مقالة منهجية

تحليل يرسينيا القولون المستجيب إزفاء في الخلايا المضيفة عن طريق بيتا لاكتاماز المستجيب الإنشطار

DOI:

10.3791/53115

⸱

أكتوبر 13, 2015

 ,  ,  , 
1Institute for Medical Microbiology, Virology and Hygiene, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد نقل المستجيب إلى الخلايا المضيفة عبر نظام إفراز من النوع الثالث استراتيجية ضراوة شائعة بين البكتيريا سالبة الجرام. تم تطبيق مقايسة قائمة على اندماج مستجيب بيتا لاكتاماز للتحليل الكمي للإزاحة. في الخلايا المصابة باليرسينيا ، تتم مراقبة تحويل مراسل FRET بواسطة بيتا لاكتاماز باستخدام الفحص المجهري بالليزر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العديد من أنواع البكتيريا سالبة الجرام المسببة للأمراض بما في ذلك اليرسنية. توظف النوع الثالث أنظمة إفراز لنقل من البروتينات المستجيب إلى الخلايا المستهدفة حقيقية النواة. داخل الخلية المضيفة البروتينات المستجيب التلاعب الوظائف الخلوية لصالح البكتيريا. لفهم أفضل للسيطرة على نوع إفراز III خلال تفاعل الخلية المضيفة وحساسة وفحوصات دقيقة لقياس النبات مطلوبة. نحن هنا وصف تطبيق مقايسة على أساس الاندماج من يرسينيا القولون البروتين المستجيب جزء (يرسينيا البروتين الخارجي؛ YopE). مع TEM-1 بيتا لاكتاماز للتحليل الكمي من النبات ويعتمد الفحص على الانقسام خلية نفيذ الحنق صبغ (CCF4 / AM) بواسطة translocated الانصهار بيتا لاكتاماز. بعد الانقسام من السيفالوسبورين جوهر CCF4 من قبل بيتا لاكتاماز، الحنق من الكومارين إلى تعطل فلوريسئين والإثارة من شاردة الكومارين يؤدي إلى انبعاث مضان الأزرق.وقد وصفت التطبيقات المختلفة لهذه الطريقة في الأدب تسليط الضوء على تنوعها. يسمح طريقة لتحليل النبات في المختبر، وأيضا في في الجسم الحي، على سبيل المثال، في نموذج الفأر. الكشف عن إشارات مضان يمكن القيام بها باستخدام لوحة القراء، تحليل FACS أو مضان المجهر. في الإعداد الموصوفة هنا، في النبات المختبر من اندماج المستجيب إلى خلايا هيلا من قبل المسوخ اليرسنية مختلفة يتم مراقبتها عن طريق المسح الضوئي ليزر المجهري. تسجيل تحويل الخلايا لمراسل الحنق من قبل المستجيب الانصهار بيتا لاكتاماز في الوقت الحقيقي يوفر النتائج الكمية قوية. نحن هنا تظهر البيانات النموذجية، مما يدل على زيادة النبات من قبل Y. متحولة القولون YopE مقارنة نوع السلالة البرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النوع الثالث أنظمة إفراز بروتين هي آلات التصدير المتخصصة التي تستخدمها أجناس مختلفة من البكتيريا سالبة الجرام لتسليم مباشرة البروتينات المستجيب المشفرة البكتريا إلى الخلايا المستهدفة حقيقية النواة. بينما آلية إفراز نفسها الحفظ جدا، وقد تطورت مجموعات متخصصة من البروتينات المستجيب بين الأنواع البكتيرية المختلفة لمعالجة مسارات الإشارات الخلوية وتسهيل استراتيجيات الفوعة البكتيرية محددة 1. في حالة اليرسنية، تصل إلى سبعة البروتينات المستجيب، ما يسمى Yops (يرسينيا البروتينات الخارجي)، وtranslocated على اتصال الخلية المضيفة والعمل معا لتخريب استجابات الخلايا المناعية مثل البلعمة وخلوى الإنتاج، أي، ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الذروة الانبعاثات وتحديد الصليب الحديث (انظر أيضا الشكل 2)

  1. من أجل تحديد القمم الانبعاثات وكمية من عبر الحديث بين الجهات المانحة (الكومارين مشابه V450) ومتقبل (فلوريسئين) الأصباغ، والقيام بمسح الطيفية من الخلايا المسمى مع كل من fluorophores الفردية في 405 نانومتر الإثارة.
  2. تحديد عرض النطاق الترددي 10 نانومتر في ذروة كل الصبغة التي سيتم استخدامها لقنوات المانحة ومتقبل (455-465 نانومتر، وهنا 525-535 نانومتر). مؤامرة كثافة تطبيع على الطول الموجي وحساب متوسط ​​نسبة عبر الحديث للصبغ المانحة في....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لإثبات القدرة على الطريقة الموصوفة لتحليل كمي المستجيب النبات إلى الخلايا المستهدفة، تم دراسة سلالتين اليرسنية مع حركية النبات مختلفة: Y. القولون نوع السلالة البرية WA-314 (المصلية O8 أو إيواء البلازميد الفوعة pYVO8 22) ومشتقاته WA-314ΔYopE (WA-314 بإيواء pYVO8ΔYopE 23). وأظهر العمل في وقت سابق أن Y. المسوخ القولون تفتقر الوظيفي المعرض YopE أعلى بشكل ملحوظ معدل النبات يوب 10. تم تحويل كل من سلالات مع ترميز ناقلات.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا طبقت بنجاح مقايسة على أساس TEM-1 مراسل بيتا لاكتاماز للتحليل الكمي من المستجيب النبات عن طريق Y. القولون. وقد وصفت العديد من الأشكال المختلفة لهذه التقنية حساسة ومحددة واضحة نسبيا في الأدب. في هذه الدراسة تم إجراء المسح الضوئي ليزر المجهري للكشف الأكثر حساسية ودقة من إشارات مضان. على وجه التحديد تصحيح عبر الحديث بين الأصباغ المانحة ومتقبل وعرض النطاق الترددي الكشف قابل للتعديل بشكل فردي تسمح دقة فائقة القياس بالمقارنة مع الأشكال الأخرى من هذه الطريقة. النتائج تظهر.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور أنطونيو فيرجيليو فايلا على توفير خوارزمية القياس الكمي لاكتساب FRET وإروين بون لتوفير تركيبات pMK-bla و pMK-ova.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
LB-AgarRothX969.2
رطل متوسطRothX968.2
Dulbecco s لوح المحلول الملحي الممخزن بالفوسفاتسيجما-ألدريتشD8662-500ML
96 بئر (أسود ، قاع شفاف)Greiner Bio One655087
DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، مكمل GlutaMAX ، البيروفاتGibco / Life Technologies31966-047
طقم تحميل ProbenecidSigma-AldrichP8761-25G
LiveBLAzer FRET-B / G مع تقنيات CCF4-AMLifeK1095
الليكتين من Triticum vulgaris (القمح) FITC المترافقSigma-AldrichL4895يستخدم لذروة الانبعاث وتحديد الحديث المتبادل
V450 الفئران المضادة للفأر CD8aBDBioscience 560469تستخدم لذروة الانبعاث وتحديد الحديث
المتقاطع Immersol W الغمر oil Zeiss444969-0000-000معامل الانكسار = 1.3339 @ 23 ° ؛ C
TCS SP5 II مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤرLeica microsystems2x كاشفات GaAsP-Hybrid ، مطياف 4 قنوات ، مقسم شعاع بصري acusto ، مرحلة XY الآلية ، ثقب قابل للتعديل ، الهدف 20X HC PL APO CS IMM / CORR ، 405 & # 160 ؛ ليزر الصمام الثنائي NM 50 & # 160 ؛ برنامج mW
Imaris 7.6Bitplane Plugins وشملت ImarisXT و MeasurementPro
MatLab وقت تشغيلبرنامج MathWorks
Prism 5GraphPad

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
  2. Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CCF4 AM FRET HeLa YopE

مقالات ذات صلة