مقالة منهجية

تقنية تسمية خالية لتصوير المكانية والزمانية لإفرازات خلية واحدة

DOI:

10.3791/53120

⸱

نوفمبر 23, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Materials Science and Technology, Naval Research Laboratory, 2Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاتصالات بين الخلايا أمر بالغ الأهمية للسيطرة على مختلف الأنشطة الفسيولوجية داخل وخارج الخلية. وتصف هذه الورقة بروتوكول لقياس طبيعة المكانية والزمانية لإفرازات خلية واحدة. ولتحقيق ذلك، يستخدم نهج متعدد التخصصات الذي يجمع بين nanoplasmonic التسمية خالية الاستشعار مع تصوير الخلايا الحية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الاتصال بين الخلايا جزءا لا يتجزأ من نظام معقد يساعد في الحفاظ على الأنشطة الخلوية الأساسية. نتيجة لذلك ، يمكن أن يؤدي خلل هذه الإشارات إلى العديد من الاضطرابات. لفهم الإشارات من خلية إلى أخرى ، من الضروري دراسة الطبيعة المكانية والزمانية للجزيئات المفرزة من الخلية دون إزعاج البيئة المحلية. تم تطوير فحوصات مختلفة لدراسة إفراز البروتين ، ومع ذلك ، تعتمد هذه الطرق عادة على مجسات الفلورسنت التي تعطل مسارات الإشارات ذات الصلة. للتغلب على هذا القيد ، يلزم وجود تقنية خالية من الملصقات.

في هذه الورقة ، نصف تصنيع وتطبيق تقنية التصوير بالرنين البلازمون السطحي الموضعي الخالي من الملصقات (LSPRi) القادرة على اكتشاف إفرازات البروتين من خلية واحدة. يتم تصميم الهياكل النانوية البلازمونية بشكل حجري على غطاء زجاجي قياسي ويمكن إثارتها باستخدام الضوء المرئي على المجاهر الضوئية المتاحة تجاريا. يتم تغطية جزء صغير فقط من الغطاء بواسطة الهياكل النانوية ، وبالتالي فإن هذه التقنية مناسبة تماما للجمع بين التقنيات الشائعة مثل التألق والتصوير في المجال الساطع.

يتم استخدام نهج متعدد التخصصات في هذا البروتوكول يتضمن التصنيع النانوي للمستشعر والوظيفة الحيوية اللاحقة ، وتوصيف حركية الربط للترابط والتحليل ، وتكامل الرقاقة والخلايا الحية ، وتحليل الإشارة المقاسة. بشكل عام ، تتيح هذه التقنية نهجا عاما خاليا من الملصقات لرسم خرائط للإفرازات الخلوية وربطها باستجابات الخلايا القريبة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاتصالات بين الخلايا هو أمر حاسم لتنظيم العديد من الأنشطة الفسيولوجية داخل وخارج الخلية. مجموعة متنوعة من البروتينات والحويصلات يمكن يفرز التي تؤدي فيما بعد العمليات الخلوية المعقدة مثل التمايز، والتئام الجروح، الاستجابة المناعية، والهجرة، والانتشار. قد تورطت 1-5 الأعطال من مسارات الإشارات بين الخلايا في أمراض عديدة منها السرطان وتصلب الشرايين ، ومرض السكري، على سبيل المثال لا الحصر.

يجب أن تكون الخلية الأمثل إفراز فحص قادرة على مكانيا وزمانيا رسم خرائط بروتين يفرز من الفائدة دون تعطيل مسارات الإشارات ذات الصلة. وبهذه الطريقة يمكن الاستدلال على العلاقات السببية بين ملامح التركيز واستجابة الخلايا المستقبلة. لسوء الحظ، فإن العديد من التقنيات التي تعتمد الفلورسنت الأكثر استخداما لا تلبي هذه المعايير. البروتينات الفلورية الانصهار يمكن استخدامها لعلامة الحليلة ثithin الخلية ولكن يمكن أن يعطل مسار إفرازية، أو إذا يفرز نتائج في توهج منتشر خارج الخلية التي يصعب قياسها كميا. المقايسات القائم على immunosandwich الفلورسنت هي الأكثر استخداما التقنيات للكشف عن الإفرازات الخلوية ولكنها تتطلب عادة عزل الخلايا الفردية. 6-11 وبالإضافة إلى ذلك، وإدخال من الأجسام المضادة الاستشعار عادة ما يوقف أو ينهي التجربة وحجم التسميات الأجسام المضادة، 150 كيلو دالتون للمفتش، وعائقا أمام إشارات المصب.

بسبب هذه الحواجز فمن الأفضل أن تقنية خالية من التسمية أن تستخدم لإفرازات البروتين الصورة وبين تقنيات خالية من التسمية الحالية، سطح صدى مأكل (SPR) والمترجمة صدى مأكل السطح (LSPR) أجهزة الاستشعار مرشحين ممتازة. 12-17 هذه وقد استخدمت أجهزة الاستشعار على نطاق واسع للدراسات ملزمة تحليلها من البروتينات، exosomes والمؤشرات الحيوية الأخرى. 18-24 وفي حالة LSPR، وnanostr plasmonicuctures يمكن منقوشة lithographically على coverslips الزجاج ومتحمس باستخدام الضوء المرئي عبر تكوينات المجهر واسعة المجال القياسية. ونظرا لحضورها النانوية، والغالبية العظمى من الركيزة الزجاج متاحة لتقنيات التصوير الشائعة مثل مشرق الميدان والفحص المجهري مضان جعل هذه التحقيقات أيضا مناسبة للتكامل مع المجهر الخلية الحية. 25-28 لقد أثبتنا قياس الوقت الحقيقي من إفرازات الجسم المضاد من خلايا هجين استخدام الذهب functionalized النانو plasmonic مع القرارات المكانية والزمانية من 225 ميللي ثانية و 10 ميكرون، على التوالي. ويتضح تكوين رقاقة الأساسي في الشكل 1. 28 ينقسم مسار الضوء الناتج من المجهر بين كاميرا CCD المستخدمة في التصوير ومطياف جانب الألياف بصريا لتحديد الكمي للشغل كسور من مجموعة معينة من النانو (الشكل 2 ).

وprotocرأ الواردة في هذه الورقة يصف التصميم التجريبي لقياس الوقت الحقيقي من إفرازات خلية واحدة في حين رصد في الوقت نفسه استجابة الخلايا باستخدام معيار المجهر مشرق الميدان. يتضمن نهج متعدد التخصصات لتصنيع النانو، functionalization من النانو لتقارب عالية ملزم من التحاليل، والتحسين السطح لكل من التقليل غير محددة وملزمة وتميز الثوابت معدل الحركية باستخدام سطح التجاري بلازمون الرنين (SPR) الصك، دمج خطوط الخلايا على الركيزة، وتحليل الصور والبيانات الطيفية. نتوقع هذه التقنية أن تكون التكنولوجيا ملائمة لرسم الخرائط المكانية والزمانية من إفرازات الخلية وعلاقاتها السببية مع الخلايا المستقبلة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. البنية النانوية تلفيق

  1. اختيار 25 مم coverslips الزجاج قطر مع سمك تقريبي من 170 ميكرون (رقم 1،5) بمثابة ركائز للnanofabrication.
  2. تزج لل coverslips في حل سمكة البيرانا (3: 1 نسبة من حامض الكبريتيك وبيروكسيد الهيدروجين) لمدة 6 على الأقل ساعة. غسل سمكة البيرانا غارقة ساترة مع كمية وفيرة من عالى النقاء 18.2 MΩ منزوع الأيونات الماء المقطر (DDW).
    تنبيه: حمض سمكة البيرانا يتفاعل بعنف مع المواد العضوية ويجب التعامل معها بعناية فائقة.
  3. إيداع 10 نانومتر الكروم طبقة رقيقة على لل coverslips بواسطة البريد شعاع تبخر لتجنب الآثار تهمة خلال الزخرفة والتصوير النانو.
  4. تدور الطبقة الأولى من طبقة ثنائية تقاوم تتكون من ميتاكريليت الميثيل إيثيل اللاكتات (MMA_EL6) من البوليمرات في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية ثم تخبز في 150 ° C. تدور الطبقة الثانية من بولي ميثيل ميتاكريليت (950PMMA_A2) في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية ثم يخبز على حرارة 180 درجة مئوية.
  5. طقطقن طبقة ثنائية تقاوم باستخدام الطباعة الحجرية شعاع الالكترون (EBL) في 25 كيلو فولت مع جرعة مساحة 300 μC / سم 2. تطوير في ايزوبروبيل (IPA) / الميثيل كيتون إيسوبوتيل (MIBK): 2/1 وشطف في IPA.
  6. ودائع تي (5 نانومتر) / الاتحاد الافريقي (80 نانومتر) الفيلم على الركيزة باستخدام المبخر شعاع ه.
  7. بعد ترسب الذهب، ورفع قبالة طبقة ثنائية البوليمرات تقاوم عن طريق نقع الركيزة في الأسيتون لمدة 4 ساعة.
  8. تفقد الركيزة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لتأكيد شكل البنية النانوية والحجم، وإزالة الكروم المتبقية من الركيزة عن طريق حفر الرطب باستخدام CR-7 منمش لمدة 60 ثانية في RT ثم يشطف في أحواض دبي الجافة العالمية.
  9. تصميم تباعد مجموعة مركز إلى مركز من 33 ميكرون أن تترك مجالا للتصوير خلية بين المصفوفات. نمط من النانو في 20 × 20 نمط لكل مجموعة مع الملعب من 300 نانومتر باستخدام الكاتب شعاع ه. كل رقاقة تحتوي على 300 صفائف مع البعد البنية النانوية نموذجية من ارتفاع 80 ± 2.5 نانومتر و 70 نانومتر ± 2.5 دياميثالثا.
  10. تفقد مجموعة فرعية من المصفوفات باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM) للتحقق من حجم والتوحيد.
  11. إرفاق حلقة الدعم، وعادة السيليكون، إلى الجزء الخلفي من ساترة باستخدام الايبوكسي العلاج بالأشعة فوق البنفسجية.

2. رقاقة تنظيف وتطبيق واحد رقائق تجميعها الذاتي

  1. لتنظيف وتجديد رقائق، ورماد البلازما في قوة 40 واط في خليط 300 mTorr من 5٪ هيدروجين و 95٪ الأرجون لمدة 45 ثانية بعد تنظيف الغرفة لمدة 5 دقائق في ظل نفس الظروف.
  2. Functionalize والنانو ذهب مباشرة بعد ashing البلازما عن طريق غمر الشريحة في حل ثيول الكحولي اثنين من المكونات التي تتألف من 3: 1 نسبة من SH- (CH 2) 8 -EG 3 -OH (SPO) وعنصر إما مع أمين أو الكربوكسيل مجموعة وظيفية، وهي SH- (CH 2) 11 -EG 3 -NH 2 (SPN) أو SH- (CH 2) 11 -EG 3 -COOH (SPC).
  3. مغادرة ط رقاقةن الحل ثيول O / N لتشكيل أحادي الطبقة الذاتي تجميعها (SAM).
  4. شطف رقاقة مع الإيثانول والجافة مع غاز النيتروجين.
  5. إذا لزم الأمر، وتخزين رقاقة functionalized لتصل إلى 2 أسابيع في 4 درجات مئوية.
  6. عندما تصبح جاهزة للاستخدام الرد على SPN أو مكون SPC مع يجند باستخدام الكيمياء تبعا ليجند من خيار (انظر أدناه).
    ملاحظة: رقائق يمكن تجديدها وإعادة functionalized عشرات المرات. شريحة معينة يمكن استخدامها لفترات تتراوح من 6 أشهر إلى أكثر من عام. أطياف يقاس على مجموعة معينة ترد موثوق بعد regenerations المتكررة التي ashing البلازما، تليها biofunctionalization 29

3. Functionalization السطحية والحركية توصيف

ملاحظة: استخدام رقاقة functionalized في الصك من موارد البرنامج الخاصة التجاري لتوصيف الثوابت معدل الحركية بين يجند وتحليلها، وكذلك لدراسة مقاومة SAM لب غير محددةinding. هناك مجموعة واسعة من معدلات التدفق والتصاميم الموائع الدقيقة التي تسمح للكفاءة functionalization السطح. لأن لدينا SPR المتاحة تجاريا نحن موحدة حول أوصى معدلات تدفقها. ونلاحظ أن هذه المعدلات تدفق هي نموذجية من جميع الصكوك SPR وليست تقييدا ​​لذلك. الصك من موارد البرنامج الخاصة ليست ضرورة لأن جميع functionalization يمكن القيام به مباشرة على رقاقة LSPR، لكنها لم تقلل عبء العمل لدينا لأنها أداة المضاعفة في حين لدينا LSPR الإعداد ميكروفلويديك ليست كذلك.

  1. Functionalize تجاري رقاقة الذهب عارية مع SAM كما هو موضح في القسم 2.
  2. إذا باستخدام SAM SPC القائمة على تفعيل مجموعة الكربوكسيل مع 1: 1 خليط من 133 ملي من 1 إيثيل-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) و 33 ملم من N -hydroxysuccinimide (NHS) في أحواض دبي الجافة العالمية ل10 دقيقة.
  3. تصريف مجموعة الكربوكسيل تفعيلها مع الأجسام المضادة / يجند من الفائدة لمدة 300 ثانية باستخدام معدل تدفق 30 ميكرولتر / دقيقة. إعداد بروابط فيدرجة الحموضة 6 عازلة الفوسفات، عادة، ولكن هذا يمكن أن تختلف تبعا للجزيء.
  4. بعد الاقتران يجند، وتدفق 0.1 M ايثانول في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) كخطوة deactivator لمدة 300 ثانية بمعدل 30 ميكرولتر / دقيقة. ايثانول يساعد في تقليل غير محددة وملزمة.
  5. يعرض تحليلها من الفائدة بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / دقيقة باستخدام مجموعة من تركيزات وحساب الثوابت معدل الحركية باستخدام برامج التحليل الحركي.
  6. إذا غير محددة وملزمة إشكالية، وزيادة نسبة SPO إلى SPC أو SPN.

4. إعدادات LSPR عامة

  1. ضبط المجهر:
    1. استخدام 100 W الهالوجين مصباح لكوهلر إلقاء الضوء على عينة. استخدام تمرير مرشح طويلة (عادة 593 نانومتر قطع) في مسار الضوء للقضاء على الأطوال الموجية التي لا تساهم في تحول الرنين (الشكل 2).
    2. لجمع البيانات LSPRi، استخدام مجهر مقلوب مع immersio النفط 40Xالهدف ن (1.4 NA) والحرارية لتبريد 16 بت كاميرا CCD.
    3. وضع الحزمة الخائن في منفذ إخراج المجهر للحصول على صور والأطياف في وقت واحد.
    4. ضبط درجة الحرارة التي تسيطر عليها المرحلة المجهر إلى 37 ° C وتتوازن لمدة 4 ساعات.
    5. دمج جمعية حضانة إضافي على المجهر لتنظيم تركيز CO 2 والرطوبة بنسبة 5٪ و 95٪ على التوالي.
  2. إعداد شريحة وتركيب:
    1. Functionalize رقاقة LSPR كما هو موضح في القسم 2 مع مركبين المثلى نسب SAM تحديد من التجارب SPR.
    2. تحميل الشريحة في غضون حامل ميكروفلويديك العرف على النحو التالي. وضع رقاقة على قطعة أسفل الألمنيوم. ساندويتش رقاقة بين هذه القطعة السفلي وحشية السيليكون والبلاستيك كبار قطعة واضح. استخدام 4 مسامير لكبح التجمع.
    3. لتطبيق ثيول نموذجي على أساس SPC، إسقاط معطف 300 ميكرولتر 1: مزيج 1البنية من 133 ملي من EDC و 33 ملم من NHS في أحواض دبي الجافة العالمية لتنشيط مجموعات الكربوكسيل العنصر SPC ثيول.
    4. الانتظار لمدة 10 دقيقة ويشطف سطح يدويا مع 10 ملي برنامج تلفزيوني.
    5. تصريف مجموعة الكربوكسيل تفعيلها مع يجند (عادة الأجسام المضادة أو الأجسام المضادة جزء) من الفوائد بنسبة انخفاض طلاء 300 ميكرولتر من الحل يجند.
    6. الانتظار لمدة 30 دقيقة ويشطف يدويا مع 10 ملي برنامج تلفزيوني.
    7. إسقاط معطف 300 ميكرولتر من 0.1 M ايثانول في برنامج تلفزيوني على شريحة لتقليل ملزمة انوعي. الانتظار لمدة 10 دقيقة.
    8. غسل ايثانول مع PBS تحتوي على 0.005٪ توين 20 (PBS-T20).
    9. ضع قطعة الكوارتز فوق رقاقة للحد من التقلبات في البيانات المتعلقة هلالة تغيير.
    10. الحفاظ على رقاقة الرطب مع العازلة PBS-T20 بينما المتزايدة على المجهر.
    11. وضع التجمع رقاقة LSPR بقوة داخل ساخنة صاحب العينة مرحلة وإرفاق أنابيب ميكروفلويديك.
    12. إرفاق أنابيب على microfluidics إلى التجمع وتدفق بويتم التوصل إلى ffer (أو وسائل الإعلام الحرة المصل للدراسات خلية) حتى حالة مستقرة.
    13. السماح للتجميع ومجهر لكي تتوازن لا يقل عن 2 ساعة.
    14. محاذاة رقاقة باستخدام عصا التحكم بحيث يتم محاذاة مجموعة المركزية، مع الألياف البصرية للتحليل الطيفي. يتم أخذ البيانات الطيفي باستخدام مطياف وبرامج التحليل الطيفي.
    15. الحفاظ صفائف في التركيز في كافة مراحل التجربة باستخدام برنامج ضبط تلقائي للصورة، زايس التركيز مؤكد أو جهاز ضبط تلقائي للصورة ما يعادلها.

5. التصوير LSPR من إفرازات مكافحة ج-MYC من 9E10 خلايا ورم هجين

ملاحظة: الخط خلية هجين المستخدمة في هذه الدراسة تعبير عن معاداة ج-MYC الأجسام المضادة بشكل جوهري، وبالتالي لا تتطلب مشغل الكيميائية

  1. Functionalize والنانو مع ج-MYC الببتيد. وهذا له قيمة K D من 1.77 نانومتر للأجسام المضادة للج-MYC التي يفرزها استنساخ خلايا 9E10 هجين.
  2. ثقافة الخلايا هجين في الإنشائيةالبريد متوسطة النمو مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ للمضادات الحيوية في قارورة T75 عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO 2. الحفاظ على كثافة الخلية من 4 × 10 5 خلية / مل.
  3. للدراسات إفراز الخلايا، والخلايا بيليه من القارورة T75 بواسطة الطرد المركزي، ويغسل مرتين مع RPMI-1640 مصل وسائل الاعلام الحرة (SFM) لإزالة الأجسام المضادة يفرز وضبط كثافة الخلية إلى 4 × 10 6 خلية / مل.
  4. حصاد الخلايا واختبار الجدوى قبل تعريفهم إلى رقائق LSPR.
  5. إدخال 50 ميكرولتر من الحل خلية يدويا على رقائق LSPR مع micropipette. بعد بضع دقائق 25-50 الخلايا تلتصق على سطح رقائق LSPR.
  6. يغسل الخلايا المتبقية في حل مع SFM جديدة باستخدام نظام نضح ميكروفلويديك.
  7. حدد صفائف LSPR للتصوير والتي هي قريبة، في غضون 10 ميكرون، ولكن ليس التداخل مع الخلايا.
  8. للتأكد من أن إشارة محددة إلى يفرز معاداة ج-MYC antibodies إدخال وسائل الإعلام ثقافة الخلية مع وبدون الأجسام المضادة الحالية وكذلك مع الأجسام المضادة ولكن مع مواقع الربط على حظره من قبل وجود تركيز تشبع من ج myc الببتيد في الحل.
  9. معايرة أجهزة الاستشعار في نهاية كل شوط مع حل تشبع معاداة ج-MYC الأجسام المضادة (250 نيوتن متر). وهذا يساعد في تطبيع استجابة من أجهزة الاستشعار وتحديد الإشغال كسور استنادا إلى بيان biofunctionalization من كل شوط.
  10. تصحيح الانحراف في اتجاه X و Y باستخدام برنامج محاذاة الصورة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في دراسة إفراز الخلايا الحية نموذجية هناك طرق متعددة لجمع البيانات التي تجري الشكل 3 يظهر تراكب صورة LSPRi، الذي يسلط الضوء على صفائف مربع، والضوء النافذ صورة مضيئة الذي يسلط الضوء على الخلايا في أسفل اليسار. يتم جمع البيانات عادة على مدى 3-ساعة تليها مقدمة من حل تشبع من الحليلة لحساب التطبيع هو موضح أدناه. ويمكن أيضا أن تكون متكاملة الصور مضان في روتين جمع البيانات من قبل التحويل الآلي مكعب التصفية. في الشكل (4) خلية ملطخة صبغة الفلورسنت غشاء رودامين DHPE يسلك ملحقات مثل أقدام صفاحية (السهام). إذا كانت هذه الملحقات لتتداخل مع صفائف أنها تعطي إيجابية كاذبة لإفراز البروتين. يمكن وجود وسائط متعددة من الصور مساعدة في تحديد مثل هذه الحوادث.

ويبين الشكل 5 البيانات الطيف قبل والخلفإيه إدخال حل تشبع (400 نيوتن متر) من شراؤها تجاريا المضادة للج-MYC الأجسام المضادة لصفائف بين functionalized ج MYC. لم تكن هناك خلايا موجودة في هذه التجربة. يعرض الطيف كلا تحولا الحمراء وزيادة في كثافة. الفرق بين المناطق الخاضعة لالمنحنيين يؤدي إلى زيادة في كثافة صورة مجموعة في وضع LSPRi على كاميرا CCD. وقد تم تطوير منهج تحليل البيانات أقل المربعات غير الخطية للاستدلال الإشغال كسور من سطح ملزمة بروابط من الأطياف. 30،31

في نهاية التجربة، قيم الكثافة المشبعة (أي كسور الإشغال ≈ 1) وتستخدم لحساب استجابة طبيعية لكل مجموعة باستخدام الصيغة التالية:

أين هي كثافة طبيعية في وقت نقطة تي، وكثافة الأولية في بداية التجربة، وكثافة النهائية المشبعة، وكثافة يقاس من مجموعة في وقت نقطة ر

يتم عرض القيم تطبيع اثنين من صفائف في الشكل (6). وكان من بين مجموعة ضمن 10 ميكرون من الخلية قيد التحقيق في حين أن الآخر، وتستخدم كعنصر تحكم، وكانت على مسافة 130 ميكرون من الخلية. الزيادة المفاجئة في استجابة طبيعية من مجموعة الأقرب إلى خلية المتعلقة استجابة شقة من مجموعة السيطرة هي التي تشير إلى انفجار المترجمة من الأجسام المضادة يفرز.

figure-results-1
الشكل 1. الاستشعار تصميم. إيداع رسم تصور الهندسي لحية التجربة إفراز الخلايا العادية. الخلية (كروي الأزرق) إلى رقاقة LSPR الذي يحتوي على صفائف النانو الذهب biofunctionalized. في رأي التكبير في وإفراز الخلايا في المصالح، في هذه الحالة الأجسام المضادة كما هو موضح جزيئات على شكل Y، يتم قياس لأنها تربط إلى السطحمن النانو functionalized. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
يتم تصفية الشكل 2. إعداد البصري. ضوء مضيئة من مصابيح الهالوجين أول مرة من قبل مرشح تمريرة طويلة (LP). ضوء غير مستقطب خطيا (P1) وينير العينة عن طريق الهدف NA 40X / 1.4. يتم جمع ضوء متناثرة من هدف وتمريرها من خلال المستقطب عبرت (P2). يتم إدخال الخائن 50/50 شعاع (BS) في مسار الضوء جمعها لالطيفية في وقت واحد وتحليل الصور. أعلى اليمين: صورة مجهرية قوة ذرية من 9 النانو الفردية مفصولة الملعب من 300 نانومتر الرجاء انقر هنالعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
LSPRi الشكل 3. الخلية الحية دراسة. A اندمجت الضوء المرسل وLSPRi صورة تظهر خلية هجين واحدة (أسفل اليسار) محاطا 12 المصفوفات. هذا هو على النقيض من الصورة المحسنة. شريط النطاق هو 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الرقم 4. الخلية الحية الإسفار دراسة. A الفلورسنت صورة ملونة كاذبة عن خلية هجين واحدة ملطخة DHPE رودامين، وهو صبغ الغشاء. في وضع التصوير الفلورسنت صفائف غير مرئية بشكل عام، ومع ذلك، مجموعة القريبة هي ملاحظتها هنا كما ABتفتقر مربع في الزاوية اليمنى السفلى. ويمكن النظر إلى الخلية المراد فصله من مجموعة على الرغم من ملحقات مثل اللامسة (ربما أرجل كاذبة خيطية أو أقدام صفاحية) وتمتد إلى الخارج من الخلايا (السهام). شريط النطاق هو 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الرقم 5. الطيفي الطريقة. أطياف تم الحصول عليها من مجموعة functionalized ج-MYC قبل وبعد إدخال 400 نانومتر حل أضداد ج-MYC. لم تكن هناك خلايا موجودة في هذه الدراسة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6 الرقم 6. واحد إفراز الخلية. واستجابة لمجموعة تقع ضمن 15 ميكرون من خلية واحدة واحدة تقع 130 ميكرون بعيدا (التحكم). شريط النطاق هو 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتمتع تقنية التصوير LSPR الموضحة في هذا العمل بمزايا عديدة مقارنة بالمنهجيات التقليدية للكشف عن إفرازات الخلايا. أولا ، الدقة الزمنية لتقنيتنا في حدود الثواني في حين أن البديل التجاري ، وهو اختبار مناعي يعرف باسم EliSpot ، له دقة زمنية نموذجية تتراوح من 2 إلى 3 أيام. 7،32 نتيجة لذلك ، تمكنا من حل التغيرات المفاجئة في معدل إفراز البروتين ، مثل تلك الموضحة في الشكل 6. ثانيا ، يسمح وجود مصفوفات موزعة على الشريحة بتتبع الإشارة المفرزة في المكان والزمان مما يتيح مقارنات أكثر صرامة مع النماذج القائمة على الانتشار لإفراز الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام المصفوفات مثل مصفوفة التحكم الموضحة في الشكل 6 لطرح التغييرات العالمية في الصورة التي تنشأ عادة من عوامل مفيدة مثل انحراف التركيز. ثالثا ، لا تتطلب تقنيتنا أي تعديل للخلايا. إذا رغبت في ذلك ، يمكن أن تتضمن التجربة علامات شائعة الاستخدام مثل بروتينات الفلورسنت ، ولكن إذا كان هناك قلق من أن هذه العلامات قد تؤثر سلبا على بقاء الخلية أو التوازن ، فإن الطبيعة الخالية من الملصقات لنهجنا لا تتطلب ذلك. رابعا ، باستخدام البيانات الطيفية ، أظهرنا أنه يمكن حساب المعلومات الكمية المتعلقة بالإشغال الجزئي للروابط المرتبطة بالسطح.

هناك العديد من الطرق البديلة ل EBL لتصنيع الجسيمات النانوية المعدنية. ومع ذلك ، فقد وجدنا أن EBL يوفر مرونة كبيرة لتحسين البنية النانوية وأبعاد المصفوفة لتناسب البصريات والخلايا قيد التحقيق على أفضل وجه. من الأهمية بمكان أيضا حقيقة أنه يمكن تجديد الرقائق بسهولة عن طريق رماد البلازما. بهذه الطريقة ، يمكن استخدام شريحة نموذجية عشرات المرات. يجب تعديل تفاصيل الوظيفة الحيوية للتطبيق المحدد. قام البروتوكول المقدم هنا بترافق السطح مع روابط ببتيد c-myc صغيرة نسبيا. تتطلب الروابط الأكبر حجما مثل الأجسام المضادة الكاملة عادة مزيدا من التباعد وبالتالي نسبة SPO إلى SPN / SPC أعلى. بغض النظر ، فإن طبقة SAM جيدة التكوين ضرورية لمنع الارتباط غير المحدد في تجارب الخلايا الحية. بشكل عام ، يتم اكتشاف تحليلات الوزن الجزيئي الأكبر بسهولة أكبر بواسطة LSPR. وبالتالي ، في مظهرها أحادي الخلية ، قد لا تكون هذه التقنية مناسبة للكشف عن إفراز البروتينات الصغيرة ، مثل السيتوكينات.

تم استخدام الإعداد الحالي لدراسة الخلايا الفردية غير الملتصقة. هناك عدد كبير من بروتينات الإشارات المفرزة والحويصلات التي تنطبق عليها النتائج المبلغ عنها في هذا العمل بشكل مباشر. على سبيل المثال ، المستضد السرطاني الجنيني (CEA) ، والذي كان لعقود من الزمن علامة تشخيصية للسرطان. من المعروف أن خلايا سرطان القولون تفرز CEA بمعدلات آلاف الجزيئات / الخلية / الساعة والوزن الجزيئي 180 كيلو دالتون وهو ما يتجاوز وزن الأجسام المضادة IgG. يعتقد أن CEA متورطة في مسارات إشارات الأوتوكرين والباراكرين ولكن لم يتم قياس الطبيعة المكانية والزمانية لهذه الإفرازات أبدا. يمكن لتقنيتنا معالجة أسئلة الإشارات هذه مباشرة. سيكون امتداد هذا العمل هو قياس الطبيعة المكانية والزمانية لإفراز CEA من الخلايا المفردة. 33 سيركز العمل المستقبلي أيضا على دمج LSPRi مع مزارع الخلايا ثنائية وثلاثية الأبعاد للخلايا الملتصقة. من خلال دمج مصفوفات متعددة الإرسال قادرة على اكتشاف عدد من البروتينات المفرزة بالتوازي ، فإن هذه التقنية لديها القدرة على فتح نافذة جديدة على إفرازات الخلايا وكيفية تأثيرها على الخلايا المجاورة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر جورج أندرسون على التعليقات والمناقشات المفيدة. تم دعم هذا العمل من قبل معهد علوم النانو التابع لمختبر البحوث البحرية وجائزة الزمالة البحثية للمجلس الوطني للبحوث.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
25&# 160; غطاء زجاجي بقطر مم أدواتالعلوم الحيوية CSHP-No1.5-25  170± 5 وميكرو ؛ م هو الأمثل
بولي ميثيل ميثاكريليتميكروكيمياءPMMA 950 A4
إيثيل لاكتات ميثيل ميتاكريليتميكروكيمMMA EL6
مبخر شعاع الإلكترونTemescalFC-2000
الطباعة الحجرية شعاع الإلكترونسلسلة رايث150
الإيثانولسيجما ألدريتش459836
الأسيتونSigma-Aldrich320110
CR-7 حفر الكرومCyantekCR-7
مجهر إلكتروني ضوئيZeissUltra 55
مجهر القوة الذريةVeecoNanoscope III
نظام رماد البلازماسلسلة تقنيات85 RIE
SH- (CH2< / sub>) 8< / sub>-EG3-OH (SPO)ProchimiaTH 001-m8.n3-0.2
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)ProchimiaTH 003m11n3-0.1
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)ProchimiaTH 002-m11.n3-0.2
نظام رنين البلازمون السطحيBioradXPR36
رقاقة الذهب العاريةBioradGLC رقاقةالبلازما الرمادية لإزالة أحادي الطبقة
1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimideThermo22980<
em>N< em>-hydroxysuccinimide (NHS)Thermo24510
بنتيلامين البيوتين   ;        Thermo21345
EthanolamineSigma-AldrichE9508
NeutraavidinThermo31000
Phosphate ChamberedThermo28374
Tween 20Sigma-AldrichP2287
مجهر مقلوبZeissAxio Observerتم تجهيز المجهر بهدف غمر الزيت 40X ؛ CO2< / sub > وحضانة الرطوبة من كاميرا Pecon GmbH
CCDHamamatsuOrca R2مبردة كهربائيا حراريا (16 بت)
مطيافبصرياتالمحيط QE65Pro
SpectrasuiteOceanOptics الإصدار 1.4
c-myc peptide HyNic TagSolulinkSP-E003
جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد ل c-mycSigma-AldrichM4439
خط خلايا الورم الهجينATCCCRL-1729
محلول مضاد للفطريات بالمضادات الحيوية (100 مرة)سيجما ألدريتشA5955
مصل الوسائط الحرة RPMI 1640 Invitrogen  11835-030 
مصل الأبقار الجنينيATCC30-2020
Rhodamine DHPELife TechnologiesL-1392
رقاقة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ludwig, A. -K., Giebel, B. Exosomes: Small vesicles participating in intercellular communication. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 44, 11-15 (2012).
  2. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 445-457 (2009).
  3. Letterio, J. J., Roberts, A. B. Regulation of immune responses by TGF-beta. Annual Review of Immunology. 16, 137-161 (1998).
  4. Werner, S., Grose, R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiological Reviews. 83, 835-870 (2003).
  5. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. Journal of Investigative Dermatology. 127, 998-1008 (2007).
  6. Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. Journal of the American Chemical Society. 129, 1959-1967 (2007).
  7. Gazagne, A., et al. A Fluorospot assay to detect single T lymphocytes simultaneously producing multiple cytokines. Journal of Immunological Methods. 283, 91-98 (2003).
  8. Han, Q., et al. Polyfunctional responses by human T cells result from sequential release of cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1607-1612 (2012).
  9. Han, Q., Bradshaw, E. M., Nilsson, B., Hafler, D. A., Love, J. C. Multidimensional analysis of the frequencies and rates of cytokine secretion from single cells by quantitative microengraving. Lab on a Chip. 10, 1391-1400 (2010).
  10. Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nature Medicine. 17, 738-743 (2011).
  11. Shirasaki, Y., et al. Real-time single-cell imaging of protein secretion. Scientific Reports. 4, (2014).
  12. Milgram, S., et al. On chip real time monitoring of B-cells hybridoma secretion of immunoglobulin. Biosensors and Bioelectronics. 26, 2728-2732 (2011).
  13. Abbas, A., Linman, M. J., Cheng, Q. A. New trends in instrumental design for surface plasmon resonance-based biosensors. Biosensors & Bioelectronics. 26, 1815-1824 (2011).
  14. Ermakova, A., et al. Detection of a Few Metallo-Protein Molecules Using Color Centers in Nanodiamonds. Nano Letters. 13, 3305-3309 (2013).
  15. Haes, A. J., Van Duyne, R. P. A nanoscale optical blosensor: Sensitivity and selectivity of an approach based on the localized surface plasmon resonance spectroscopy of triangular silver nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 124, 10596-10604 (2002).
  16. Horowitz, V. R., Aleman, B. J., Christle, D. J., Cleland, A. N., Awschalom, D. D. Electron spin resonance of nitrogen-vacancy centers in optically trapped nanodiamonds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 13493-13497 (2012).
  17. Sepulveda, B., Angelome, P. C., Lechuga, L. M., Liz-Marzan, L. M. LSPR-based nanobiosensors. Nano Today. 4, 244-251 (2009).
  18. Barbillon, G., et al. Biological and chemical gold nanosensors based on localized surface plasmon resonance. Gold Bulletin. 40, 240-244 (2007).
  19. Endo, T., et al. Multiple label-free detection of antigen-antibody reaction using localized surface plasmon resonance-based core-shell structured nanoparticle layer nanochip. Analytical Chemistry. 78, 6465-6475 (2006).
  20. Endo, T., Kerman, K., Nagatani, N., Takamura, Y., Tamiya, E. Label-free detection of peptide nucleic acid-DNA hybridization using localized surface plasmon resonance based optical biosensor. Analytical Chemistry. 77, 6976-6984 (2005).
  21. Haes, A. J., Hall, W. P., Chang, L., Klein, W. L., Van Duyne, R. P. A localized surface plasmon resonance biosensor: First steps toward an assay for Alzheimer's disease. Nano Letters. 4, 1029-1034 (2004).
  22. Jonsson, M. P., Jonsson, P., Dahlin, A. B., Hook, F. Supported lipid bilayer formation and lipid-membrane-mediated biorecognition reactions studied with a new nanoplasmonic sensor template. Nano Letters. 7, 3462-3468 (2007).
  23. Park, J. H., et al. A regeneratable, label-free, localized surface plasmon resonance (LSPR) aptasensor for the detection of ochratoxin A. Biosensors & Bioelectronics. 59, 321-327 (2014).
  24. Mayer, K. M., Hao, F., Lee, S., Nordlander, P., Hafner, J. H. A single molecule immunoassay by localized surface plasmon resonance. Nanotechnology. 21, (2010).
  25. Endo, T., Yamamura, S., Kerman, K., Tamiya, E. Label-free cell-based assay using localized surface plasmon resonance biosensor. Analytica Chimica Acta. 614, 182-189 (2008).
  26. Huang, Y. X., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Analytical Chemistry. 83, 4393-4406 (2011).
  27. Oh, B. R., et al. Integrated Nanoplasmonic Sensing for Cellular Functional Immunoanalysis Using Human Blood. ACS Nano. 8, 2667-2676 (2014).
  28. Raphael, M. P., Christodoulides, J. A., Delehanty, J. B., Long, J. P., Byers, J. M. Quantitative Imaging of Protein Secretions from Single Cells in Real Time. Biophysical Journal. 105, 602-608 (2013).
  29. Raphael, M. P., et al. A New Methodology for Quantitative LSPR Biosensing and Imaging. Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2011).
  30. Raphael, M. P., et al. Quantitative LSPR imaging for biosensing with single nanostructure resolution. Biophysical Journal. 104, 30-36 (2013).
  31. Raphael, M. P., et al. A new methodology for quantitative LSPR biosensing and imaging. Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2012).
  32. Henn, A. D., et al. Modulation of single-cell IgG secretion frequency and rates in human memory B cells by CpG DNA, CD40L, IL-21, and cell division. Journal of Immunology. 183, 3177-3187 (2009).
  33. Bramswig, K. H., et al. Soluble Carcinoembryonic Antigen Activates Endothelial Cells and Tumor Angiogenesis. Cancer Research. 73, 6584-6596 (2013).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LSPRi

مقالات ذات صلة