC المعايرة من السلالات البكتيرية

  1. إعداد الثقافات بين عشية وضحاها من السلالات لفحصها. إضافة 2 مل مرق LB إلى 16 × 150 مم أنبوب اختبارالصورة (واحد لكل سلالة) وتطعيم مع 1 مستعمرة معزولة من كل سلالة. احتضان ليلا 37 درجة مئوية مع تهوية على محور دوار زراعة الأنسجة في حاضنة الهواء.
  2. في اليوم التالي، وإعداد المعايرة من NTBC في LB مرق. استخدام مجموعة الأولي 0-900 ميكرون NTBC منذ السلالات المختلفة لديها اختلافات في الحساسية للNTBC.
    1. إضافة 1 مل مرق LB إلى 4-5 أنابيب الاختبار (16 × 150 ملم) في سلالة.
    2. إضافة محلول المخزون NTBC (75.9 ملم) للأنابيب الاختبار (16 × 150 ملم) في مجموعة من تركيزات. انظر الجدول رقم 1 لتركيزات NTBC وكميات الأسهم المقابلة لإضافة إلى 1 مل من مرق LB.
  3. قياس OD 600 من الثقافات بين عشية وضحاها. غسل الثقافات قبل اتخاذ OD 600 قراءات للقضاء على pyomelanin الحاضر في وسائل الإعلام.
    1. غسل الثقافات بواسطة الطرد المركزي 1 مل من الثقافة في microcentrifuge في 16000 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف وأي خلايا مكعبات فضفاضة معوmicropipettor و resuspend بيليه خلية الصلبة في 1 مل LB.
  4. تطعيم أنابيب المعايرة في OD 600 0.05. حساب كمية ثقافة غسلها اللازمة لتطعيم الأنابيب.
    ملاحظة: استخدم الثقافات غسلها عن التطعيمات منذ pyomelanin يجب أن لا تكون موجودة.
  5. احتضان أنابيب المعايرة لنحو 24 ساعة على 37 درجة مئوية مع تهوية باستخدام ثقافة المدورة الأنسجة في حاضنة الهواء.
  6. تصوير أنابيب المعايرة ومقارنة إنتاج الصباغ داخل وبين سلالات لتحديد مقدار NTBC لاستخدامها في هيئة التصنيع العسكري والاكسدة المقايسات. استخدام OD 600 قراءات لتحديد مقدار pyomelanin في خلية ثقافة خالية طاف وتحديد كثافة الخلية.
    ملاحظة: نسبة OD 600 من pyomelanin في ثقافة طاف للخلايا يمكن أن تحسب لتحديد الاختلافات في إنتاج pyomelanin بعد العلاج مع NTBC.

3. المضادات الحيوية الدنيا Inhibiحزب المحافظين تركيز (MIC) الفحص في لوحات 96-جيدا

  1. إعداد الثقافات بين عشية وضحاها من السلالات التي سيتم اختبارها في LB مع وبدون NTBC.
    ملاحظة: يتم وصف هذا البروتوكول باستخدام مستوى تمثيلي من 300 ميكرومتر NTBC. يتم تحديد المستوى المناسب من NTBC لاستخدامها في الخطوة 2.6.
    1. إضافة 300 ميكرومتر NTBC إلى 2 مل LB. إضافة ما يعادل حجم سيارة (DMSO) إلى 2 مل LB للشرط لا NTBC.
    2. استخدام المسواك العقيمة، تلقيح الأنابيب مع واحد مستعمرة معزولة من البكتيريا. سوف تكون هناك ثقافة واحدة مع NTBC وثقافة واحدة دون NTBC لكل سلالة. احتضان ليلا 37 درجة مئوية مع تهوية باستخدام ثقافة المدورة الأنسجة في حاضنة الهواء.
  2. في اليوم التالي، وجعل LB + NTBC والحلول سيد LB + DMSO لإعداد مقايسة هيئة التصنيع العسكري. إضافة NTBC بتركيز 600 ميكرومتر لأن هذا سوف تضعف اثنين أضعاف عند إضافة اللقاح، مما أسفر عن تركيز النهائي من 300 ميكرومتر.
    1. لاختبار عنتيبي واحدأمام الأذن لسلالة واحدة، إضافة 600 ميكرومتر NTBC إلى 2 مل LB وتخلط لجعل الحل الرئيسي NTBC. إضافة ما يعادل حجم سيارة (DMSO) إلى 2 مل LB وتخلط لجعل أي حل سيد NTBC. استخدام هذه الحلول لإيجاد حلول الأسهم المضادات الحيوية فضلا عن إعداد سلسلة التخفيف في لوحات 96-جيدا.
      ملاحظة: إن الصياغات حل سيد تسفر عن حل إضافي لحساب الأخطاء pipetting ل. يمكن زيادتها الحلول سيد أعلى أو لأسفل كما هو مطلوب اعتمادا على عدد من المضادات الحيوية والسلالات التي تم اختبارها.
  3. إعداد الحلول للمضادات الحيوية في LB + NTBC أو LB + DMSO حلول الرئيسي.
    ملاحظة: يجب أن يكون تركيز المضادات الحيوية في هذه الحلول ضعف التركيز النهائي المطلوب. ينبغي حل ما يكفي لنقل 100 ميكرولتر إلى أربع آبار في لوحة 96-جيدا.
    1. إعداد جنتاميسين +/- NTBC حل السهم عند 64 ميكروغرام / مل. لجعل هذا الحل، إضافة 0.288 ميكرولتر من الأسهم الجنتاميسين (100 ملغ / مل) إلى 450ميكرولتر LB + NTBC أو حل سيد LB + DMSO.
      ملاحظة: الحد الأقصى لتركيز الجنتاميسين لP. الزنجارية PAO1 هو 32 ميكروغرام / مل.
    2. جعل كانامايسين +/- NTBC حل السهم عند 256 ميكروغرام / مل. لجعل هذا الحل، إضافة 3.84 ميكرولتر من الأسهم كانامايسين (30 ملغ / مل) إلى 450 ميكرولتر LB + NTBC أو LB + DMSO حلول الرئيسي.
      ملاحظة: الحد الأقصى لتركيز كانامايسين لP. الزنجارية PAO1 هو 128 ميكروغرام / مل.
    3. إعداد التوبراميسين +/- NTBC حل الأوراق المالية في 8 ميكروغرام / مل. لجعل هذا الحل، إضافة 0.36 ميكرولتر من الأسهم التوبراميسين (10 ملغ / مل) إلى 450 ميكرولتر LB + NTBC أو LB + DMSO حلول الرئيسي.
      ملاحظة: للحصول على P. الزنجارية PAO1، وأقصى تركيز التوبراميسين هو 4 ميكروغرام / مل.
      ملاحظة: المضادات الحيوية وتركيزات يمكن تعديلها للبكتيريا لفحصها.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من كل حل مضاد حيوي 2X إلى أربع آبار في لوحة 96-جيدا. وضع هذه الحلول في الصف A. لالامثلهه، ينبغي أن توضع الجنتاميسين في A1 من خلال A4، ينبغي أن توضع كانامايسين في A5 من خلال A8، وينبغي أن توضع التوبراميسين في A9 من خلال A12. انظر الشكل 1A لرسم تخطيطي لوحة 96-جيدا اقامة.
    ملاحظة: يمكن اختبار مضادات حيوية متعددة في لوحة واحدة، ولكن يجب اختبار سلالة واحدة فقط لكل لوحة للقضاء على احتمال انتقال التلوث من سلالات أخرى.
  5. إضافة 50 ميكرولتر من الحل الرئيسي LB + NTBC أو LB + DMSO إلى صفوف B خلال H من لوحة 96-جيدا. تأكد من أن لوحة واحد هو LB + NTBC ولوح واحد هو LB + DMSO. انظر الشكل 1A.
    1. استخدام LB + NTBC للمضادات الحيوية في LB + NTBC. استخدام LB + DMSO للمضادات الحيوية في LB + DMSO.
  6. باستخدام micropipettor إجراء عمليتين التخفيفات المسلسل أضعاف من المضادات الحيوية عن طريق نقل 50 ميكرولتر من الحل من صف إلى صف A B. مزيج الحل، تغيير نصائح الماصة، ونقل 50 ميكرولتر من الحل من صف إلى صف B C. كرر ل وremainiالصفوف نانوغرام. بعد إضعاف الصف G، وإزالة 50 ميكرولتر من الحل من هذا الصف ونبذ. استخدام الصف H باعتباره لا سيطرة للمضادات الحيوية لنمو البكتيريا. انظر الشكل 1B.
    ملاحظة: كل بئر في الصفوف من A إلى G يحتوي الآن على 50 ميكرولتر من المضادات الحيوية في LB + NTBC أو LB + DMSO في 2X تركيز النهائي المطلوب. الصف H يحتوي LB + NTBC أو LB + DMSO مع عدم وجود المضادات الحيوية.
  7. قياس OD 600 من الثقافات بين عشية وضحاها. غسل جميع الثقافات قبل اتخاذ OD 600 قراءات للقضاء على pyomelanin الحاضر في وسائل الإعلام.
    1. غسل الثقافات بواسطة الطرد المركزي 1 مل من الثقافة في microcentrifuge في 16000 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف مع micropipettor و resuspend بيليه خلية في 1 مل LB.
  8. تمييع الثقافات بين عشية وضحاها إلى 2.75x10 5 كفو / مل في LB.
    ملاحظة: افترض أن OD 600 وحدة واحدة هي ما يعادل 1X10 9 كفو / مل لP. الزنجارية. OD إلى كفو / مل التحويلات يمكن دifferent في البكتيريا الأخرى.
  9. إضافة 50 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية المخفف إلى البئر المناسب.
    ملاحظة: الثقافات التي تزرع في NTBC ينبغي أن يضاف إلى الآبار التي تحتوي ينبغي أن يضاف NTBC والثقافات التي تزرع في DMSO إلى الآبار التي تحتوي على DMSO. انظر الشكل 1B.
    1. إضافة البكتيريا إلى ثلاثة آبار لكل سلالة وتركيز المضادات الحيوية. إضافة 50 ميكرولتر من LB إلى البئر الرابع ليكون بمثابة الرقابة على التلوث الجرثومي. انظر الشكل 1B.
    2. استخدام micropipettor متعدد القنوات لتطعيم الآبار. ضمان الماصة النصائح بالقرب من قاع الآبار عند إضافة اللقاح لمنع تلوث الآبار المجاورة.
      ملاحظة: سيتم إضافة ثقافة البكتيرية إلى الآبار تمييع تركيزات المضادات الحيوية وNTBC اثنين أضعاف.
  10. تغطية لوحات 96-جيدا مع parafilm واحتضان ما يقرب من 24 ساعة على 37 درجة مئوية. احتضان لوحات 96-جيدا بشكل ثابت، في حاضنة الهواء.
  11. بحثلوحات لنمو البكتيريا في الآبار. هيئة التصنيع العسكري هو أدنى تركيز المضادات الحيوية التي لا ترى نمو البكتيريا لجميع مكررات ثلاثة من كل سلالة.
    1. بصريا فحص لوحة للنمو أو قراءة باستخدام قارئ مجموعة لوحة لOD ​​600.

4. بقعة لوحة الفحص لمؤكسد الاستجابة للضغط النفسي

  1. إعداد الثقافات بين عشية وضحاها من السلالات التي سيتم اختبارها في LB مع وبدون NTBC كما هو موضح في الخطوة 3.1.
  2. في اليوم التالي، وإعداد لوحات أجار LB التي تحتوي على H 2 O 2 هو من الضغوطات الأكسدة. وهناك مجموعة من H 2 O 2 تركيزات 0-1 مم هي نقطة انطلاق جيدة.
    1. إذابة قوارير أجار LB. وسائل الإعلام باردة إلى حوالي 50 درجة مئوية في درجة حرارة الغرفة.
    2. إضافة H 2 O 2 مباشرة إلى وسائل الإعلام تبريد في تركيزات المطلوب. قوارير دوامة لخلط. انظر الجدول رقم 2 لتركيزات H 2 O 2ومجلدات من H 2 O 2 المركزة لإضافة. وتستند هذه القيم على 100 مل من LB أجار.
    3. صب لوحات على الفور بعد إضافة H 2 O 2 واللهب السطح لإزالة الفقاعات. العائد هو 4 لوحات لكل 100 مل من LB أجار. احتفال لوحات مع تركيز H 2 O 2.
    4. وضع لوحات في كشف غطاء تدفق البيولوجي مع مروحة تعمل لمدة 30 دقيقة لإزالة الرطوبة الزائدة من لوحات.
      ملاحظة: استخدام لوحات في اليوم نفسه انهم مستعدون. قد يؤدي عدم القيام بذلك سيؤدي في البيانات غير متناسقة.
      ملاحظة: الضغوطات الأكسدة مثل الباراكوات يمكن أن تكون بديلا عن H 2 O 2 في هذا الاختبار. التركيزات المستخدمة لالضغوطات المؤكسدة أخرى قد تختلف عن تلك المستخدمة لH 2 O 2.
  3. غسل وقياس OD 600 من الثقافات بين عشية وضحاها كما هو موضح في الخطوة 3.7.
  4. تطبيع OD 600 من كل متر مكعب بين عشية وضحاهاltures إلى أدنى قيمة لمجموعة من السلالات التي يجري اختبارها. P. الزنجارية ديه عموما OD 600 من حوالي 2.5 عندما نمت بين عشية وضحاها في LB + NTBC أو LB + DMSO.
    1. تحديد حجم الثقافة اللازمة لتمييع الثقافة إلى أدنى OD 600 في إجمالي حجم 1 مل. على سبيل المثال، إذا كان لديه ثقافة OD 600 من 3 وأدنى OD 600 لمجموعة من سلالات 2.5، إجراء العملية الحسابية التالية: (2.5) (1 مل) = (3) (خ). س = 0.833 مل. سيتم وضعها 0.833 مل من ثقافة في أنبوب microfuge.
    2. حساب كمية LB + NTBC (300 ميكرومتر) أو LB + DMSO اللازمة لتبرزي حجم الثقافة إلى 1 مل. على سبيل المثال في خطوة 4.4.1، ومقدار LB + NTBC أو LB + DMSO تضاف إلى ثقافة سيكون 0.167 مل (1 مل السعة الإجمالية - 0.833 مل الثقافة). جعل الحلول الأسهم من LB + NTBC وLB + DMSO لاستخدام هذه التخفيفات على أساس حجم اللازمة لتمييع كل السلالات.
    3. مزيج من الثقافة وLB + Nالدرن أو LB + DMSO قبل vortexing.
  5. للحفاظ على الثقافات في تركيز ثابت من NTBC أو DMSO، نفذ عشرة أضعاف التخفيفات المسلسل من الثقافات بين عشية وضحاها تطبيع في برنامج تلفزيوني + NTBC أو برنامج تلفزيوني + DMSO.
    1. جعل الحلول الأسهم من برنامج تلفزيوني + NTBC وPBS + DMSO. لمجموعة واحدة من التخفيفات لسلالة واحدة، ومزيج 300 NTBC ميكرومتر أو ما يعادل حجم DMSO مع برنامج تلفزيوني أن تسفر عن إجمالي حجم 720 ميكرولتر. توسيع نطاق هذه الأسهم صعودا أو هبوطا حسب عدد سلالات يتم اختبارها.
    2. أنابيب التسمية microfuge لمدة 10 -1 من خلال التخفيفات 10 -7 التسلسلية. إضافة 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني + NTBC أو برنامج تلفزيوني + DMSO للأنابيب المناسبة. استخدام PBS + NTBC للسلالات التي تزرع في LB + NTBC واستخدام PBS + DMSO للسلالات التي تزرع في LB + DMSO.
    3. إضافة 10 ميكرولتر من ثقافة إلى مناسبة 10 -1 أنبوب التخفيف. مزيج من قبل vortexing ونقل 10 ميكرولتر من التخفيف 10 -1 إلى أنبوب التخفيف 10 -2. كرر حتى يكون كل التخفيفات PERFOrmed. تغيير نصائح الماصة بين التخفيفات.
  6. بقعة 5 ميكرولتر من 10 -3 خلال 10 -7 التخفيفات على LB + H 2 O 2 لوحات من نسختين لكل سلالة. استخدم إحدى طرف الماصة إذا مطلي البقع من معظم تمييع لأقل مخفف (10 -7 إلى 10 -3). لا تلميح أو إمالة لوحة حتى يجف السائل في لوحة.
  7. احتضان لوحات لمدة 24-48 ساعة عند 37 ° C (حاضنة الهواء)، اعتمادا على سلالة.
    ملاحظة: P. سوف الزنجارية PAO1 ديك المستعمرات جيدة الحجم على LB بعد 24 ساعة من الحضانة. احتضان سلالات حتى لديهم مستعمرات تقريبا نفس حجم PAO1.
  8. تصوير لوحات باستخدام كاميرا CCD فوق transluminator. اختياريا، تحرير الصور لوعلى النقيض من المحاصيل لنفس الحجم. حساب عدد المستعمرات في كل بقعة لتحديد التغيرات في حساسية لالاكسدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

معايرات NTBC

استخدمت المعايرة NTBC لتحديد ما إذا كان NTBC قادرة على خفض الانتاج pyomelanin في P. الزنجارية، وأيضا تحديد تركيز NTBC أن يلغي أو يقلل pyomelanin إنتاج للاستخدام في فحوصات إضافية. قد تكون هناك اختلافات في مستويات pyomelanin المنتجة في مكررات مختلفة، ولكن تبقى الاتجاهات العامة المستمر. ويمكن أيضا أن يتم تعديل المعايرة فحص NTBC لاختبار المركبات الأخرى التي قد تؤثر على إنتاج الصباغ في البكتيريا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ستسمح طريقة المعايرة بالتحليل الحجمي NTBC الموضحة في هذا البروتوكول للمستخدم بتحديد ما إذا كان بإمكان NTBC تقليل إنتاج البيوميلانين في البكتيريا أو القضاء عليه ، وتحديد تركيز NTBC المطلوب. تتمثل الخطوة الأكثر أهمية في اختبار المعايرة بالتحليل الحجمي NTBC في تحديد نطاق تركيزات NTBC لاستخدامها في الفحص. سلالات مختلفة من المتصورة الزنجارية لها حساسيات مختلفة ل NTBC ، وقد تكون السلالات المختبرية أكثر حساسية ل NTBC من العزلات السريرية12 (الشكل 2). لذلك ، من الضروري اختبار مجموعة من تركيزات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون دارا فرانك وكاري هاروود على مساهمتهما السخية في السلالات. مؤسسة أبحاث جامعة ويسكونسن ميلووكي حاصلة على براءة اختراع رقم 8،354،451 ؛ مع الادعاءات الموجهة على نطاق واسع لعلاج أو تثبيط تطور عدوى كائن حي دقيق في المريض عن طريق إعطاء مركب مثبط ثنائي الأكسجين 4-هيدروكسي فينيل بيروفات مثل 2- [2-نيترو-4- (ثلاثي فلوروميثيل) بنزويل] -1،3-سيكلوهكسانيديون (NTBC). المخترعون هم جراهام موران وبانغ هي. تم دعم هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R00-GM083147). جامعة واشنطن P. aeruginosa مكتبة الينقولات المتحولة مدعومة من قبل المعاهد الوطنية للصحة P30 DK089507.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2- [2-نيترو-4- (ثلاثي فلوروميثيل) بنزويل] -1،3-سيكلوهكسانيديون (NTBC)سيجما ألدريتشSML0269-50 ملغوتسمى أيضا nitisinone. قابل للذوبان في DMSO.
H2O2Sigma-Aldrich216763-100ML30 wt. ٪ في H2O.  استقرت.
جنتاميسينجولد بيوG-400-100قابل للذوبان في H2O.  تعقيم الفلتر.
KanamycinFisher ScientificBP906-5قابل للذوبان في H2< / sub>O. & nbsp ؛ تعقيم الفلتر.
TobramycinSigma-AldrichT4014-100MGقابل للذوبان في H2< / sub>O. & nbsp ؛ تعقيم الفلتر.

المراجع

  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
  3. Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
  4. Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. Properties and Function of Pyomelanin. Biopolymers In Tech. Elnashar, M. , 449-472 (2010).
  5. Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
  6. Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
  7. Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
  8. Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
  9. Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
  10. Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
  11. Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
  12. Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
  13. Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
  14. Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).
  15. Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
  16. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  17. Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
  19. Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
  20. Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092(2011).
  21. Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NTBC MIC Pseudomonas aeruginosa

مقالات ذات صلة