مقالة منهجية

تحليل يرسينيا القولون المستجيب إزفاء في الخلايا المضيفة عن طريق بيتا لاكتاماز المستجيب الإنشطار

DOI:

10.3791/53115

⸱

أكتوبر 13, 2015

 ,  ,  , 
1Institute for Medical Microbiology, Virology and Hygiene, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد نقل المستجيب إلى الخلايا المضيفة عبر نظام إفراز من النوع الثالث استراتيجية ضراوة شائعة بين البكتيريا سالبة الجرام. تم تطبيق مقايسة قائمة على اندماج مستجيب بيتا لاكتاماز للتحليل الكمي للإزاحة. في الخلايا المصابة باليرسينيا ، تتم مراقبة تحويل مراسل FRET بواسطة بيتا لاكتاماز باستخدام الفحص المجهري بالليزر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العديد من أنواع البكتيريا سالبة الجرام المسببة للأمراض بما في ذلك اليرسنية. توظف النوع الثالث أنظمة إفراز لنقل من البروتينات المستجيب إلى الخلايا المستهدفة حقيقية النواة. داخل الخلية المضيفة البروتينات المستجيب التلاعب الوظائف الخلوية لصالح البكتيريا. لفهم أفضل للسيطرة على نوع إفراز III خلال تفاعل الخلية المضيفة وحساسة وفحوصات دقيقة لقياس النبات مطلوبة. نحن هنا وصف تطبيق مقايسة على أساس الاندماج من يرسينيا القولون البروتين المستجيب جزء (يرسينيا البروتين الخارجي؛ YopE). مع TEM-1 بيتا لاكتاماز للتحليل الكمي من النبات ويعتمد الفحص على الانقسام خلية نفيذ الحنق صبغ (CCF4 / AM) بواسطة translocated الانصهار بيتا لاكتاماز. بعد الانقسام من السيفالوسبورين جوهر CCF4 من قبل بيتا لاكتاماز، الحنق من الكومارين إلى تعطل فلوريسئين والإثارة من شاردة الكومارين يؤدي إلى انبعاث مضان الأزرق.وقد وصفت التطبيقات المختلفة لهذه الطريقة في الأدب تسليط الضوء على تنوعها. يسمح طريقة لتحليل النبات في المختبر، وأيضا في في الجسم الحي، على سبيل المثال، في نموذج الفأر. الكشف عن إشارات مضان يمكن القيام بها باستخدام لوحة القراء، تحليل FACS أو مضان المجهر. في الإعداد الموصوفة هنا، في النبات المختبر من اندماج المستجيب إلى خلايا هيلا من قبل المسوخ اليرسنية مختلفة يتم مراقبتها عن طريق المسح الضوئي ليزر المجهري. تسجيل تحويل الخلايا لمراسل الحنق من قبل المستجيب الانصهار بيتا لاكتاماز في الوقت الحقيقي يوفر النتائج الكمية قوية. نحن هنا تظهر البيانات النموذجية، مما يدل على زيادة النبات من قبل Y. متحولة القولون YopE مقارنة نوع السلالة البرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النوع الثالث أنظمة إفراز بروتين هي آلات التصدير المتخصصة التي تستخدمها أجناس مختلفة من البكتيريا سالبة الجرام لتسليم مباشرة البروتينات المستجيب المشفرة البكتريا إلى الخلايا المستهدفة حقيقية النواة. بينما آلية إفراز نفسها الحفظ جدا، وقد تطورت مجموعات متخصصة من البروتينات المستجيب بين الأنواع البكتيرية المختلفة لمعالجة مسارات الإشارات الخلوية وتسهيل استراتيجيات الفوعة البكتيرية محددة 1. في حالة اليرسنية، تصل إلى سبعة البروتينات المستجيب، ما يسمى Yops (يرسينيا البروتينات الخارجي)، وtranslocated على اتصال الخلية المضيفة والعمل معا لتخريب استجابات الخلايا المناعية مثل البلعمة وخلوى الإنتاج، أي، للسماح بقاء خارج الخلية من البكتيريا 2-4. يتم التحكم في عملية النبات بإحكام في مراحل مختلفة 5. ثبت أن تفعيل الرئيسي للT3SS يتم تشغيل عن طريق الاتصال به لم المستهدفةليرة لبنانية 6. ومع ذلك، فإن الآلية الدقيقة لهذه المبادرة هي حتى الآن إلى توضيح. في اليرسنية يتم التوصل إلى المستوى الثاني من ما يسمى صقل النبات عن طريق حتى- أو نشاط البروتينات الخلوية رو GTP ملزم RAC1 أو RhoA التنظيم إلى أسفل. تفعيل RAC1 مثلا الإنفازين أو السامة للخلايا عامل الناخر Y (كنف-Y) يؤدي إلى زيادة النبات 7-9، في حين أن GAP (GTPase تفعيل بروتين) وظيفة من translocated YopE ينظم أسفل النشاط RAC1 وبالتالي يقلل النبات من نوع ردود الفعل السلبية آلية 10،11.

طرق صحيحة ودقيقة هي شرط أساسي لمعرفة كيف يتم تنظيم النبات خلال اليرسنية تفاعل الخلية المضيفة. وقد استخدمت العديد من أنظمة مختلفة لهذا الغرض، ولكل منها مزايا وعيوب محددة. بعض المناهج تعتمد على تحلل الخلايا المصابة ولكن ليس البكتيريا عن طريق المنظفات المختلفة التي تتبعها تحليل لطخة غربية. عشرالبريد العيب المشترك بين هذه الأساليب هو أن تحلل بكتيرية طفيفة ولكن لا مفر منه يحتمل أن يلوث المحللة الخلية مع البكتيريا المرتبطة البروتينات المستجيب. ومع ذلك، تم اقتراح علاج الخلايا مع بروتين K أن تتحلل البروتينات المستجيب خارج الخلية واستخدامها لاحقا من ديجيتونين للتحلل الانتقائي للخلايا حقيقية النواة للحد من هذه المشكلة 12. الأهم من ذلك، هذه المقايسات تعتمد بشكل حاسم على جودة عالية أضداد المستجيب، التي هي في معظمها غير متوفرة تجاريا. محاولات لاستخدام اندماج متعدية من البروتينات المستجيب والبروتينات الفلورية مثل GFP لرصد النبات لم تكن ناجحة ربما يرجع ذلك إلى هيكل كروي العالي من البروتينات الفلورية وعدم قدرة الجهاز إفراز تتكشف لهم قبل إفراز 13. ومع ذلك، العديد من علامات مراسل مختلفة مثل CYA (التي تعتمد على كالمودولين محلقة الأدينيلات) المجال من السعال الديكي البورديتيلة السم cyclolysin 14 أو فلاشاستخدمت العلامة بنجاح لتحليل النبات. في مقايسة السابق يتم استخدام النشاط الأنزيمي من CYA لتضخيم إشارة من البروتين الانصهار داخل الخلايا، في حين أن العلامة فلاش، لtetracysteine ​​قصيرة جدا (4Cys) العلامة عزر، يسمح لوضع العلامات مع فلاش صبغ biarsenical دون إزعاج عملية إفراز 15.

وذكرت النهج المطبق هنا لأول مرة من قبل شاربنتييه وآخرون. ويستند على تحويل الخلايا من فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) صبغ CCF4 التي كتبها translocated المستجيب TEM-1 بيتا لاكتاماز اندماج 16 (الشكل 1A). CCF4 / AM هو مركب خلايا نفيذ التي ترتبط في المتفرعة الكومارين (المانحة) وشاردة فلوريسئين (متقبل) من خلال نواة السيفالوسبورين. عند الدخول السلبي في الخلية حقيقية النواة، ومعالجة عدم الفلورسنت أسترته CCF4 / AM بواسطة مركب esterases الخلوية إلى CCF4 اتهم والفلورسنت، وبالتالي المحاصرينداخل الخلية. الإثارة شاردة الكومارين في 405 نانومتر النتائج في الحنق إلى شاردة فلوريسئين، التي تنبعث إشارة مضان أخضر في 530 نانومتر. بعد الانقسام من السيفالوسبورين الأساسية من الحنق بيتا لاكتاماز تعطل والإثارة من شاردة الكومارين يؤدي إلى انبعاث مضان الأزرق at460 نانومتر. وقد وصفت التطبيقات المختلفة لهذه الطريقة في الأدب تسليط الضوء على تنوعها. يسمح طريقة لتحليل النبات في المختبر، وأيضا في في الجسم الحي، على سبيل المثال، تم استخدام هذه التقنية في نموذج عدوى الماوس لتحديد السكان الكريات البيض التي تستهدف النبات في الجسم الحي 17-19. ويمكن إجراء قراءات الإشارات باستخدام قارئ لوحة، وتحليل FACS أو مضان المجهر. من المذكرة، وطريقة يوفر أيضا إمكانية لمراقبة النبات في الوقت الحقيقي من خلال المجهر الخلية الحية أثناء 20،21 عملية العدوى. هنا تم تطبيق المسح بالليزر مضان المجهر لreadouطن من إشارات مضان كما يوفر أعلى حساسية ودقة. على وجه الخصوص، والقدرة على ضبط نافذة الانبعاثات بدقة نانومتر في تركيبة مع كشف حساسة عالية يسهل الأمثل كشف مضان وتقليل عبر الحديث. وبالإضافة إلى ذلك يمكن تكييف هذا الإعداد المجهر لرصد الوقت الحقيقي من النبات ويحتمل أن يسمح للتحليل المتزامن للتفاعل المضيف الممرض على المستوى الخلوي.

في هذه الدراسة معدلات النبات من Y. وقد تم تحليل القولون نوع السلالة البرية والحذف متحولة YopE اظهار النمط الظاهري hypertranslocator 10،11 exemplarily.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الذروة الانبعاثات وتحديد الصليب الحديث (انظر أيضا الشكل 2)

  1. من أجل تحديد القمم الانبعاثات وكمية من عبر الحديث بين الجهات المانحة (الكومارين مشابه V450) ومتقبل (فلوريسئين) الأصباغ، والقيام بمسح الطيفية من الخلايا المسمى مع كل من fluorophores الفردية في 405 نانومتر الإثارة.
  2. تحديد عرض النطاق الترددي 10 نانومتر في ذروة كل الصبغة التي سيتم استخدامها لقنوات المانحة ومتقبل (455-465 نانومتر، وهنا 525-535 نانومتر). مؤامرة كثافة تطبيع على الطول الموجي وحساب متوسط ​​نسبة عبر الحديث للصبغ المانحة في القناة متقبل والعكس بالعكس (الشكل 2).

2. إعداد Y. القولون سلالات لخلية الثقافة العدوى

  1. استخدام السلالات التالية: WA-314 PMK-البويضات (WA-314 تحولت مع البلازميدات PMK-بلوخ 17 و PMK-البويضات 17، على التوالي) وWA-314ΔYopE PMK-بلوخ (WA-314ΔYopE تحولت مع البلازميد PMK-بلوخ 17)
  2. يومين على الأقل قبل الإصابة خط Y. القولون سلالات WA-314 PMK-البويضات، WA-314 PMK-بلوخ وWA-314ΔE PMK بلوخ-من البرد الأسهم على لوحات LB-أجار التي تحتوي على المضادات الحيوية المطلوبة (كانامايسين لWA-314 PMK-بلوخ وWA-314 PMK-البويضات ؛ كانامايسين والتتراسيكلين لWA-314ΔE PMK-بلوخ) وتنمو O / N في 27 ° C. بعد ذلك الحفاظ على لوحات لمدة تصل إلى أسبوع واحد في 4 درجات مئوية.
  3. قبل يوم واحد العدوى تطعيم 3 مل من LB المتوسطة التي تحتوي على المضادات الحيوية المطلوبة مع مستعمرة واحدة من السلالات منها واحتضان O / N في 27 ° C في شاكر في 180 دورة في الدقيقة.
  4. في يوم من العدوى تطعيم 2 مل من O / N الثقافة في 40 مل من جديد LB متوسطة بدون المضادات الحيوية واحتضان لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية في شاكر في 180 دورة في الدقيقة للحث على التعبير عن نوع نظام III إفراز.
  5. نقل الثقافات في أنبوب مناسبة والحفاظ على الثقافات على الجليد أو على 4 درجات مئويةمن الآن فصاعدا. أجهزة الطرد المركزي الثقافات لمدة 10 دقيقة في 5000 x ج و 4 درجات مئوية.
  6. resuspend الكرية الجرثومي في 2-3 مل من الجليد PBS الباردة. تمييع تعليق البكتيرية إلى تركيز 8 × 10 8 كفو / مل باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تحديد الكثافة الضوئية المقابلة بشكل فردي. الحفاظ على هذا التعليق على الجليد حتى يصيب خلايا هيلا.

3. خلايا التصفيحات هيلا

  1. قبل يوم واحد البذور العدوى 1.5 × 10 4 الخلايا خلايا هيلا في 200 ميكرولتر DMEM تحتوي على 10٪ الحرارة المعطل مصل العجل الجنين (FCS) في الآبار من 96 لوحة جيدا وزراعة في 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية. البذور ثلاثة آبار لكل سلالة (ثلاث مرات حضانة مختلفة).

4. إصابة خلايا هيلا وتحميل مع CCF4

  1. تصيب خلايا هيلا بإضافة 3.5 ميكرولتر من تعليق البكتيرية إلى المتوسط ​​ومزيج من قبل pipetting بلطف المتوسطة مرتين. سماح للبكتيريا على الرسوبيات علىإلى الخلايا في وزارة الداخلية (شاردة من العدوى) من حوالي 100 بكتيريا في كل خلية. لدوام تبدأ العدوى في -90 دقيقة، -60 دقيقة -30 دقيقة و، واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة حتى 0 دقيقة لتحقيق نقطة نهاية المشتركة.
  2. عند اكتمال الحضانة، ونضح بعناية المتوسط ​​دون إزالة خلايا هيلا وإضافة 50 ميكرولتر من PBS تحتوي على 20 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول لوقف التعبير عن المؤثرات و 2.5 ملي البروبينسيد للحد من تصدير CCF4.
  3. في هذه المرحلة نقل لوحة 96-جيدا في مرحلة المجهر وتحديد المواقع المناسبة لتحليلها لاحقا في كل بئر. الانتهاء من هذه الخطوة في غضون 10 دقيقة (للاطلاع على تفاصيل الاستحواذ انظر القسم 5.1).
  4. لكل بئر، إضافة 70 ميكرولتر من محلول CCF4 / AM تحميل (0.24 ميكرولتر حل A، 1.2 ميكرولتر حل B، 18.56 ميكرولتر حل C (حل A، B، و C المقدمة ضمن CCF4 مجموعة / AM التحميل) و 50 ميكرولتر PBS (التي تحتوي على 20 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول و 2.5 ملي البروبينسيد) باستخدام متعددة صipette واحتضان لمدة 5 دقائق على RT. من الآن فصاعدا العمل دون انقطاع.
  5. نضح الحل التحميل وإضافة 100 ميكرولتر من PBS تحتوي على 20 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول و 2.5 ملي البروبينسيد باستخدام ماصة متعددة. ثم نقل بسرعة لوحة 96 بشكل جيد في المرحلة المجهر وبدء الحيازة في غضون 10 دقيقة من تطلع الحل التحميل.

5. الليزر الضوئي المجهري وتحليل البيانات

  1. الحصول على الصور
    1. تهيئة الظروف التصوير في وسيلة لتحقيق أقصى قدر من العدد الكلي الفوتون والحد من الضيائية، photobleaching من وعبر الإثارة.
      1. في متحد البؤر الليزر مجهر المسح الحديثة، واستخدام عالية العددية الهدف فتحة الغمر 20X، فتح الثقب كاشف 2.5 وحدات إيري (أي باجتزاء البصرية واسعة)، واختيار حساسية عالية GaAsP للكشف مع القنوات النشطة في نفس الوقت المانحة ومتقبل، وعمق 8 بت ، ~ 750 نانومتر حجم بكسل، 3 أضعاف إطار المتوسط ​​وكسكيته مع 10٪ من 405 نانومتر ليزر ديود.
      2. لضمان الكمي الصحيح تعيين مكسب للكشف عن كل من القنوات لنفس القيمة وتجنب أي بكسل المشبعة.
        ملاحظة: وهنا، تم تعيين المكاسب إلى 150٪.
    2. ضمان الغمر المستمر من خلال نشر غمر متوسطة إلى الجزء السفلي من الآبار، على سبيل المثال مع حقنة 1 مل، وتجنب محاصرة أي فقاعات الهواء.
    3. تفعيل الضوء المرسل وايجاد مجال التمثيل نظر في كل جيدا. استخدام مرحلة التلقائية معايرة بشكل صحيح ووضع علامة على موقف في البرنامج.
    4. بعد إزالة لوحة لتلطيخ (انظر القسم 4.3)، أعد لوحة وإضافة الوزن على رأس لتجنب الانجراف البؤري. مراجعة المواقف حفظها مع وضع المسح الضوئي ليزر وضبط التركيز والموقف الجانبي بشكل صحيح.
    5. تعيين الفاصل الزمني لمدة 2 دقيقة، ومدة إلى 2 ساعة وتبدأ الاستحواذ.
  2. صورة الكمي (سوف تعطى أمثلة لBitplane تحديثات برامج المزودهي مثل Imaris)
    1. استيراد بيانات إلى البرمجيات التي تسمح العمليات الحسابية المصفوفات بكسل. القيام بذلك عن طريق سحب وإسقاط الملف المصدر تحتوي على كل من المتبرع وقناة متقبل على أيقونة البرنامج.
    2. طرح الخلفية في كل القنوات باستخدام معادلة نفسه. للقيام بذلك، انقر فوق القائمة ثم انقر فوق صورة> تجهيز> الأساس الطرح. حدد كل قناة وأدخل القيمة الأساسية.
    3. تصحيح تنزف من خلال القناة المانحة (CH1) في القناة متقبل (CH2) مع تصحيح عامل و محددة مسبقا (انظر 1.1)، وخلق قنوات جديدة:
      CH2 '= CH2 - CH1 * و
      وكان من تنزف من خلال لمتقبل في قناة المانحة لا يمكن اكتشافها على مستوى الضوضاء: ملاحظة.
      1. انقر فوق قائمة> معالجة الصور> قناة علم الحساب وأدخل القيمة المطلقة (ch2- (CH1 * 0.33)). بعد ذلك حذف القناة 2 بالنقر فوق قائمة تحرير> حذف> القنوات. ضمانتنزف من خلال تصحيح قناة متقبل يبقى كما القناة الجديدة 2. اختياري: تغيير لون القناة من اللون الرمادي إلى اللون الأصلي عن طريق الذهاب إلى القائمة> تحرير خصائص> صورة. حدد القناة 4> المعينة اللون> قاعدة اللون وتغييره إلى مثل الأخضر.
    4. إنشاء قناة جديدة مع العملية التالية لتحديد معامل الحنق النسبي:
      CH3 CH2 = '/ (CH1 CH2 +')
      1. اذهب إلى القائمة> معالجة الصور> قناة علم الحساب وأدخل CH2 ./ (CH1 CH2 +)
    5. التصور الصحيح للقناة الحنق في صورة 8 بت، إنشاء قناة الرابعة:
      CH4 = 255 * CH3
      1. اذهب إلى القائمة> معالجة الصور> قناة علم الحساب وإدخال 255 * CH3. تغيير لون قناة بالذهاب إلى القائمة> تحرير خصائص> صورة. حدد القناة 4> المعينة ملف جدول اللون> اللون> جيت.
    6. تطبيق عامل تصفية المتوسط ​​3X3 إلى قنوات CH3 CH4 وثار سوف يقلل من الضوضاء في الصور. للقيام بذلك، انقر فوق إلى القائمة> معالجة الصور> تنعيم> تصفية متوسط. تحديد كل القنوات وتطبيق حجم مرشح "3x3x1".
    7. لتقدير الإشارات الخلوية، والكشف عن الخلايا في CH4 عن طريق وضع بشكل صحيح إزاحة وتصفية الهياكل حسب الحجم لاستبعاد هياكل صغيرة جدا.
      1. حدد تفوق عرض وانقر على أيقونة "إضافة السطوح جديدة". تعريف المعلمات خوارزمية الكشف في إطار السطحية. لمعالجة أسرع، وتفعيل اثنين خانات "الجزء فقط منطقة الفائدة" و "العملية برمتها صورة في نهاية المطاف". تحديد المنطقة ذات الاهتمام بتحرير أبعادها.
      2. حدد القناة 4 كقناة المصدر وتعيين العتبة مستوى العتبة> خلفية الطرح (التباين المحلي) وتعيين قطرها إلى 10 ميكرون. تعيين الحد الأدنى لعتبة كثافة يدويا إلى 0 والحد الأقصى للعتبة إلى أقصى intensiتاي. تصفية الهياكل حسب المنطقة وتحديد الحد الأدنى لقيمة لمثل 187 μm². الانتهاء من الكشف عن السطح.
    8. استخراج القيم المتوسطة لكثافة مضان المانحة (CH1) ومعامل الحنق النسبي (CH3) وانحرافاتها المعيارية في الكيان الخلوية. للقيام بذلك، انتقل إلى خصائص السطح. تغيير مظهر الهياكل عن طريق تحديد السطوح النمط / الجودة> السطحية. تحديد كافة الهياكل عن طريق النقر على علامة التبويب المرشحات. توحيد الهياكل الكشف من خلال الذهاب الى عملية الإختيار> توحيد. تصدير إحصاءات السطح لMS Excel عن طريق النقر في علامة التبويب إحصائيات> تصدير جميع الاحصائيات إلى ملف.
    9. رسم هذه القيم مع مرور الوقت. تحديد الفاصل الزمني 10 دقيقة من منحدر الحد الأقصى لقناة المانحة زيادة مضان لكل حالة كمعلمة معقولة لتمثيل كمية المستجيب translocated. حساب المنحدر كما م = Δ كثافة مضان المانحة الوقت / Δ (دقيقة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لإثبات القدرة على الطريقة الموصوفة لتحليل كمي المستجيب النبات إلى الخلايا المستهدفة، تم دراسة سلالتين اليرسنية مع حركية النبات مختلفة: Y. القولون نوع السلالة البرية WA-314 (المصلية O8 أو إيواء البلازميد الفوعة pYVO8 22) ومشتقاته WA-314ΔYopE (WA-314 بإيواء pYVO8ΔYopE 23). وأظهر العمل في وقت سابق أن Y. المسوخ القولون تفتقر الوظيفي المعرض YopE أعلى بشكل ملحوظ معدل النبات يوب 10. تم تحويل كل من سلالات مع ترميز ناقلات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا طبقت بنجاح مقايسة على أساس TEM-1 مراسل بيتا لاكتاماز للتحليل الكمي من المستجيب النبات عن طريق Y. القولون. وقد وصفت العديد من الأشكال المختلفة لهذه التقنية حساسة ومحددة واضحة نسبيا في الأدب. في هذه الدراسة تم إجراء المسح الضوئي ليزر المجهري للكشف الأكثر حساسية ودقة من إشارات مضان. على وجه التحديد تصحيح عبر الحديث بين الأصباغ المانحة ومتقبل وعرض النطاق الترددي الكشف قابل للتعديل بشكل فردي تسمح دقة فائقة القياس بالمقارنة مع الأشكال الأخرى من هذه الطريقة. النتائج تظهر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور أنطونيو فيرجيليو فايلا على توفير خوارزمية القياس الكمي لاكتساب FRET وإروين بون لتوفير تركيبات pMK-bla و pMK-ova.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
LB-AgarRothX969.2
رطل متوسطRothX968.2
Dulbecco s لوح المحلول الملحي الممخزن بالفوسفاتسيجما-ألدريتشD8662-500ML
96 بئر (أسود ، قاع شفاف)Greiner Bio One655087
DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، مكمل GlutaMAX ، البيروفاتGibco / Life Technologies31966-047
طقم تحميل ProbenecidSigma-AldrichP8761-25G
LiveBLAzer FRET-B / G مع تقنيات CCF4-AMLifeK1095
الليكتين من Triticum vulgaris (القمح) FITC المترافقSigma-AldrichL4895يستخدم لذروة الانبعاث وتحديد الحديث المتبادل
V450 الفئران المضادة للفأر CD8aBDBioscience 560469تستخدم لذروة الانبعاث وتحديد الحديث
المتقاطع Immersol W الغمر oil Zeiss444969-0000-000معامل الانكسار = 1.3339 @ 23 ° ؛ C
TCS SP5 II مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤرLeica microsystems2x كاشفات GaAsP-Hybrid ، مطياف 4 قنوات ، مقسم شعاع بصري acusto ، مرحلة XY الآلية ، ثقب قابل للتعديل ، الهدف 20X HC PL APO CS IMM / CORR ، 405 & # 160 ؛ ليزر الصمام الثنائي NM 50 & # 160 ؛ برنامج mW
Imaris 7.6Bitplane Plugins وشملت ImarisXT و MeasurementPro
MatLab وقت تشغيلبرنامج MathWorks
Prism 5GraphPad

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
  2. Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).
  3. Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. Yersinia's stratagem: targeting innate and adaptive immune defense. Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).
  4. Viboud, G. I., Bliska, J. B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).
  5. Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).
  6. Pettersson, J., et al. Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).
  7. Schweer, J., et al. The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases. PLoS Pathog. 9 (11), e1003746(2013).
  8. Wolters, M., et al. Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein. J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).
  9. Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity. PLoS Pathog. 4 (1), e3(2008).
  10. Aili, M., et al. Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE. Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).
  11. Gaus, K., et al. Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue. Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).
  12. Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation. Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).
  13. Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).
  14. Sory, M. P., Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).
  15. Schlumberger, M. C., et al. Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).
  16. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).
  17. Koberle, M., et al. Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model. PLoS Pathog. 5 (8), e1000551(2009).
  18. Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo. PLoS Pathog. 3 (12), e196(2007).
  19. Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. Plague bacteria target immune cells during infection. Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).
  20. Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli. MBio. 4 (4), (2013).
  21. Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).
  22. Heesemann, J., Laufs, R. Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid. J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).
  23. Zumbihl, R., et al. The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA. J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CCF4 AM FRET HeLa YopE

مقالات ذات صلة