الخلايا النجمية في الجهاز العصبي المركزي تغير خصائصها الوظيفية والهيكلية استجابة للمنبهات الضارة. يقدم هذا التقرير بروتوكولا لتقييم مورفولوجيا الخلايا النجمية ثلاثية الأبعاد في الحالات المريضة أو بعد التدخلات العلاجية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
بروتوكول للثلاثي الأبعاد متحد البؤر تحليل المظهرية من النجمية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كما الخلايا الدبقية في الدماغ، الخلايا النجمية لها أدوار وظيفية متنوعة في الجهاز العصبي المركزي. في ظل وجود مؤثرات الضارة، النجمية تعديل خصائصها الوظيفية والهيكلية، وهي حالة تسمى دباق النجمي رد الفعل. هنا، يتم تقديم بروتوكول للتقييم الخصائص المورفولوجية من الخلايا النجمية. ويشمل هذا البروتوكول الكمي من 12 معلمات مختلفة أي مساحة وحجم الأنسجة من قبل (إقليم نجمية) نجمية المشمولة، ونجمية بأكملها بما في ذلك الفروع، وخلايا الجسم، والنواة، وكذلك الطول الإجمالي وعدد من الفروع، وشدة من مناعية مضان من الأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن نجمية، وكثافة نجمية (رقم / 1000 ميكرون 2). لهذا الغرض تم إنشاء ثلاثية الأبعاد (3D) الصور المجهرية مبائر، وصورة 3D برامج التحليل مثل Volocity 6.3 كان يستخدم لقياس. أنسجة المخ الفئران المعرضة للاميلويد بيتا 1-40 1-40) مع أو بدون تدخل علاجي لتقديم الأسلوب. ويمكن أيضا أن هذا البروتوكول استخدامها ل3D تحليل المورفومترية من الخلايا الأخرى في الجسم الحي من أي أو في ظروف المختبر.
المقدمة
في صحي الجهاز العصبي المركزي (CNS)، النجمية تلعب دورا هاما في تنظيم تدفق الدم، واستقلاب الطاقة، وظيفة متشابك واللدونة، والأيونات خارج الخلية والعصبي التوازن 1-3. بالإضافة إلى ذلك، النجمية تستجيب للمؤثرات الضارة المختلفة وظروف غير طبيعية مثل الصدمات النفسية، والعدوى، ونقص التروية أو التنكس العصبي عن طريق رد الفعل دباق النجمي الذي يتميز تضخم وانتشارها وإعادة عرض وظيفي من الخلايا النجمية 4،5.
دباق النجمي رد الفعل يمكن أن مهندس الاستجابة الالتهابية وعملية الإصلاح في الأنسجة، وبالتالي، يمكن أن تؤثر على النتائج السريرية من التدخلات العلاجية. وفقا لذلك، وتلقى اهتماما من الخلايا النجمية الأعصاب خلال العقود الماضية كأهداف محتملة للتدخلات العلاجية لمجموعة متنوعة من الأمراض التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي.
الخلايا النجمية وعادة ما يكون شكل النجمية مع د جيدافروع efined التي تنتشر في جميع أنحاء سوما 6. في حالة المريضة في الدماغ، وفروع نجمية تصبح معقدة وتظهر نهايات منتفخة 7، على سبيل المثال في وجود بيتا اميلويد (Aβ).
تقدم هذه المقالة بروتوكول لتحليل الصور 3D من الخلايا النجمية التي حصل عليها المجهر متحد البؤر. تم قياس اثني عشر المعلمات كمية مختلفة لكل نجمية: المناطق السطحية ومجلدات من الأراضي نجمية (الأنسجة من قبل نجمية المغطاة)، الخلية بأكملها (بما في ذلك فروع)، خلايا الجسم، والنواة. ويبلغ طول وعدد من الفروع؛ كثافة مضان من الأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن نجمية. وكثافة الخلايا النجمية (رقم / 1000 ميكرون 2). لهذا الغرض، وكنا أقسام الدماغ من الفئران التي عرضت لintrahippocampal حقن Aβ 1-40 مع أو بدون العلاج جينيستين باعتباره مادة مضادة للالتهابات. بروتوكول صفها يمكن استخدامها لالمورفومترية لalysis من أنواع مختلفة من الخلايا في المختبر أو في الجسم الحي في ظروف مختلفة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للسياسات المنصوص عليها في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (NIH) التي وافقت عليها لجنة الأخلاق من جامعة ايران للعلوم الطبية (طهران، إيران).
1. الحيوانات والجراحة وعينة الاستعدادات
ملاحظة: إعداد أنسجة المخ ل3D التحليل المجهري متحد البؤر.
- الحيوانات الانقسام عشوائيا إلى مجموعتين: Aβ 1-40 -injection (ن = 8)، وAβ 1-40 -injection مع العلاج جينيستين (ن = 8)؛ إدارة جينيستين (10 ملغ / كغ المخفف في سيارة مثل polyethoxylated زيت الخروع) بواسطة التغذية الأنبوبية 1 ساعة قبل الجراحة.
- تخدير الحيوانات مع الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ). تأكيد التخدير المناسبة بسبب عدم الانسحاب لا ارادي بعد معسر أخمص قدميه. استخدام مرهم على العينين أثناء الجراحة لمنع جفاف.
- وضع الحيوانات في جهاز التجسيمي ورئيس الحلاقة. تطبيق IODالحل المعهد الوطني للإحصاء لتنظيف فروة الرأس قبل شق والحفاظ على موقع عملية عقيمة أثناء الجراحة لتقليل خطر العدوى. حقن Aβ 1-40 stereotaxically (4 ميكرولتر) في قرن آمون في -3.5 ملم الخلفي إلى bregma، ± 2 مم الوحشي على خط الوسط، و-2.8 مم تحت الجافية، وفقا لالفئران أطلس الدماغ 8. لطريقة التجسيمي يرجى الاطلاع على المنشور السابق 9.
- توفير ما بعد الجراحة المراقبة / رعاية حتى الحيوانات واعية تماما لضمان راحة الحيوانات. الحفاظ على الحيوانات دافئة أثناء الانتعاش، وعدم إعادتها إلى قفص مع غيرها من الحيوانات حتى الشفاء التام. إيلاء الاهتمام لأي علامة على الإصابة في الحيوانات بعد الجراحة.
- تخدير الحيوانات بشدة من الكيتامين (150 ملغ / كلغ) بعد ثلاثة أسابيع من الجراحة. أداء تثبيت transcardial التي كتبها perfusing الحيوانات مع المياه المالحة 0.9٪ تليها بارافورمالدهيد 4٪ في 0.1 M PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4)، ثم إزالة وإصلاح الدماغ كما هو موضح في 10 </ سوب>.
- بعد إصلاح العقول في 4٪ امتصاص العرق لمدة 2-3 أيام في 4 ج.
- تضمين الأنسجة في كتل البارافين عن طريق استخدام معدات الأنسجة التضمين، وتجنب تحت الحشوة أو الإفراط في ملء الكاسيت لأنها قد تتداخل مع المحاذاة الصحيحة أو التقطيع. إيلاء الاهتمام لاتجاه النسيج في كتلة البارافين.
ملاحظة: الحصين الفئران، على سبيل المثال، على مقربة من الخلفية جزء من نصف الكرة المخية. وبالتالي، يجب أن تكون جزءا لا يتجزأ من النسيج بطريقة باجتزاء يبدأ في الخلفية جزء من الدماغ. استخدام الأطلس Paxinos 8 كدليل للوصول إلى التركيب التشريحي المطلوب. - وضع مشراح بعيدا عن المسودات الهواء أو المداخل منذ التحركات الجوية تجعل التعامل مع أقسام صعبة.
- استخدام مقاطع بسمك ≥20 ميكرون حيث أن هذا العمق مع تكون ضرورية لإنتاج صور Z-كومة من الخلايا النجمية كاملة. لا تستخدم المقاطع القليلة الأولى، كما قد تكون لديهم سمك غير مرغوب فيه بسبب ه الحراريxpansion.
- وضع المقاطع على سطح الماء الدافئ (5 ± 2 ج، تحت درجة حرارة انصهار لالبارافين) فترة طويلة بما يكفي لشد الأجزاء.
ملاحظة: أكثر من التوسع في القسم يمكن أن يعكر التشكل للهيكل. استخدام الفرشاة الصغيرة لنقل بعناية أقسام. جمع 2-3 أقسام على كل شريحة. - متجر الشرائح في رفوف في وضع مستقيم والسماح لهم الجافة في 37 مئوية لعدة ساعة أو O / N.
2. المناعية
- Deparaffinize المقاطع في زيلين، 2 × 10 دقيقة، وترطيب من خلال التدرج الكحول (99.8٪، 95٪، و 70٪ و 10 دقيقة لكل منهما) وبرنامج تلفزيوني.
- احتضان مع الأجسام المضادة ضد ييفي الدبقية الحمضية البروتين (GFAP) المخفف 1: 1500 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.25٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، 0.25٪ تريتون X-100 و المصل العادي 3.5٪ (O / N عند 4 ج).
- يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 5 دقائق.
- احتضان مع الفوسفات القلوية مترافق antibodie الثانويالصورة ل1H (1: 100، 21 ج، مخففة في PBS).
- يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 5 دقائق.
ملاحظة: من المهم أن يغسل المقاطع بشكل صحيح بعد الأجسام المضادة الثانوية للحد من تلوين الخلفية. - احتضان المقاطع في الظلام مع السائل الأحمر الدائم مولد اللون (15-20 دقيقة). ملاحظة: إعداد الحل لا يزيد عن 30 دقيقة قبل الاستخدام.
- يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 5 دقائق.
- وأخيرا، وصمة عار على النوى مع 4-6-diamidino-2-phenylindole (دابي؛ 1: 500، مخففة في PBS) قبل الانزلاق تغطية. تخزين الشرائح في الثلاجة 24-48 ساعة قبل الفحص المجهري.
3. متحد البؤر المجهر
ملاحظة: للحصول على التقييم الكمي (انظر أدناه)، حدد نجمية مع نواة ملطخة دابي واضحة للعيان مع حد أدنى من تداخل فروع للحد من مخاطر الأخطاء. إنتاج الصور Z-ستاك هو مضيعة للوقت. التحلي بالصبر وعدم التوقف أثناء معالجة. متحد البؤر تستقيم الليزر مجهر المسح هو شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي لخلق صور 3D من الخلايا النجمية.
- وضع الشريحة على مرحلة المجهر، وحدد الهدف 63X.
- فتح برامج التصوير وانقر على نظام ابدأ. انقر فوق علامة التبويب موقع. الذهاب إلى تعيين وتحديد GFP لضبط الضوء المناسب.
- فتح مصراع لتعكس الضوء. العثور على مسدس العاكس على الجانب الأيمن من مصراع واختيار اللون الذي يجب أن ينعكس النجمية (الأخضر والأحمر أو البنفسجي)؛ وقد استخدم اللون الأحمر (FSet20 WF) هنا.
ملاحظة: لا تنس أن التركيز على صورة مباشرة في بصري المجهر. - للعثور على أفضل التركيز، انقر على جميع مغلقة، ووضع دبوس المجهر في وضع ملء الشاشة، وانقر فوق علامة التبويب الاستحواذ.
- انقر على الإعداد الذكي تحت علامة التبويب اكتساب؛ يفتح نافذة. حدد fluorophore المناسب (أي دابي واليكسا فلور 555، في المشروع الحالي) من القائمة. يتم تحديد اللون تلقائيا.
- انقر على أفضل إشارة، وتطبيق، ثم انقر على تعيين التعرض؛ وبعد ذلك تعيين الكمبيوتر تلقائيا المعلمات التعرض.
- لتحسين الصورة، انتقل إلى إطار القنوات. عدم تحديد Track2، وتسليط الضوء Track1 وانقر على لايف. تركيز الصورة إذا لزم الأمر.
- في إطار القنوات ضبط المفاتيح التالية. انقر على 1AU لتحسين تلقائيا الثقب. من المهم جدا للقيام بهذه الخطوة وإلا الصور مبائر يكون غير الأمثل. ضبط كسب الحصول على أفضل كثافة (الحفاظ على هذا الإعداد دون 800 للحد من الضوضاء إضافية). وأخيرا، تعيين كسب الرقمية بين 2 و 3.
- عدم تحديد Track1، انقر على Track2 وكرر الخطوة 3.8 لTrack2. ثم توقف لايف.
- انتقل إلى إطار الوضع الاستحواذ. تحسين صورة عن طريق تحسين الإطار الحجم ومتوسط. من أجل تغيير حجم الإطار يذهب إلى X * Y وحدد 1024 X 1024. اختيار سرعة بطيئة لخلق صورة أفضل.
- الذهاب إلى المتوسطات وحدد عدد ≥4. هذه القيمة المتوسط يشير إلى عدد المسحات التي سيتم متوسط إلى المنتجالبريد الصورة المكتسبة. الآن انقر على زر المفاجئة، وحفظ الصورة 2D القبض عليه.
- للتصوير 3D، نحتفل في هذا البند Z-المكدس في إطار الإعداد الذكي مما تسبب في نافذة Z-المكدس لفتح.
- تعيين المراكز الأولى والأخيرة لZ-ستاك، أي عمق الخلية. أولا انقر على لايف. ثم استخدم محرك تركيز المجهر التركيز على موقف العلوي من نجمية في الأنسجة، حيث Z-ستاك هو أن تبدأ. انقر على المجموعة الأولى. ثم التركيز وصولا الى أدنى موقف نجمية في الأنسجة، حيث يجب أن يتوقف المسح الضوئي Z-المكدس. انقر على تعيين آخر. ثم توقف لايف.
- اختيار الفاصل. 1.01 ميكرون يستخدم في الدراسة الحالية. ويمكن أن يتم اختيار الفاصل الزمني عن طريق النقر على الأمثل لتعيين عدد من شرائح.
- انقر فوق ابدأ التجربة. حفظ الصور مرة واحدة اكتمال التفحص. وسوف تستخدم هذه الصورة لقياس المعلمات التالية: مساحة وحجم الأراضي نجمية، ونجمية بأكملها بما في ذلك حمالة الصدرnches، خلايا الجسم، والنواة.
- الحصول على صورة 2D باستخدام الهدف 10X 20X أو كما هو موضح في خطوات 3،6-3،11. هذه الصورة يمكن أن تستخدم لقياس كثافة مناعية مضان من الأجسام المضادة، وكثافة نجمية (رقم / 1000 ميكرون 2).
4. كثافة نجمية وGFAP + شدة الإسفار
- فتح الصورة 20X 2D. انقر على HISTO (Hisogram) على الجانب الأيسر من نافذة الصورة.
- لحساب كثافة نجمية، حدد ثلاثة حقول بصرية متتالية تحت الهدف 20X. حساب عدد الخلايا النجمية التي تظهر على سوما واضح مع الحد الأدنى، وتداخل فروع في الحقول.
- لقياس كثافة مضان، حدد أداة مناسبة (مستطيل أو دائرة) على تذييل إطار الصورة، واختيار منطقة لقياس. ملاحظة تظهر قيمة المتوسط والانحراف المعياري تلقائيا تحت الصورة. في الدراسة الحالية، وهو 0.7 مم 2 مساحة مستطيلة بين شارعوقد استخدم iatum وشفرة وسطي من التلفيف المسنن.
5. الفروع نجمية
- لتحديد طول وعدد الفروع، واستخدام الصور 3D (المكتسبة مع 20X) في البرنامج صورة تحليل. رسم خط يدويا على طول كل فرع من فروع نجمية المحدد. ثم حدد قياس أداة متخصصة لقياس خط طول. من أجل تحديد عدد من الفروع، وتحديد عدد أداة لحساب عدد من البنود ملحوظ.
6. حجم ومساحة المبنى
ملاحظة: علامات بنية يدويا في 3D تحليل الصور برامج تتطلب التركيز والتدريب. ممارسة عدة مرات قبل بدء التجربة.
- لقياس حجم والمساحة السطحية للنجمية النواة، سوما، خلايا الجسم والأرض، ونقل صور 3D (المكتسبة في خطوات 3،1 حتي 3،16) إلى صورة 3D برامج التحليل مثل Volocity 6.1.
- فتح البرنامج وخلق جديدمكتبة. سحب جميع الصور إلى العمود الرمادي اليسار في مكتبة جديدة. ثم، حدد صورة واحدة 3D. على اليمين، وهناك قنوات مختلفة بألوان مختلفة. تشغيل قناة واحدة من الفائدة؛ على سبيل المثال القناة الزرقاء للدابي عند قياس النواة. تغيير سطوع يدويا للحصول على النقيض الأمثل.
- اختر من القائمة أدوات، انتقل إلى جعل حجم وإنتاج صورة 3D واحدة من الصور Z-المكدس. انقر على خصائص في القائمة تحرير ومما لا شك فيه أن X، Y وترد Z خصائص. وإلا فإنه من المستحيل إجراء تحليل 3D.
- انقر على أيقونة الأداة حر RIO في شريط الأدوات. لقياس حجم والمساحة السطحية للنجمية نواة رسم خط حول النواة المسمى دابي.
- لقياس حجم والمساحة السطحية للنجمية خلايا الجسم رسم خط حول سوما باستثناء الفروع.
- لقياس حجم والمساحة السطحية للنجمية كامل (خلايا الجسم بما في ذلك فروع) رسم خط حول سوما بعدسطح كل الفروع.
- لتقييم حجم والمساحة السطحية للأراضي نجمية رسم الخط الفاصل بين نصائح من الفروع.
ملاحظة: اضغط حذف على لوحة المفاتيح لمحو رسومات غير المرغوب فيها. - انقر على قائمة القياسات في الجزء العلوي من الصورة نافذة لإنشاء بروتوكول القياس؛ يفتح نافذة تحتوي على أدوات مختلفة.
- السحب إيجاد الكائنات إلى أعلى النافذة (جزء). إعطاء اسم وصفي للسكان 1، حدد اللون المرتبطة بها، وانقر على التدبير. يفتح نافذة أخرى.
- اختيار المنطقة أي معلمة، وحجم أو السطح. انقر على OK. سوف تظهر البيانات في الجدول.
- لحفظ النقر البيانات في القائمة قياس وتحديد إجراء القياس البند.
- حدد عنصر قياس جديد يسمى من نافذة فتحها. ثم إعطاء اسم للبيانات وانقر على OK.
- وأخيرا، تصدير البيانات إلى برنامج إحصاءات مثل لوحة الرسم البياني أو برنامج اكسل. استخدام اختبار (ت) لتحليل البيانات، ثم رسم 2D غرامaphs.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يعرض هذا القسم بعض الأمثلة من الملاحظات النوعية والكمية التي تنتجها تحليل المورفومترية 3D. للحصول على نتائج كاملة لجميع المعلمات 12 المذكورة سابقا، يرجى الاطلاع على المنشور السابق 10.
ملاحظات النوعية
الخلايا النجمية أظهرت فروع رقيقة أو سميكة التي كانت عادة ما يكون طويلا في Aβ 1-40 حقن الجرذان (الشكل 1). لوح...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في البروتوكول الحالي، نحن العاملين 3D قياس الأشكال متحد البؤر لتقييم 12 المعلمات المختلفة التي ارتبطت نجمية التشكل. لهذا الغرض، والأنسجة قرن آمون من الفئران مع Aβ 1-40 - استخدمت دباق النجمي التي يسببها، مع أو بدون المعالجة جينيستين كعامل مضاد للالتهابات. باستخدام صور 3D والبرمجيات المورفولوجية، كنا قادرين على إظهار تأثير جينيستين على دباق النجمي أي مورفولوجيا الخلايا النجمية.
التغيرات في البيئ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مجلس مقاطعة Östergötland، (السويد) والخلوية ومركز الأبحاث الجزيئية في جامعة ايران للعلوم الطبية (طهران، إيران).
شكر وتقدير
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أميلويد بيتا 1-40 | سيجما ألدريتش | 79793 | يحفظ في -70 درجة ؛ C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | الحفاظ على -20 درجة ؛ C |
| الأجسام المضادة للأرانب متعددة القولون ضد البروتين الحمضي الليفي الدبقي | DAKO | Z0334 | |
| الخنازير القلوية المترافقة بالفوسفات المضادة للأرانب الأجسام المضادة IgG | DAKO | ||
| السائل الدائم الكروموجين | DAKO | K0640 | |
| سائل دائم الركيزة الحمراء عازلة | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | زيت الخروع متعدد الإيثوكسيلات - الخطوة 1.1 |
| LSM 700 الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc. ، | ||
| تحليل الصور 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic | Stoelting | ||
| Graph pad Pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
المراجع
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).
- Pekny, M., Nilsson, M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 50 (4), 427-434 (2005).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
- Anderova, M., et al. Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).
- Paxinos, G., Watson, C. A stereotaxic atlas of the rat brain. , Academic. New York. (1998).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. J Vis Exp. (65), e4079(2012).
- Bagheri, M., et al. Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study. PloS One. 8 (10), e76526(2013).
- Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).
- Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).
- Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
