مقالة منهجية

الفيروسية في وقت مبكر فحوصات دخول لتحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات

31.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53124

⸱

أكتوبر 29, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chinese Medicine, Taipei Medical University Hospital, 2Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 3Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Division of Hematology and Oncology, Department of Internal Medicine, Taipei Medical University Hospital, 5Department of Internal Medicine, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 6Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine, Taipei Medical University

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا يفحص خطوات محددة لدخول الفيروس لتحديد وتقييم العوامل المضادة للفيروسات الجديدة.

الملخص

الأنظمة القائمة على الخلايا مفيدة لاكتشاف العوامل المضادة للفيروسات. يسمح تشريح دورة الحياة الفيروسية ، وخاصة مراحل الدخول المبكرة ، باتباع نهج ميكانيكي لتحديد وتقييم العوامل المضادة للفيروسات التي تستهدف خطوات محددة لدخول الفيروس. في هذا التقرير ، تم وصف طرق فحص التعطيل الفيروسي ، والارتباط الفيروسي ، ودخوله / اندماجه الفيروسي كمقايسات مضادة للفيروسات لهذه الأغراض ، باستخدام فيروس التهاب الكبد C كنموذج. يجب أن تكون هذه المقايسات مفيدة لاكتشاف مضادات / مثبطات جديدة للدخول المبكر للفيروسات والمساعدة في توسيع نطاق العوامل المضادة للفيروسات المرشحة لمزيد من تطوير الأدوية.

المقدمة

تشكل العدوى الفيروسية تهديدا مستمرا للصحة العامة وسببا مهما للأمراض الوبائية والمراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. تشمل الأساليب المحددة لمكافحة العدوى الفيروسية تطوير اللقاحات والعلاجات المضادة للفيروسات. في حين أثبتت جهود اللقاح نجاحها في التمنيع ضد العديد من الفيروسات ، إلا أن العديد من مسببات الأمراض الفيروسية لا تزال بدون لقاح وقائي بما في ذلك فيروس حمى الضنك (DENV) والفيروس المضخم للخلايا البشرية (HCMV) وفيروس التهاب الكبد C (HCV) وفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) والفيروس المخلوي التنفسي (RSV) 1-5. من ناحية أخرى ، تلعب مضادات الفيروسات دورا مهما في تدبير هذه الالتهابات الفيروسية عندما لا تكون اللقاحات الاتقائية متاحة. ومع ذلك، لا يتوفر حتى الآن سوى عدد قليل من الأدوية المضادة للفيروسات المرخصة والفعالة من حيث التكلفة مقارنة بعدد مسببات الأمراض الفيروسية التي تهدد الصحة العامة. والأهم من ذلك، أنه بسبب زيادة السفر العالمي والتوسع الحضري السريع، يتفاقم الوضع بسبب مخاطر تفشي الأوبئة الناجمة عن العدوى الفيروسية الناشئة/الناشئة التي يتم إدخالها إلى مناطق غير السكانالأصليين. ومن بين الأمثلة التي تعكس الفاشيات الأخيرة الناجمة عن فيروس المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة وفيروسات الأنفلونزا (H1N1 و H5N1 و H3N2 و H7N9) و DENV وفيروس غرب النيل (WNV) وفيروس الحصبة (MV) وفيروس متلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS) وفيروس الإيبولا6-12 من بين الأمثلة التي تعكس الحاجة إلى تطوير مضادات الفيروسات عندما لا تتوفر التمنيع و/أو العلاجات. بالإضافة إلى ذلك ، هناك دائما خطر محتمل لتوليد عدوى مقاومة للأدوية بمضادات الفيروسات المستخدمة حاليا. وبالتالي ، فإن التطوير المستمر وتوسيع نطاق مضادات الفيروسات لتشمل هذه العدوى الفيروسية الناشئة / الناشئة أمر ضروري لتوفير استراتيجيات إدارة أفضل وحماية الصحة العامة.

تتكون معظم العلاجات المضادة للفيروسات من مضادات الفيروسات ذات المفعول المباشر (DAAs) والتي تستهدف بروتينا فيروسيا معينا أو عاملا مساعدا يتوسط خطوات مهمة في دورة حياة الفيروس. على سبيل المثال ، يثبط نظير النيوكليوزيد Acyclovir بوليميراز الحمض النووي لفيروس الهربس ، ومثبطات البروتياز Boceprevir و Telaprevir معاداة HCV NS3 ، و Oseltamivir و Zanamivir هي مثبطات النورامينيداز التي تمنع إطلاق جزيئات فيروس الأنفلونزا من الخلايا المصابة13-15. ومع ذلك ، هناك عدد قليل جدا من مثبطات الدخول الفيروسي المرخصة بما في ذلك Enfuvirtide ، الذي يستهدف فيروس نقص المناعة البشرية gp41 لمنع الاندماج ، و Maraviroc ، الذي يمنع مستقبلات فيروس نقص المناعة البشرية CCR5 ، وبالتالي يمنع دخول الفيروس16. يمكن أن يساعد استكشاف مضادات / مثبطات جديدة لدخول الفيروس في توفير علاجات إضافية للاستخدام الاتقائي أو العلاجي ، مثل بالاشتراك مع مضادات الفيروسات الأخرى مع آلية عمل مختلفة لإدارة العدوى الفيروسيةبشكل أفضل 17-19.

يمكن أن يتضمن تحديد مضادات الفيروسات تصميم الأدوية الموجهة بالهيكل واستراتيجية قائمة على فحص الأدوية المرشحة. تشمل طرق تقييم النشاط المضاد للفيروسات لعوامل الاختبار المقايسات الكيميائية الحيوية للنشاط الأنزيمي والتقييم بواسطة الأنظمة القائمة على الخلايا20-23. في الأنظمة القائمة على الخلايا ، يمكن تشريح دورة الحياة الفيروسية إلى مراحل متميزة من العدوى ، مثل أحداث الدخول (التعلق ، الاندماج ، فك الطلاء) ، ومرحلة النسخ المتماثل (تكرار الجينوم الفيروسي وترجمة البروتين) ، وخروج الفيروس (التجميع والنضج والإفراج). نظرا لأنه يمكن تكييف المقايسات للتحقيق في كل مرحلة محددة باستخدام أدوات وطرق مختلفة ، فإن هذا النهج يسمح بتحديد / فحص مضادات الفيروسات المرشحة المحتملة بآلية عمل محددة تستهدف المرحلة المتميزة التي تم تحليلها. على سبيل المثال ، لتحليل تأثير الدواء على وجه التحديد على جزيئات الفيروس الحرة قبل الارتباط بالخلية المضيفة ، يمكن إجراء "اختبار التعطيل الفيروسي". في هذا الاختبار ، يسمح للفيروس بالحضانة بعقار الاختبار ثم تخفيفه لمعايرة الدواء قبل إصابة طبقة أحادية الخلية. يمكن أيضا تحليل الخطوات الإضافية مثل الارتباط الفيروسي ومراحل الدخول / الاندماج بشكل فردي ، عن طريق تغيير درجة الحرارة أثناء العدوى. بالنسبة للعديد من الفيروسات المغلفة ، يتم تسهيل دخول / اندماج الفيروس في غشاء الخلية المضيفة بشكل كبير عند 37 درجة مئوية ، ولكن عادة ما يتم منعه عند 4 درجات مئوية مما لا يؤثر على ارتباط الفيروس24-29. أخيرا ، يمكن أن يؤدي استخدام فيروسات المراسل أو أنظمة الخلايا إلى تسهيل هذه الدراسات والسماح بتحليل عالي الإنتاجية.

استخدمنا سابقا النهج القائم على الخلايا وقمنا بتشريح الدخول المبكر لفيروسات مغلفة مختلفة لفحص المركبات المضادة للفيروسات التي يحتمل أن تعادي دخول الفيروس30،31. هنا ، يتم وصف الطرق المختلفة المستخدمة ، بما في ذلك التعطيل الفيروسي ، والتعلق الفيروسي ، ومقايسات الدخول / الاندماج الفيروسي.

البروتوكول

ملاحظة: تأكد من أن تتم جميع الإجراءات التي تنطوي على زراعة الخلايا وعدوى فيروس في اغطية شهادة السلامة الأحيائية التي هي مناسبة لمستوى السلامة الحيوية من العينات التي يجري التعامل معها. لغرض وصف البروتوكولات، يتم استخدام Gaussia luciferase المراسل HCV-الموسومة مراسل ك فيروس طراز 32. في سياق نتائج ممثل، يتم استخدام حمض المركبات chebulagic (CHLA) وpunicalagin (PUG) كما مضادات الفيروسات المرشحة التي تستهدف التفاعلات بروتين سكري الفيروسية مع الجليكوسامينوجليكان سطح الخلية خلال دخول الفيروس في وقت مبكر خطوات 31. الهيبارين، والذي يعرف لتتداخل مع دخول العديد من الفيروسات 30،31،33،34، ويستخدم كعلاج مراقبة إيجابية في هذا السياق. لالأساسية عن تقنيات علم الفيروسات، والإكثار من الفيروسات، وتحديد عيار الفيروس، والتعبير عن الجرعة المعدية في وحدات اللوحة تشكيل (PFU)، والتركيز حدات تشكيل (FFU)، أو تعدد العدوى (وزارة الداخلية)، والقارئ هو إعادةferred مرجع 35. للحصول على أمثلة السابقة والظروف الأمثل لاستخدام الفيروسات هو مبين في نتائج ممثل، وعلى القارئ الرجوع إلى المراجع 30-32،36-39 فضلا عن تفاصيل المدرجة في الجدول 1، الشكل 1A، والشكل 2A.

الثقافة 1. الخليوي، إعداد المجمع، والسمسة مجمع

  1. تنمو خط الخلية المعنية لنظام عدوى فيروس ليتم تحليلها (الجدول 1). لHCV، وتنمو الخلايا هوه 7.5 في تعديل متوسطة النسر Dulbecco و(DMEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، و 200 U / البنسلين مل G، 200 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 0.5 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B.
  2. إعداد اختبار مركبات وضوابط استخدام المذيبات كل منهما: على سبيل المثال، حل CHLA وPUG في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO)؛ إعداد الهيبارين في المياه المزدوج المقطر المعقم. لجميع التخفيفات لاحقة، استخدام وسائل الإعلام الثقافة.
    ملاحظة: تناسق النهائيالتموينية من DMSO في العلاجات اختبار المركب هو أقل من 1٪ في التجارب. يتم تضمين 1٪ DMSO كعلاج سيطرة سلبية في المقايسات للمقارنة.
  3. تحديد السمية الخلوية من المركبات اختبار (على سبيل المثال، CHLA وPUG) على الخلايا لعدوى فيروسية باستخدام بقاء الخلية تحديد كاشف مثل XTT (2،3 مكرر [2-ميثوكسي-4-نيترو-5-sulfophenyl] -5-phenylamino) -carbonyl] هيدروكسيد -2H-نتروبلو):
    1. لHCV، البذور هوه 7.5 الخلايا في لوحة 96-جيدا (1 × 10 4 خلايا لكل بئر)، واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة O / N للحصول على أحادي الطبقة.
    2. تطبيق السيطرة DMSO (1٪) أو زيادة تركيزات من CHLA مركبات اختبار وPUG (مثلا 0، 10، 50، 100، و 500 ميكرومتر) إلى الآبار الثقافة في ثلاث نسخ.
    3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة، ثم تجاهل المتوسطة في لوحة وغسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مرتين.
    4. إضافة 100 ميكرولتر من assayinز حل من عدة في المختبر فحص السموم على أساس XTT إلى كل بئر واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة أخرى 3 للسماح XTT إنتاج formazan.
    5. تحديد الامتصاصية مع قارئ صفيحة ميكروسكوبية في الطول الموجي الاختبار من 492 نانومتر، والطول الموجي إشارة من 690 نانومتر.
    6. حساب النسبة المئوية للبقاء الخلايا باستخدام الصيغة التالية: بقاء الخلية (٪) = في / و× 100٪ "، وفي" حيث و'باسم' الرجوع إلى امتصاص المركبات اختبار ومراقبة المذيبات (مثلا DMSO 1٪. ) العلاجات، على التوالي. تحديد تركيز للخلايا الخلوية 50٪ (CC 50) من المركبات اختبار من البرامج التحليلية مثل GraphPad بريزم وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.

2. قراءات من العدوى الفيروسية

ملاحظة: قراءات من عدوى فيروسية تعتمد على نظام فيروس يستخدم ويمكن أن تشمل أساليب مثل المقايسات البلاك أو الشرق الأوسط وأفريقياسورينغ إشارات مراسل من الفيروسات الموسومة مراسل. وصفت طريقة للكشف عن الإصابة مراسل HCV على أساس النشاط luciferase المراسل أدناه.

  1. جمع supernatants من الآبار المصابة وتوضيح في 17000 x ج في microcentrifuge لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  2. مزيج 20 ميكرولتر من اختبار طاف 50 ميكرولتر من luciferase المراسل الركيزة من Gaussia عدة luciferase الفحص وقياس مباشرة مع luminometer وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  3. التعبير عن HCV العدوى كما سجل 10 وحدات الخفيفة النسبية (RLU) لتحديد تثبيط الفيروسي (٪) وحساب تركيز 50٪ فعالة (EC 50) من المركبات اختبار ضد فيروس التهاب الكبد الوبائي باستخدام خوارزميات من برنامج GraphPad بريزم وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.

3. الفيروسية التعطيل الفحص

ملاحظة: أمثلة من فترة الحضانة وجرعة الفيروسية لمختلف الفيروسات لإعادة المدرجة في الشكل 1A. ويمكن أيضا اختبار تركيزات أعلى من الفيروس عن طريق زيادة وزارة الداخلية / PFU.

  1. البذور هوه 7.5 الخلايا في لوحة 96-جيدا (1 × 10 4 خلايا لكل بئر)، واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة O / N للحصول على أحادي الطبقة.
  2. احتضان مركبات اختبار أو ضوابط (تركيزات النهائي هي: CHLA = 50 ميكرومتر؛ PUG = 50 ميكرومتر؛ الهيبارين = 1000 ميكروغرام / مل؛ DMSO = 1٪) مع جزيئات HCV عند 37 درجة مئوية (الشكل 1A، "طويل الأجل" ) في نسبة 1: 1. على سبيل المثال، إلى اللقاح فيروس 100 ميكرولتر تحتوي على 1 × 10 4 FFU، إضافة 100 ميكرولتر من تمييع العمل 100 ميكرومتر CHLA. ينتج هذا العلاج CHLA بتركيز نهائي 50 ميكرومتر.
  3. تمييع الخليط الفيروس للأدوية إلى (غير فعالة) التركيز "شبه العلاجي" للمركبات الاختبار. على سبيل المثال، وتركيز غير الفعال للCHLA وPUG ضد HCV هو في 1 ميكرومتر 31؛ لذاوهذا يتطلب التخفيف 50 أضعاف من خليط الفيروس للأدوية التي يمكن أن يتحقق مع 9.8 مل من القاعدية المتوسطة (متوسطة زراعة الخلايا مع 2٪ FBS).
    ملاحظة: تخفيف لتركيز شبه العلاجية يمنع تفاعل كبير بين مركبات اختبار وسطح الخلية المضيفة ويسمح فحص تأثير العلاج على virions خالية من الخلايا. لاحظ أن هذا التخفيف تعتمد على الاستجابة للجرعة مضادة للفيروسات من المركبات اختبار ضد عدوى فيروسية معينة، ويتم تحديد مسبق لأداء معين هذا الاختبار 31.
  4. وعلى سبيل المقارنة، مزيج الفيروس مع مركبات الاختبار وعلى الفور تمييع (أي فترة الحضانة) لتركيز الفرعية العلاجي قبل الإصابة (الشكل 1A، "قصير الأجل").
  5. إضافة 100 ميكرولتر من المخفف خليط HCV-المخدرات على هوه 7.5 الخلية أحادي الطبقة (كمية الفيروس الآن في 1 × 10 2 FFU؛ النهائية زارة الداخلية = 0.01)، واحتضان لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية للسماح الفيروسيةالامتزاز.
  6. بعد الإصابة، وإزالة قائح المخفف وغسل بلطف الآبار مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مرتين.
    ملاحظة: إجراء يغسل بلطف لتجنب رفع الخلايا.
  7. تطبيق 100 ميكرولتر من المتوسط ​​القاعدية إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
  8. تحليل العدوى الناجم عن يعاير وطاف لluciferase النشاط كما هو موضح في "2. قراءات من العدوى الفيروسية.

4. الفيروسية الفحص مرفق

ملاحظة: يتم سرد أمثلة من فترة الحضانة وجرعة الفيروسية لمختلف الفيروسات في الشكل 2A، "مرفق". ويمكن أيضا اختبار تركيزات أعلى من الفيروس عن طريق زيادة وزارة الداخلية / PFU.

  1. البذور هوه 7.5 الخلايا في لوحة 96-جيدا (1 × 10 4 خلايا لكل بئر)، واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة O / N للحصول على أحادي الطبقة.
  2. قبل البرد الطبقات الوحيدة الخلية في لوحات في 4 درجات مئوية FOص 1 ساعة.
  3. شارك في علاج الخلايا مع HCV اللقاح (وزارة الداخلية = 0.01) واختبار مركبات أو ضوابط (تركيزات النهائي هي: CHLA = 50 ميكرومتر؛ PUG = 50 ميكرومتر؛ الهيبارين = 1000 ميكروغرام / مل؛ DMSO = 1٪) في 4 درجات مئوية ل 3 ساعة. على سبيل المثال، إلى اللقاح فيروس 90 ميكرولتر تحتوي على 1 × 10 2 FFU، إضافة 10 ميكرولتر من تمييع العمل 500 ميكرومتر CHLA. ينتج هذا العلاج CHLA بتركيز نهائي 50 ميكرومتر والعدوى عن طريق HCV في وزارة الداخلية = 0.01 على أحادي الطبقة الخلية.
    ملاحظة: من المهم لتنفيذ التجربة في 4 ° C لأنه يسمح للفيروس ملزم ولكن يحول دون دخول الذي يحدث بشكل أكثر فعالية في 37 ° C. نفذ إضافة الفيروسات واختبار المركبات على الجليد والحضانة التي تلت ذلك في C الثلاجة 4 درجات للتأكد من أن درجة الحرارة هو الحفاظ على 4 درجات مئوية.
  4. إزالة طاف وغسل بلطف أحادي الطبقة الخلية مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة مرتين.
    ملاحظة: إجراء يغسل بلطف لتجنب رفع الخلايا <./ لى>
  5. تطبيق 100 ميكرولتر من المتوسط ​​القاعدية إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
  6. تحليل العدوى الناجم عن يعاير وطاف لluciferase النشاط كما هو موضح في "2. قراءات من العدوى الفيروسية.

5. الفيروسية الدخول / فيوجن الفحص

ملاحظة: يتم سرد مثال على فترات الحضانة وجرعة الفيروسية لمختلف الفيروسات في 'دخول / فيوجن "الشكل 2A. ويمكن أيضا اختبار تركيزات أعلى من الفيروس عن طريق زيادة وزارة الداخلية / PFU.

  1. البذور هوه 7.5 الخلايا في لوحة 96-جيدا (1 × 10 4 خلايا لكل بئر)، واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة O / N للحصول على أحادي الطبقة.
  2. قبل البرد الطبقات الوحيدة الخلية في لوحات في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. تصيب الخلايا مع فيروس (سي) (MOI = 0.01) في 4 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. على سبيل المثال، استخدام اللقاح الفيروس 100 ميكرولتر تحتوي على 1 × 10 2 FFU.
    ملاحظة: نفذ عدينشوئها من اللقاح الفيروسي على الجليد والحضانة التي تلت ذلك في C الثلاجة 4 درجات للحفاظ على درجة حرارة 4 درجات مئوية، والذي يسمح دخول ملزم ولكن لا الفيروسي.
  4. إزالة طاف وغسل بلطف الطبقات الوحيدة الخلية مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة مرتين.
    ملاحظة: إجراء يغسل بلطف لتجنب رفع الخلايا.
  5. علاج الآبار مع مركبات الاختبار أو ضوابط (تركيزات النهائي هي: CHLA = 50 ميكرومتر؛ PUG = 50 ميكرومتر؛ الهيبارين = 1000 ميكروغرام / مل؛ DMSO = 1٪)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. على سبيل المثال، إضافة 10 ميكرولتر من تمييع العمل 500 ميكرومتر CHLA إلى 90 ميكرولتر من وسائل الإعلام، وخلط، ومعالجة الآبار. ينتج هذا العلاج CHLA بتركيز نهائي 50 ميكرومتر.
    ملاحظة: إن التحول من 4 ° C إلى 37 درجة مئوية يسهل الآن الفيروسي حالة دخول / الانصهار، وبالتالي تتيح تقييم تأثير مركبات اختبار 'على هذه الخطوة معينة.
  6. نضح طاف التي تحتوي على المخدرات وإزالة غير المنضوية-الفيروسات خارج الخلية إما عن طريق غسل 200 ميكرولتر من العازلة سيترات (50 ملي سيترات الصوديوم، 4 ملي كلوريد البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 3.0) أو برنامج تلفزيوني. تطبيق 100 ميكرولتر من المتوسط ​​القاعدية قبل يحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
  7. تحليل العدوى الناجم عن يعاير وطاف لluciferase النشاط كما هو موضح في "2. قراءات من العدوى الفيروسية.

النتائج

في الشكل 1، تم إجراء "فحص التثبيط الفيروسي 'لدراسة ما إذا كانت مدة محددة مركبات CHLA الطبيعي وPUG يمكن إبطال نشاط الفيروسات يلفها مختلفة في الدولة خالية من الخلايا ومنع العدوى لاحق. وقد تم تحديد السمية الخلوية وفيروسات الاستجابة للجرعة من هذه المركبات قبل إجراء دراسة الآلية 31. الفيروسات وعولج قبل مع مركبات اختبار ومن ثم تم تخفيفه الخلطات الفيروس للأدوية لتركيزات الفرعية العلاجية قبل التلقيح على أحادي الطبقة خلية منها لكل نظام الفيروس. كما هو مبين في الشكل 1، سواء CHLA وPUG يبدو للتفاعل مع virions خالية من الخلايا، مما يؤدي إلى آثار لا رجعة فيها محمية أحادي الطبقة الخلية من عدوى لاحقة. حققت مركبات اختبار اثنين في القريب 100٪ تثبيط ضد HCMV، HCV، وDENV-2، في حين أن 60 - وقد لوحظ كتلة 80٪ مقابل MV وRSV. هذه النتائج سوجمؤسسة أن CHLA وPUG يكون لها تأثير مباشر على هذه الجسيمات فيروس مجانا عن طريق تعطيل لهم وتحييد العدوى بها.

في الشكل 2، وأجريت المرفق ودخول / المقايسات الانصهار لاستكشاف تأثير CHLA وPUG ضد هذه الأحداث ذات الصلة دخول الفيروسية في وقت مبكر من HCMV، HCV، DENV-2، MV، وRSV. كلا CHLA وPUG منعت بشكل فعال ملزم للفيروسات التحقيق على الخلية المضيفة كما هو مبين من خلال تثبيط على العدوى الفيروسية الناتجة (الشكل 2، "مرفق": أشرطة رمادي فاتح). وكان تأثير كابح بشكل خاص على مرفق الفيروس عن طريق كل من مركبات مماثلة ضد HCMV (الشكل 2B)، HCV (الشكل 2C)، DENV-2 (الشكل 2D)، وRSV (الشكل 2F)، تتراوح 90-100٪. من ناحية أخرى، يبدو PUG أن يكون أكثر فعالية من CHLA ضد MV ملزم (الشكل 2E)، مع معدل تثبيط من TWس المركبات تتراوح بين 50-80٪. الهيبارين معاملة السيطرة، والذي يعرف لمنع دخول العديد من الفيروسات، وأيضا مرفق تحول دون لHCMV، DENV-2، RSV، إعلان MV، ولكن أقل كفاءة ضد HCV. فحص تلت ذلك "الفيروسي دخول / الانصهار فحص" ما إذا كان CHLA وPUG الاحتفاظ نشاطهم خلال مرحلة دخول فيروس / الانصهار (الشكل 2، "دخول / فيوجن": أشرطة رمادية داكنة). مرة أخرى، لوحظت على حد سواء CHLA وPUG مخلا بشكل فعال الفيروسية خطوة دخول / الانصهار من الفيروسات فحص (الشكل 2B - F)، مما أسفر عن 50 - 90٪ تأثير وقائي على أحادي الطبقة خلية منها. الهيبارين أيضا تحول دون دخول أكثر قدرة / الانصهار في DENV-2 والتهابات RSV، ولكن كان أقل فعال ضد HCMV، HCV، وMV (<40٪ تثبيط في المتوسط).

فيروس نوع من الخلايا
HCMV HEL
HCV هاه 7.5
DENV-2 فيرو
MV CHO-SLAM
RSV التهاب الكبد-2

الجدول 1: المضيف نوع من الخلايا لعدوى فيروسية يشار إلى نوع من الخلايا المستخدمة لكل نظام عدوى فيروسية موضح في نتائج ممثل. تفاصيل إضافية بشأن الخلايا يمكن العثور في اشارة 31.

figure-results-1
الشكل 1. تثبيط الالتهابات الفيروسية التي CHLA مركبات اختبار وPUG تم علاج الفيروسات المختلفة مع مركبات الاختبار لفترة طويلة. (المحتضنة لمدة 1،5-3 ساعة قبل المعايرة؛ القضبان الرمادية الخفيفة) أو فترة قصيرة (مخفف على الفور، الرمادي الداكن القضبان) عند 37 درجة مئوية قبل التخفيف إلى concentra الفرعية العلاجيةنشوئها وتحليل لاحقة للإصابة في الخلايا المضيفة المعنية. (A) الخطط التجربة (كما هو موضح على اليسار) مع تركيز الفيروس النهائي (PFU / جيد أو وزارة الداخلية)، على المدى الطويل فترة حضانة الفيروس للأدوية (ط)، وفيما بعد فترة حضانة (ب) أشار لكل فيروس في الجدول على اليمين. تحليلات ل(B) HCMV، (C) HCV، (D) DENV-2، وأشار (E) MV، و (F) RSV في كل لوحة إضافية. يتم رسم النتائج ضد DMSO العلاج سيطرة سلبية لعدوى فيروس والبيانات المعروضة هي الوسائل ± الأخطاء المعيارية للمتوسط ​​(SEM) من ثلاث تجارب مستقلة. تم تعديل هذا الرقم من إشارة 31. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. تقييم الأنشطة المضادة للفيروسات من CHLA مركبات اختبار وPUG ضد مرفق فيروس ودخول / الانصهار. (A) وإجراء التجارب، وتركيز الفيروس (PFU / جيد أو وزارة الداخلية)، ووقت الجمع والمعالجة مع مركبات الاختبار (الأول والثاني والثالث) يتم عرض لكل الفيروس في الخطط والجداول المرتبطة بها. في التحليل المرفق فيروس (أشرطة رمادي فاتح)، كانت الطبقات الوحيدة من أنواع مختلفة من الخلايا برود قبل في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة، ثم تعامل المشترك مع الفيروسات منها واختبار مركبات في 4 ° C (1،5-3 ساعة؛ ط) قبل غسل قبالة inoculates والمركبات اختبار للحضانة لاحقة (37 ° C؛ الثاني) وفحص عدوى الفيروس. في دخول الفيروس / تحليل الانصهار (أشرطة رمادية داكنة)، كانت الطبقات الوحيدة الخلية المصنفة مسبقا المبردة في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم تحدت مع الفيروسات منها في 4 درجة مئوية لمدة 1،5-3 ساعة (ط). كانت خلايا ثمغسلها وتعامل مع مركبات الاختبار لفترة حضانة إضافية (II) والتي تم خلالها تحول درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية لتسهيل الفيروسي حالة دخول / الانصهار. في نهاية الحضانة، وإزالة الفيروسات خارج الخلية إما عازلة سيترات (درجة الحموضة 3.0) أو يغسل PBS وحضنت الخلايا كذلك (ج) لتحليل عدوى الفيروس. نتائج (B) HCMV، (C) HCV، (D) DENV-2، وأشار (E) MV، و (F) RSV في كل لوحة إضافية. يتم رسم البيانات ضد DMSO العلاج سيطرة سلبية من عدوى فيروس ويتم عرضها كما يعني ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة. تم تعديل هذا الرقم من إشارة 31. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

في هذا التقرير ، تم وصف طرق تحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات بناء على نهج ميكانيكي لتشريح أحداث دخول الفيروسات المبكرة. على وجه التحديد ، سمحت لنا المقايسات بفحص تأثير مركبات الاختبار على جزيئات الفيروس الحرة ، والارتباط الفيروسي ، ودخول / اندماج الفيروس. تم تنفيذ خطوات حاسمة لتقييم تأثير الدواء بشكل واضح على المرحلة المحددة من دخول الفيروس المبكر. على سبيل المثال ، في "مقايسة التعطيل الفيروسي" ، يمنع تخفيف خليط الفيروس والدواء إلى تركيز العلاجي الفرعي تفاعلا كبيرا بين مركب الاختبار وسطح الخلية المضيفة عن طريق "معايرة" الدواء. هذا يضمن أن التأثير المثبط الذي لوحظ على العدوى اللاحقة للخلية المضيفة يرجع إلى تفاعل مباشر بين مركب الاختبار والفيريونات الخالية من الخلايا ، بدلا من تأثير مركب الاختبار على غشاء الخلية المضيفة أو الجزيئات المرتبطة بالغشاء ، بما في ذلك المستقبلات الفيروسية30. وبالمثل ، فإن التحول في درجة الحرارة بين 4 درجات مئوية (مما يسمح بربط الفيروس ولكن ليس الدخول) و 37 درجة مئوية (مما يسهل دخول / اندماج الفيروس) في "مقايسة التعلق الفيروسي" و "مقايسة دخول / اندماج الفيروس" أمر بالغ الأهمية لتحديد تأثير مركب الاختبار على كل من هذه الأحداث المحددة. هذا ممكن بسبب حساسية درجة حرارة الفيروسات المغلفة خلال هذه الخطوات في العدوى24-29. لذلك من المهم إجراء المقايسات عند درجة الحرارة المحددة لضمان دقة النتائج ؛ على سبيل المثال ، من خلال إجراء التجربة على الجليد للحفاظ عليها عند 4 درجات مئوية ووضع العينة مباشرة في حاضنة 37 درجة مئوية لتحول درجة الحرارة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام الضوابط السلبية (مثل مذيب DMSO لتحضير الدواء) والإيجابية (مثل العلاج بالهيبارين) يساعد أيضا في زيادة إثبات دقة المقايسات. تم إثبات فائدة هذه الأساليب وقابليتها للتطبيق في العديد من الدراسات المضادة للفيروسات26،30،31،40،41. لاحظ أنه بينما يتم تضمين الهيبارين كعنصر تحكم لجميع المقايسات الثلاثة في سياق النتائج التمثيلية ، فإنه عادة ما يمنع ارتباط الفيروس الأولي بدلا من خطوة الاندماج / الدخول التالية (كما هو موضح في البيانات الواردة في الشكل 2). يمكن أيضا استخدام ضوابط إضافية ، مثل تحييد الأجسام المضادة الموجهة ضد الفيروس (لمقايسة تعطيل الفيروس) ، والأجسام المضادة التي تخفي مستقبلات سطح الخلية للفيروس (لمقايسة التعلق الفيروسي) ، ومثبطات اندماج الغشاء (لمقايسة الاندماج / الدخول الفيروسية).

وتعتبر المقايسات الموصوفة في هذا التقرير، والتي تتعلق بالمراحل المبكرة من العدوى الفيروسية، مفيدة من حيث التطبيق كاختبارات ثانوية لتوصيف آلية عمل الأدوية المرشحة من الشاشات الأولية التي تستهدف عادة العدوى الفيروسية على نطاق أوسع. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا دمجها في الشاشات الأولية إذا كان المرء يبحث على وجه التحديد عن مثبطات دخول الفيروس المبكر ، بما في ذلك عوامل تعطيل الفيروسات ، ومضادات الارتباط الفيروسي ، ومثبطات دخول / اندماج الفيروس. في هذه الحالة ، يسمح استخدامها بتحليل فحص أكثر تركيزا ودقة لتحديد المرشحين المضادين للفيروسات الخاصة بالآلية ، والتي بدورها من شأنها أن تسرع من تطوير الأدوية النهائية.

يوفر استخدام المقايسات القائمة على الخلايا في تحديد العوامل المضادة للفيروسات العديد من المزايا المهمة مقارنة بالمقايسات الكيميائية الحيوية ، بما في ذلك الكشف عن التأثيرات المحتملة غير المستهدفة (مثل السمية الخلوية) وإضافة الأهمية الفسيولوجية للنشاط الحيوي لعوامل الاختبار42. هذه القضايا هي اعتبارات مهمة لتقرير ما إذا كان العامل المرشح ذا قيمة للاستمرار في المراحل اللاحقة من تطوير الدواء. وبالمثل ، فإن المقايسات المبكرة الخاصة بدخول الفيروس الموضحة في هذا التقرير تسمح بفحص تأثير الدواء على مرحلة دخول الفيروس المميزة على المستوى الخلوي ، وبشكل أكثر تحديدا في سياق عدوى فيروسية حقيقية في المختبر. وبالتالي ، فإن النتائج التي تم الحصول عليها من هذه المقايسات ستساعد بشكل أفضل في التنبؤ بشكل أفضل بالفعالية المضادة للفيروسات لمركبات الاختبار وأيضا تحديد التأثيرات غير المرغوب فيها غير المرغوب فيها ضد الخلية المضيفة. ومع ذلك ، فإن أحد القيود المحتملة هو أن الفحص القائم على الخلايا في المختبر قد لا يعكس تماما خطوة الدخول الفعلية في الجسم الحي في سياق عدوى فيروسية طبيعية. ومع ذلك ، فإن المقايسات المقدمة في هذا البروتوكول تعمل كمنصة تحليلية لتحديد وتقييم العوامل المضادة للفيروسات الجديدة القائمة على الآلية.

وقد سهل تطوير فيروسات المراسلة أو أنظمة الخلايا المراسلة لقياس كمية العدوى الفيروسية إلى حد كبير الفحص القائم على الخلايا وتقييم المركبات المضادة للفيروسات. ومن الأمثلة على ذلك استخدام فيروسات مؤتلفة تحمل جين مراسل أو عن طريق خطوط خلايا بشرية مؤتلفة تحتوي على جين مراسل مدفوع بمحفز الفيروس المحدد31،43. في هذا التقرير ، يمكن مراقبة العدوى من فيروس التهاب الكبد C الموسوم باللوسيفيراز بسهولة عن طريق تحديد إشارة المراسل ، وبالتالي تسهيل تحليل البيانات. من خلال دمج هذه الأدوات المفيدة القائمة على المراسل ، يمكن تكييف فحوصات الدخول الفيروسي المبكرة الموضحة هنا بشكل أساسي إلى تنسيق عالي الإنتاجية للفحص القائم على الآلية لمكتبات الجزيئات الصغيرة.

في الختام ، تم وصف بروتوكول للمقايسات لتشريح الدخول الفيروسي المبكر كوسيلة لتحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات الخاصة بالآلية. ستكون هذه المقايسات مفيدة لاكتشاف مضادات / مثبطات جديدة لدخول الفيروس وتساعد على توسيع نطاق العوامل المضادة للفيروسات لتطويرها كعلاجات وقائية و / أو علاجية.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

هذه الدراسة مدعومة بتمويل من مستشفى جامعة تايبيه الطبية (102TMU-TMUH-19) ووزارة العلوم والتكنولوجيا في تايوان (MOST103-2320-B-038-031-MY3).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEMGIBCO11995-040
FBSGIBCO26140-079
البنسلين الستربتومايسينجيبكو15070-063
أمفوتريسين بجيبكو15290-018
DMSOSigmaD5879
طقم فحص السموم في المختبر ،سيجماTOX2
القائم على XTTPBS الرقم الهيدروجيني 7.4 جيبكو10010023
قارئ MicroplateThermo Scientific89087-320
الطرد المركزيالدقيق75002420
BioLux Gaussia luciferase مجموعة الفحصEngland BiolabsE3300L     
مقياس الإضاءةPromegaGloMax-20/20
سترات الصوديوم ، ثنائي هيدراتسيجما71402
كلوريد البوتاسيومسيجماP5405
New

المراجع

  1. Munier, C. M., Andersen, C. R., Kelleher, A. D. HIV vaccines: progress to date. Drugs. 71, 387-414 (2011).
  2. Rothman, A. L. Immunity to dengue virus: a tale of original antigenic sin and tropical cytokine storms. Nat Rev Immunol. 11, 532-543 (2011).
  3. Sung, H., Schleiss, M. R. Update on the current status of cytomegalovirus vaccines. Expert Rev Vaccines. 9, 1303-1314 (2010).
  4. Torresi, J., Johnson, D., Wedemeyer, H. Progress in the development of preventive and therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J Hepatol. 54, 1273-1285 (2011).
  5. Wright, M., Piedimonte, G. Respiratory syncytial virus prevention and therapy: past, present, and future. Pediatr Pulmonol. 46, 324-347 (2011).
  6. Christou, L. The global burden of bacterial and viral zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 326-330 (2011).
  7. Cascio, A., Bosilkovski, M., Rodriguez-Morales, A. J., Pappas, G. The socio-ecology of zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 336-342 (2011).
  8. Grais, R. F. Measles vaccination in humanitarian emergencies: a review of recent practice. Confl Health. 5, 21(2011).
  9. Gautret, P. Emerging viral respiratory tract infections-environmental risk factors and transmission. Lancet Infect Dis. 14, 1113-1122 (2014).
  10. Sampathkumar, P. Middle East respiratory syndrome: what clinicians need to know. Mayo Clin Proc. 89, 1153-1158 (2014).
  11. Burd, E. M. Ebola Virus: a Clear and Present Danger. J Clin Microbiol. 53, 4-8 (2015).
  12. Bishop, B. M. Potential and Emerging Treatment Options for Ebola Virus Disease. Ann Pharmacother. , (2014).
  13. Arduino, P. G., Porter, S. R. Oral and perioral herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection: review of its management. Oral Dis. 12, 254-270 (2006).
  14. Mitrasinovic, P. M. Advances in the structure-based design of the influenza A neuraminidase inhibitors. Curr Drug Targets. 11, 315-326 (2010).
  15. Soriano, V. Directly acting antivirals against hepatitis C virus. J Antimicrob Chemother. 66, 1673-1686 (2011).
  16. Haqqani, A. A., Tilton, J. C. Entry inhibitors and their use in the treatment of HIV-1 infection. Antiviral Res. 98, 158-170 (2013).
  17. Melby, T., Westby, M. Inhibitors of viral entry. Handb Exp Pharmacol. , 177-202 (2009).
  18. Vanderlinden, E., Naesens, L. Emerging antiviral strategies to interfere with influenza virus entry. Med Res Rev. 34, 301-339 (2014).
  19. Antoine, T. E., Park, P. J., Shukla, D. Glycoprotein targeted therapeutics: a new era of anti-herpes simplex virus-1 therapeutics. Rev Med Virol. 23, 194-208 (2013).
  20. Pawlotsky, J. M., Chevaliez, S., McHutchison, J. G. The hepatitis C virus life cycle as a target for new antiviral therapies. Gastroenterology. 132, 1979-1998 (2007).
  21. Beyleveld, G., White, K. M., Ayllon, J., Shaw, M. L. New-generation screening assays for the detection of anti-influenza compounds targeting viral and host functions. Antiviral Res. 100, 120-132 (2013).
  22. Kilianski, A., Baker, S. C. Cell-based antiviral screening against coronaviruses: developing virus-specific and broad-spectrum inhibitors. Antiviral Res. 101, 105-112 (2014).
  23. Caillet-Saguy, C., Lim, S. P., Shi, P. Y., Lescar, J., Bressanelli, S. Polymerases of hepatitis C viruses and flaviviruses: structural and mechanistic insights and drug development. Antiviral Res. 105, 8-16 (2014).
  24. Frey, S. Temperature dependence of cell-cell fusion induced by the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 69, 1462-1472 (1995).
  25. Tscherne, D. M. Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry. J Virol. 80, 1734-1741 (2006).
  26. Madan, R. P. Molecular umbrellas: a novel class of candidate topical microbicides to prevent human immunodeficiency virus and herpes simplex virus infections. J Virol. 81, 7636-7646 (2007).
  27. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Time and temperature dependence of influenza virus membrane fusion at neutral pH. J Gen Virol. 67 (Pt 12), 2813-2817 (1986).
  28. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Sendai virus membrane fusion: time course and effect of temperature, pH, calcium, and receptor concentration). Biochemistry. 21, 6041-6046 (1982).
  29. Wang, G., Hernandez, R., Weninger, K., Brown, D. T. Infection of cells by Sindbis virus at low temperature. Virology. 362, 461-467 (2007).
  30. Lin, L. T. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. J Virol. 85, 4386-4398 (2011).
  31. Lin, L. T. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiol. 13, 187(2013).
  32. Marukian, S. Cell culture-produced hepatitis C virus does not infect peripheral blood mononuclear cells. Hepatology. 48, 1843-1850 (2008).
  33. Baba, M., Snoeck, R., Pauwels, R., de Clercq, E. Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus. Antimicrob Agents ChemotheR. 32, 1742-1745 (1988).
  34. Barth, H. Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate. J Biol CheM. 278, 41003-41012 (2003).
  35. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
  36. Brown, M. G. Dramatic caspase-dependent apoptosis in antibody-enhanced dengue virus infection of human mast cells. J Leukoc Biol. 85, 71-80 (2009).
  37. Huang, Y., Cyr, S. L., Burt, D. S., Anderson, R. Murine host responses to respiratory syncytial virus (RSV) following intranasal administration of a Protollin-adjuvanted, epitope-enhanced recombinant G protein vaccine. J Clin Virol. 44, 287-291 (2009).
  38. Isaacson, M. K., Compton, T. Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress. J Virol. 83, 3891-3903 (2009).
  39. Leonard, V. H., et al. Measles virus blind to its epithelial cell receptor remains virulent in rhesus monkeys but cannot cross the airway epithelium and is not shed. J Clin Invest. 118, 2448-2458 (2009).
  40. Ciesek, S. The green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate, inhibits hepatitis C virus entry. Hepatology. 54, 1947-1955 (2011).
  41. Lin, L. T. Saikosaponin b2 is a naturally occurring terpenoid that efficiently inhibits hepatitis C virus entry. J Hepatol. 62, 541-548 (2015).
  42. Atkins, C., Evans, C. W., White, E. L., Noah, J. W. Screening methods for influenza antiviral drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7, 429-438 (2012).
  43. Zhang, J. Identification of novel virus inhibitors by influenza A virus specific reporter cell based screening. Antiviral Res. 93, 48-54 (2012).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

C PBS
الفيروسية في وقت مبكر فحوصات دخول لتحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.