فك رموز والتصوير إمراض وحبال من المتفطرة خراج في الزرد الأجنة

Summary

تستخدم أجنة أسماك الزرد الشفافة بصريا على نطاق واسع لدراسة وتصور التفاعلات بين الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض والخلايا المناعية الفطرية في الوقت الفعلي. يستخدم الحقن الدقيق للبكتيريا الخراجية ، جنبا إلى جنب مع التصوير الفلوري ، للتدقيق في السمات المسببة للأمراض الأساسية مثل تكوين الحبل في أجنة الزرد.

Abstract

< p class = 'jove_content'> تستخدم أجنة أسماك الزرد (Danio rerio) بشكل متزايد كنموذج عدوى لدراسة وظيفة الجهاز المناعي الفطري للفقاريات في تفاعلات المضيف ومسببات الأمراض. سهولة الحصول على أعداد كبيرة من الأجنة ، وإمكانية الوصول إليها بسبب التطور الخارجي ، وشفافيتها البصرية بالإضافة إلى توافر مجموعة واسعة من الأدوات الجينية / المناعية ومجموعات خطوط المراسلين المعدلة وراثيا ، المساهمة في تعدد استخدامات هذا النموذج. في هذا الصدد ، تصف هذه المخطوطة استخدام أسماك الزرد كنظام نموذجي في الجسم الحي للتحقيق في التسلسل الزمني لعدوى المتفطرة الخراجية. يمكن أن يوجد هذا العامل الممرض البشري إما كمتغيرات ناعمة (S) أو خشنة (R) ، اعتمادا على تكوين جدار الخلية ، ويمكن تصوير ضراوة كل منها ومقارنتها في أجنة الزرد واليرقات. يؤدي الحقن الدقيق للمتغيرات الفلورية S أو R مباشرة في الدورة الدموية عبر الوريد الذيلي، إلى التهابات مزمنة أو حادة/مميتة على التوالي. يسمح هذا النظام البيولوجي بتصور وتحليل عالي الدقة لدور الحبال الفطرية في تعزيز تكوين الخراج. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام البكتيريا الفلورية جنبا إلى جنب مع خطوط أسماك الزرد المعدلة وراثيا التي تحتوي على البلاعم الفلورية ينتج فرصة فريدة للتصوير متعدد الألوان للتفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض. توضح هذه المقالة بروتوكولات مفصلة لتحضير لقاح M. abscessus المتجانس والحقن الوريدي لأجنة أسماك الزرد للتصوير الفلوري اللاحق للتفاعل مع الضامة. تفتح هذه التقنيات الطريق للتحقيقات المستقبلية التي تنطوي على طفرات معيبة في تكوين الحبل وهي مكرسة لفهم كيفية تأثير ذلك على M. خراج الإمراضية في الفقاريات بأكملها.

Introduction

المتفطرة خراج هو الممرض الناشئة التي تسبب مجموعة واسعة من متلازمات سريرية على البشر. وتشمل هذه الالتهابات الجلدية فضلا عن الالتهابات الرئوية المزمنة، واجه معظمهم في المناعة ومرضى التليف الكيسي ^1،2،3،4. M. يعتبر خراج أيضا بمثابة الرئيسية الأنواع المتفطرات سريع النمو المسؤولة عن عدوى المستشفيات وعلاجي المنشأ في البشر. وعلاوة على ذلك، أبرزت عدة تقارير حديثة إمكانية أن M. خراج يمكن أن يخترق حاجز الدم في الدماغ ويحفز الآفات الهامة في النظام العصبي المركزي (CNS) ^5،6. على الرغم من كونه مزارع السريع، M. المعارض خراج أيضا العديد من الميزات المسببة للأمراض التي ترتبط تلك المتفطرة السلية، بما في ذلك القدرة على الصمت لسنوات داخل الهياكل حبيبية وتوليد الآفات الجبني في الرئتين ^7. أكثر إثارة للقلق هو انخفاض صنsitivity من M. خراج للمضادات الحيوية، مما يجعل هذه الإصابات صعبة للغاية لعلاج مما يؤدي إلى معدل فشل كبير العلاجية ^8،9. التهديد هاما من هذا النوع هو أساسا المقاومة الجوهرية لها للمضادات الحيوية، والتي هي مصدر قلق كبير في المؤسسات الصحية العامة ¹⁰ وموانع لزرع الرئة ^11.

يعرض M. خراج ناعمة (S) أو الخام morphotypes (R) مستعمرة أن تؤدي إلى نتائج سريرية مختلفة. وعلى النقيض من سلالة S، R البكتيريا لديهم ميل لتنمو اقصاه الى اقصاه، مما أدى إلى حبل أو سلك يشبه هيكل ^12،13. كشفت عدة دراسات مستقلة على أساس نماذج إما الخلوية أو الحيوان النمط الظاهري فرط الفوعة للR نمط شكلي ^14،15. من الدراسات الوبائية، ومعظم الحالات الشديدة من M. الالتهابات الرئوية خراج يبدو أن تترافق مع المتغيرات R ¹⁶ والتي هي البديل الوحيد الذيفقد رأينا أن تستمر لسنوات في مضيف مصاب ^3. يعتمد الفرق نمط شكلي على وجود (في S) أو الخسارة (في R) من glycopeptidolipids المرتبطة السطحية (GPL) ^12. ولكن نظرا إلى القيود المتأصلة في النماذج الخلوية / الحيوانية المتوفرة حاليا تستخدم لدراسة M. عدوى خراج، معرفتنا بشأن الأحداث الفيزيولوجية المرضية للمتغيرات R أو S لا تزال غامضة. إصابة الفئران المناعية المختصة عبر الطرق الوريدية أو الهباء الجوي يؤدي إلى الاستعمار عابرة، التي تعوق استخدام الفئران لدراسة الالتهابات المستمرة وللفي الجسم الحي المخدرات اختبار الحساسية ^17. لذلك، وتطوير نماذج حيوانية قابلة للتلاعب استجابة المضيف يمثل تحديا كبيرا. في هذا السياق، وضعت نماذج غير الثدييات من الإصابة مؤخرا، بما في ذلك ذبابة الفاكهة ¹⁸ التي توفر العديد من المزايا مثل التكلفة والسرعة والأخلاقي القبول سVER نموذج الفأر. كما تم استكشاف نموذج الزرد (دانيو rerio) العدوى إلى تصور، من خلال التصوير غير الغازية، والتقدم والتسلسل الزمني للM. عدوى خراج في الحيوانات الحية ^19. الأهم من ذلك، تم تشكيل لإثبات المفهوم أيضا لإثبات مدى صلاحيته للفي الجسم الحي تقييم المضادات الحيوية ضد M. خراج ^17،20.

الزرد وقد استخدمت على نطاق واسع خلال العقدين الماضيين لدراسة التفاعلات بين مختلف مسببات الأمراض والجهاز المناعي المضيف ^21. نجاح متزايد من هذا النموذج الفقاريات بديل يعتمد على فرصا كبيرة وفريدة من نوعها أن الدافع والتحقق من صحة استخدامها من أجل فهم أفضل للعديد من الالتهابات الفيروسية والبكتيرية ^{19،22،23،24،25،26،27،28،29.} خلافا لمعظم النماذج الحيوانية الأخرى والأجنة الزرد شفافة بصريا، مما يسمح للغير الغازية مضان التصوير ^30. هذا HAقاد الى دراسة M. إصابة خراج الأجنة الزرد مع تفاصيل لم يسبق لها مثيل، وبلغت ذروتها مع وصف حبال خارج الخلية، التي تمثل مثالا على اللدونة المورفولوجية البكتيرية. يمثل حبال آلية جديدة لتخريب الجهاز المناعي وآلية رئيسية تعزيز التسبب في M. الحاد عدوى خراج ^19.

ويصف هذا التقرير أدوات وأساليب جديدة باستخدام الجنين الزرد إلى فك الصفات الفيزيولوجية المرضية من M. خراج العدوى ودراسة التفاعلات الحميمة بين العصيات ونظام المناعة الفطري. أولا، بروتوكول microinjection مفصل يتضمن تجهيز اللقاح البكتيري، وإعداد الجنين، والإصابة في حد ذاتها، ويرد. طرق تكييفها خصيصا لتقييم M. الفوعة خراج عن طريق قياس معايير مختلفة، مثل بقاء المضيفة وعبء البكتيرية، ترد. وقد تم التركيز على كيفيةلمراقبة، وعلى مستوى الزمانية المكانية، ومصير وتطور العدوى واستجابة المضيف المناعية للM. خراج باستخدام المجهر الفيديو. وعلاوة على ذلك، للتحقيق في مساهمة ودور الضامة خلال M. خراج العدوى، وطرق لتوليد الضامة المنضب الأجنة (باستخدام النهج إما وراثيا أو بناء كيميائيا) موصوفة. وأخيرا، وبروتوكولات لتصور التفاعلات محددة موثقة الضامة أو العدلات باستخدام الأجنة ثابتة أو المعيشة.

والهدف من هذا التقرير هو تحفيز مزيد من الدراسات لتسليط الضوء من جديد إلى M. آليات الفوعة خراج وبخاصة دور حبال في إنشاء عملية العدوى الحادة وغير المنضبط.

Protocol

الإجراءات التجريبية الزرد يجب أن تتوافق مع الأنظمة المؤسسية والحكومية ذات الصلة. لهذه الدراسة، أجريت التجارب الزرد في مونبلييه جامعة، وفقا للمبادئ التوجيهية الاتحاد الأوروبي للتعامل مع الحيوانات المختبرية (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) والمعتمدة في إطار المرجعية CEEA-LR-13007.

1. إعداد الكواشف والمعدات Microinjection

1. إعداد أسماك المياه عن طريق إذابة 0.06 ز فورية ملح البحر المحيط في 1 لتر ماء مقطر ^31، ثم تعقيم لتعقيم (120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) وتخزينها في 28.5 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
2. إعداد الميثيلين الأزرق حل عن طريق إذابة 1 غرام من الميثيلين الأزرق في 1 لتر ماء مقطر. إضافة 300 ميكرولتر من محلول أزرق الميثيلين في 1 لتر ماء السمك للحصول على أسماك المياه الزرقاء، ثم تعقيم لتعقيم وتخزينها في 28.5 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
   ملاحظة: additiعلى من الميثيلين الأزرق في أسماك المياه يمنع نمو العفن.
3. إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)
   1. إعداد 10 X PBS حل الأسهم عن طريق إذابة 5.696 ز _نا 2 هبو _4، 680 ملغ KH ₂ PO _4، 969 ملغ بوكل و78.894 جم كلوريد الصوديوم في 1 لتر ماء مقطر وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع حمض الهيدروكلوريك. للحصول على 1 X PBS، وتمييع 100 مل من محلول 10 X PBS في 900 مل من الماء المقطر والأوتوكلاف خلال 20 دقيقة في 120 درجة مئوية لتعقيم.
   2. إضافة 0.05٪ توين 80 للحصول على 1 X PBST وتخزينها في RT لمدة تصل إلى 1 سنة.
4. إعداد الأوليك حمض سكر العنب الكاتلاز (OADC) تخصيب عن طريق إذابة 8.5 غرام كلوريد الصوديوم، و 50 غراما مصل بقري الزلال، 20 ز D-الجلوكوز، 40 ملغ الكاتلاز من الكبد البقري و 0.5 غرام من حمض الأوليك في 1 لتر ماء مقطر ثم تصفية تعقيم الحل و تخزينه في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
5. إعداد 100 مل من حمض methanesulfonic إيثيل 3-أمينوبنزوات (تريكين) حل سهم، عن طريق إذابة 400 ملغ tricaiمسحوق ني في 97.9 مل من الماء المقطر. إضافة 2.1 مل من 1 M تريس (الرقم الهيدروجيني 9) لضبط درجة الحموضة في 7.0 و تخزين الحل في -20 ° C.
6. إعداد إبر الحقن microcapillary عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات (1MM OD X 0،78 ملم ID) باستخدام جهاز مجتذب micropipette مع الإعدادات التالية: ضغط الهواء 650؛ حرارة 999؛ سحب 50؛ سرعة 80؛ الساعة 200.
7. يعد حل أجار 1.5٪ في أسماك المياه الزرقاء وتصب 25 مل من أجار ذابت في 100 ملم أطباق بتري. في الجزء العلوي من آغار ذاب، ضع قوالب محلية الصنع من أجل بصمة قنوات محددة. وتستخدم "V" قنوات على شكل لالأجنة الموقف في حين ان "U" على شكل تستخدم لبيض (الشكل 1) ^31. مرة واحدة عزز، إزالة بعناية بصمة.
   ملاحظة: تغطية أجار مع أسماك المياه الزرقاء لتجنب الجفاف وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.

الشكل 1. غرف تحديد المواقع لحقن الزرد. (A) قنوات على شكل حرف U لبيض (اللوحة اليسرى) وقنوات على شكل حرف V لأجنة (اللوحة اليمنى). البيض الزرد / وضعت الأجنة في القنوات ومحاذاة على نفس المحور. (B) عرض غرف للمراقبة مجهرية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. إعداد وتخزين وM. خراج اللقاح

1. M. ظروف النمو خراج
   1. لوحة من M. خراج من -80 ° C الأسهم الجلسرين على لأجار ميدلبروك 7H10 تحتوي على 10٪ من OADC و 0.5٪ الجلسرين (7H10 ^OADC) وتستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة تبعا للعلامة المقاومة التي تحملها ناقلات ترميز البروتين الفلوري. احتضان لوحاتفي 30 درجة مئوية لمدة 4-5 أيام.
   2. التقاط مستعمرة المتفطرات مضان إيجابي وتلقيح 1 مل ميدلبروك 7H9 مرق تستكمل مع OADC، 0.2٪ الجلسرين، 0.05٪ توين 80 (7H9 ^{OADC / T)} مع المضادات الحيوية المطلوبة في 15 مل العقيمة أنبوب من البلاستيك. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 1 أسبوع دون أن تهتز.
      ملاحظة: توين 80 يقيد تراكمها وتجمع البكتيريا.
   3. Resuspend وقبل الثقافة التي تم الحصول عليها في 2.1.2 في 50 مل ميدلبروك 7H9 ^{OADC / T} في 150 سم ² القوارير زراعة الأنسجة إلى النهائي 0.1 OD ₆₀₀ (المقابلة إلى حوالي 5.10 ⁷ البكتيريا / مل)، واحتضان مرة أخرى في 30 درجة مئوية لمدة 4 أيام للحصول على ثقافة أضعافا مضاعفة النمو (OD ₆₀₀ = 0،6-0،8).
      ملاحظة: للحد من التثاقل، وخاصة من البديل الخام، ويجب أن لا تتجاوز حضانة 5 أيام. كلا الخيارين ناعمة وخشنة عرض معدل نمو مماثل.
2. إعداد M. قائح خراج60؛
   ملاحظة: نظرا لنزوع عال من الخام M. خراج لتشكيل مجاميع كبيرة، وإنتاج الحبال، ويقتضي الأمر علاجا محددا لتوليد قائح متجانسة وتسيطر الكمية قبل إبر دقيقة جدا في الأجنة. يتم تطبيق هذا العلاج أيضا لضمان سلاسة البكتيريا التي تنتج المجاميع، وإن كان بدرجة أقل من سلالة الخام.
   1. حصاد الثقافات أضعافا مضاعفة النمو من 150 سم ² القوارير زراعة الأنسجة بواسطة الطرد المركزي عند 4، 000 x ج لمدة 15 دقيقة في RT في أنبوب بلاستيكي 50 مل العقيمة و resuspend بيليه الجرثومي في 1 مل 7H9 ^{OADC / T.} قسامة 200 ميكرولتر من تعليق البكتيرية إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge.
      ملاحظة: العمل مع وحدات التخزين الصغيرة في 1 مل الحقن من الضروري الحصول على تعليق متجانسة إلى حد كبير.
   2. تجانس تعليق البكتيرية بإبرة 26-G (15 صعودا وهبوطا متواليات)، يصوتن ثلاث مرات لمدة 10 ثانية (مع 10 فواصل ثانية بين كل صوتنة حد ذاتهاquence) باستخدام sonicator بالحمام المائي. إضافة 1 مل من 7H9 ^{OADC / T} ودوامة لفترة وجيزة. الطرد المركزي 3 دقيقة في 100 ز س.
   3. جمع بعناية التي تحتوي على المتفطرات supernatants لتجنب كتل وتجميع تعليق متجانسة في 50 مل العقيمة أنبوب من البلاستيك.
   4. تحقق بصريا عن وجود المجاميع البكتيرية المتبقية في نهاية المطاف.
      ملاحظة: إذا المجاميع لا تزال موجودة، انتقل إلى خطوة إضافية الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 2 دقيقة، وجمع طاف.
   5. الطرد المركزي تعليق في 4000 x ج لمدة 5 دقائق، resuspend وبيليه في 200 ميكرولتر 7H9 ^{OADC / T،} والشروع في الحقن.
   6. تقييم تركيز بكتيريا النهائي من الطلاء التخفيفات التسلسلية (في 1 × PBST) على 7H10 ^OADC أجار والفرز مستعمرة (كفو) بعد 4 أيام الحضانة عند 30 درجة مئوية. CFUs ينبغي أن تحدد لكل دفعة جديدة.
   7. إعداد الأسهم قائح المجمدة عن طريق تخزين 5 مكل في -80 & #176؛ C.
      ملاحظة: تقييم CFU من -80 ° C قسامات المجمدة هو سابق قبل تحديد العدد الدقيق للبكتيريا كما التجميد / الذوبان قد يؤثر على قابلية البكتيرية من اللقاح. هذه قائح المجمدة جاهزة لاستخدامها في حقن لاحقة. وبما أن جميع قسامات تحتوي على نفس العدد من كفو، فهي تسمح حقن البكتيريا بطريقة استنساخه من تجربة واحدة إلى أخرى.
3. مراقبة الجودة اللقاح
   ملاحظة: تلوين تسيل-نلسن (محدد لالمتفطرات) يمكن استخدامها لمقارنة جودة تعليق البكتيرية قبل وبعد الإجراءات التجانس هو موضح في 2.2.
   1. بقعة وانتشرت قطرة واحدة من تعليق البكتيرية المتجانس على شريحة زجاجية واتركه حتى يجف تماما، إصلاح تشويه لمدة 30 دقيقة على الأقل على طبق ساخن لتعيين 65-70 ^{درجة مئوية وصمة} عار باستخدام بروتوكول تلطيخ تسيل-نلسن .
   2. مراقبة تشويه البكتيرية مع المجهر يستخدم 100الهدف X ومقارنتها مع مسحة من تعليق غير المجهزة البكتيري (الشكل 2).

الشكل 2. إعداد فرقت M. قائح خراج. تلوين تسيل-نلسن من R أو S المتغيرات نمت على مرق المتوسطة قبل أي علاج (لوحات العليا) أو بعد العلاج (لوحات أقل) للحد من حجم وعدد من المجاميع المتفطرات (خطوات متتالية من غسول، صوتنة والصفق) . وقد لوحظت البكتيريا باستخدام المجهر مع 100 X النفط 1.4 الهدف NA APO). أشرطة النطاق: 20 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. إعداد الزرد الأجنة

1. وضع البيض وجمع البيض الزرد
   1. قبل يوم واحد الصورةرهن، وتولد الزرد الكبار من خلال وضع 2 ذكور و 1 أنثى (عادة نسبة 2: 1 يسمح معدل الإخصاب الأمثل) في غرفة تربية، ويتكون من حوض للأسماك منفصل مع مجموعة سلة البيض ^31.
      ملاحظة: يتم استخدام سلال جمع البيض لحماية البيض من اكلتها من قبل الوالدين وتسهيل حصاد البيض.
   2. في 1 HPF والبيض الحصاد والأجنة فقط وضعت بشكل صحيح في طبق بيتري 100 ملم مليئة 25 مل الأزرق أسماك المياه (بحد أقصى 100 الأجنة في الطبق) والاحتفاظ بها في 28.5 ° C. يتم تجاهل البيض غير المخصب.
2. إعداد الأجنة الزرد لحقن
   1. في حوالي 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، dechorionate الأجنة مع ملاقط غرامة في طبق بيتري 100 ملم والاحتفاظ بها في 28.5 ° C.
   2. جمع 30-48 الأجنة HPF باستخدام ماصة ونقلها إلى "V" غرفة المواقع على شكل مليئة 25 مل من الماء السمك الذي يحتوي على 270 ملغ / L تريكين.وضع الأجنة بشكل صحيح في القنوات باستخدام أداة microloader طرف محلية الصنع (قص محلية الصنع محمل طرف الصغير) الأمثل للتلاعب الصغير أسهل.
      ملاحظة: توجيه الجانب الظهري أسفل لحقن وريدية في الوريد الذيلية أو الجانب الظهري صعودا لحقن العضلات الذيل.

4. مايكرو حقن الداخلي

ملاحظة: الإجراء حقن الجزئي لM. خراج مشابه لتلك التي سبق وصفها لM. marinum الحقن ^32. لتقييم التسلسل الزمني للM. عدوى خراج (البقاء على قيد الحياة، الحمل البكتيري، الحركي وخصائص العدوى)، ويفضل الحقن في الوريد الذيلية من 30 HPF الأجنة. لتصور تجنيد الخلايا المناعية، وتتم الحقن في مواقع محلية مثل في العضلات الذيل في 48 HPF الجنين.

1. تمييع قيحة الفطرية في 1 X PBST (اعتمادا على عدد من كفو لأن تدار على النحو المحدد في الخطوة 2.2.6)، التي تحتوي على الفينول الأحمر 10٪ لتحقق حقن السليم.
2. تحميل إبرة حقن microcapillary مع 5-10 ميكرولتر من اللقاح البكتيري باستخدام طرف microloader، ربط الإبرة microinjection في حامل micromanipulator ثلاثي الأبعاد المتصلة حاقن وقطع رأس إبرة مع ملاقط غرامة للحصول على فتح قطرها من 5-10 ميكرون.
3. معايرة حجم الحقن عن طريق ضبط ضغط microinjection (20-50 باسكال) ومرة ​​(0.2 ثانية).
   ملاحظة: يتم معايرة حجم الحقن التي تتطلبها تقرير مرئي لقطر قطرات طرد في صفار البيض للجنين.
4. لحقن الوريد الذيلية، وضع الجنين مع الجانب البطني التي تواجه إبرة (كما هو موضح في القسم 3.2.2) ووضع وثيقة طرف الإبرة لافتتاح البولي التناسلي، واستهداف الوريد الذيلية، ودفع بلطف غيض من الإبرة في جنين حتى يثقب فقط caudآل منطقة الوريد. تقديم حجم المطلوب من إعداد البكتيرية، وعادة 1-3 NL تحتوي على حوالي 100 خلية / NL.
5. للحقن العضلي، وضع الجنين مع الجانب الظهري التي تواجه إبرة (كما هو الحال في القسم 3.2.2)، ضع الإبرة على الجسيدة واحد وحقن كمية صغيرة (1 NL) من اللقاح.
   ملاحظة: بالنسبة للحقن الوريد الذيلية، والتهابات في العضل أيضا تحديا لأداء. يجب توخي الحذر لتجنب الحمولة الزائدة التي قد تصيب الأنسجة المحيطة بها.
6. في نهاية إجراء الحقن، والسيطرة على حجم اللقاح عن طريق حقن نفس الحجم من تعليق البكتيرية في قطرة من PBST معقمة تليها طلاء على 7H10 ^OADC وعد CFU. يمكن حقنها حوالي 100 الأجنة بإبرة.
   ملاحظة: نظرا لأن الخام M. قد يستمر خراج لتشكيل المجاميع في الإبرة، تحتاج الحقن الذي يتعين القيام به فورا بعد إعداد اللقاح.
7. نقل الجبهة الاسلامية للانقاذ المصابينح لوحات فردية في 24 جيدا تحتوي على 2 مل / أسماك المياه بشكل جيد واحتضان عند 28.5 درجة مئوية. حقن الأجنة مع 1-3 نيكولا لانغ 1 X PBST يمكن استخدام الضوابط.
8. ويتم رصد العدوى الصحيح من البكتيريا الفلورية في الأجنة باستخدام مجهر مضان.

5. جيل من بلعم المنضب الأجنة

يستخدم استنزاف الانتقائي للالضامة من الأنسجة للتحقيق مساهمتها ودورها خلال العدوى: ملاحظة. لتصور استنزاف السليم الضامة، فمن المستحسن استخدام خط المعدلة وراثيا مع الضامة الفلورسنت، حيث يتم التعبير عن mCherry تحديدا تحت سيطرة بلعم MPEG1 المروج محددة ^19.

1. الإجراء استنادا ليبو-clodronate-
   ملاحظة: يسمح إجراء يبو clodronate استنزاف الانتقائي للالضامة من الأنسجة (ولكن لا العدلات) ^19. هذا المركب لا لا يغير من بقاء الأجنة ولا بالعربيةاملنخفسة سلامة البكتيريا. وقد تم الإبلاغ عن بروتوكول مفصلة لإعداد مغلفة الحويصلية clodronate سابقا ^33.
   1. في 24 HPF، dechorionate الأجنة ونقلها إلى "V" طبق حقن على شكل مملوءة بالماء الأسماك تستكمل مع تريكين للحفاظ على الأجنة في حالة تخدير وحتى نهاية الإجراء حقن، كما هو موضح في 3.2.2. توجيه الجانب الظهري أسفل.
   2. تحميل حقن إبرة microcapillary مع مغلفة الحويصلية clodronate (ليبو-clodronate)، وربط الإبرة microinjection في حامل micromanipulator ثلاثي الأبعاد، وقطع رأس إبرة مع ملاقط غرامة للحصول على قطر افتتاح غيض من 10 ميكرون.
   3. لمعايرة حجم الحقن، وضبط ضغط microinjection إلى 20 هكتوبسكال والوقت حقن إلى 0.2 ثانية. وضع وثيقة طرف الإبرة لافتتاح البولي التناسلي، واستهداف الوريد الذيلية، ودفع بلطف غيض من الإبرة فيالجنين حتى يثقب فقط المنطقة الوريد الذيلية وتسليم حجم المطلوب من الحل (2-3 NL، 3 مرات).
      ملاحظة: تعليق ليبو clodronate لزجة جدا وينبغي vortexed قبل الحقن لتجنب عرقلة الأوعية الدموية وقتل الجنين. ومن الأهمية بمكان للشروع في عدة الحقن المتتالية من أحجام صغيرة.
   4. نقل الأجنة في 100 ملم أطباق بتري تحتوي على أسماك المياه والاحتفاظ بها في 28.5 درجة مئوية حتى العدوى.
   5. السيطرة على نضوب السليم الضامة بواسطة المجهر الفلورسنت.
      ملاحظة: أكمل استنزاف بلعم فعالة لمدة 4 أيام بعد تناوله-يبو clodoronate.
2. الإجراء استنادا Morpholino-
   1. قبل يوم التبويض، وتولد الزرد الكبار من خلال وضع 2 ذكور و 1 أنثى مفصولة حاجز بلاستيكي في غرفة تربية.
   2. في اليوم التالي، ≈ 30 دقيقة بعد ذلك يتحول الضوء على في منشأة الزرد، وإزالة الجدار الذي يفصلالذكور والإناث. الانتظار لمدة 20 دقيقة بعد بداية وضع البيض لتحسين معدل الإخصاب. حصاد البيض وبطء التنمية من خلال نقلهم في طبق بتري 100 مم مملوءة بالماء البارد السمك الأزرق (4 درجات مئوية).
      ملاحظة: السيطرة على وضع البيض هو أمر حاسم لتجاربه التي تستند morpholinos. Morpholinos لا يمكن حقنها في البيض يصل إلى مرحلة أربع خلايا.
   3. جمع البيض باستخدام ماصة وإيداع البيض عليه في "U" على شكل حقن غرفة مملوءة بالماء البارد السمك الأزرق ومنع البيض في القنوات باستخدام أداة microloader طرف محلية الصنع.
   4. إعداد الحل PU.1 morpholino تحتوي على 10٪ من الفينول الأحمر، كما هو موضح سابقا ^(19). تحميل إبرة حقن microcapillary مع إعداد morpholino وربط الإبرة microinjection في حامل micromanipulator ثلاثي الأبعاد، ثم قطع رأس إبرة مع ملاقط غرامة لobtaiنا قطرها افتتاح غيض من 5-10 ميكرون.
   5. لمعايرة حجم الحقن، وضبط ضغط microinjection إلى 20-50 هكتوبسكال والوقت حقن إلى 0.2 ثانية. وضع طرف الإبرة على مقربة من البيض، ودفع بلطف غيض من الإبرة من خلال المشيمه داخل البويضة وتسليم حجم حل morpholino المطلوب، وعادة 3-5 NL.
   6. بعد حقن الصغرى، ونقل البيض في 100 مم طبق بتري في أسماك المياه واحتضان عند 28.5 درجة مئوية حتى يبدأ الإجراء العدوى.
   7. تحليل سليم (كاملة) نضوب الضامة في morphants PU.1 بواسطة المجهر الفلورسنت في 30-48 _HPF.
      ملاحظة: اعتمادا على تركيز حقن، morpholinos ص u.1 قد تؤثر أيضا على عدد من العدلات في وقت مبكر. لتأكيد استنزاف السليم الضامة دون تغيير عدد من العدلات، فمن المستحسن استخدام خط الزرد المعدلة وراثيا مزدوج مع الضامة الفلورسنت والعدلات (مع GFPالتعبير مدفوعة تحديدا من قبل المروج MPX) ^19.

6. الجرثومي العبء الكمي

1. تقرير كتبها كفو العد
   1. في نقطة الوقت المطلوب، وجمع مجموعات من الأجنة المصابة (5 في الشروط) في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge (1 جنين / أنبوب)، البرد تخدير الأجنة عن طريق الحضانة على الجليد لمدة 10 دقيقة والموت ببطء باستخدام جرعة زائدة من تريكين (300- 500 ملغم / لتر)
   2. غسل الأجنة مع الماء المعقم مرتين والاستغناء لهم في أنبوب جديد، ليز كل جنين مع 2٪ تريتون X-100 المخفف في 1 X PBST باستخدام إبرة 26-G والتجانس تعليق حتى تحلل كامل. أجهزة الطرد المركزي لتعليق و resuspend بيليه في 1 X PBST مع توين ومطلي 80. التخفيفات المسلسل من الخليط على ميدلبروك 7H10 ^OADC وتستكمل مع BBL MGIT PANTA، على النحو الموصى به من قبل المورد 0.05٪.
      ملاحظة: M. خراج كونها أكثر عرضة لهيدروكسيد الصوديوم المعاملهر من M. marinum، وإزالة التلوث من لست] الأسماك دون أن يؤثر ذلك M. ويمكن تحقيق النمو خراج بنجاح باستخدام المضادات الحيوية كوكتيل BBL MGIT PANTA.
   3. احتضان لوحات لمدة 4 أيام في 30 ° C وعدد المستعمرات.
2. تقرير من قبل الإسفار بكسل عدد (الشركة العامة للفوسفات) القياسات في الأجنة الحية
   ملاحظة: لتحديد الأحمال البكتيرية عن طريق الانبعاثات مضان، يتم الحصول على صور المسلسل من الأجنة المصابة وكثافة مضان تقاس الشركة العامة للفوسفات (تحديد البكتيريا عن طريق تحليل الجزيئات) باستخدام ماكرو محلية الصنع وضعت لمجانية يماغيج. تحليل الجسيمات يتطلب صورة بالأبيض والأسود الثنائية التي تعتمد على مجموعة العتبة التي تسمح لتميز إشارة الفلورسنت من الاهتمام من الخلفية.
   1. في نقطة الوقت المطلوب، tricain-تخدير الأجنة المصابة (5-10 في حالة) في 35 ملم أطباق بتري كما هو موضح في 3.2.2.
   2. إزالة المياه وsubmeRGE الأجنة وسطح الصحن كله مع 1٪ انصهار منخفضة نقطة الاغاروز في أسماك المياه، ثم محاذاة أفقيا الأجنة. تغطية الاغاروز طدت مع أسماك المياه التي تحتوي على تريكين.
   3. الحصول على صور مضان من جنين كامل باستخدام مجهر epifluorescence مع الهدف 10 X.
      ملاحظة: إن الحصول على الصور مضان هو خطوة حاسمة لإجراء القياسات الشركة العامة للفوسفات. من المهم أن استخدام جهاز معايرة مع لجنة التحقيق معايرة الألوان. ضبط الوقت الأمثل التعرض للحصول على الخلفية الحد الأدنى من خلال الاستحواذ يمنع تشبع الإشارة. يجب أن تكون الصور في شكل شجار 8 بت. يتم الاحتفاظ إعدادات متطابقة طوال فترة التجربة لأغراض الكمية.
   4. إزالة بعناية الاغاروز من الأجنة مع أداة microloader طرف محلية الصنع. هذه الأجنة يمكن أن تستخدم لتحليلات لاحقة إذا لزم الأمر. قبل تحديد مقدار الحمولة الجرثومية، كل صورة يجب أن جودة التحكم. لnalyze الصور وتحويل كثافة مضان في الشركة العامة للفوسفات في الأسماك، افتح مجانية يماغيج.
      ملاحظة: تعكس قيمة الشركة العامة للفوسفات عبء البكتيرية كما هو موضح سابقا باستخدام M. marinum ^34.
   5. تحديد الحد الأدنى المطلوب لتحليل الصور باستخدام صورة لجنين غير مصاب (عدة أجنة السيطرة يمكن أن تستخدم للحصول على عتبة متوسط). الذهاب إلى صورة → → ضبط عتبة ثم قم بتحريك شريط التمرير السفلي في نافذة عتبة إلى اليمين حتى تصبح خلفية سوداء تماما (أي، للحصول على الخلفية يجب أن تكون على الصفر). تسجيل القيمة المقابلة.
   6. ضمن صورة J، فتح الماكرو الشركة العامة للفوسفات (ملف التكميلي) واتبع التعليمات: حدد موقع مجلد من الصور التي سيتم قياسها ومن ثم أدخل عتبة كما سبق تحديدها وانقر على "OK".
      ملاحظة: الماكرو ينقص الخلفية تلقائيا. ثم يتم تطبيق العتبة. إشارات الفلورسنت هي هوية منذfied بعد تحليل الجزيئات.
   7. نسخ ولصق البيانات من نافذة ملخص لعن البرنامج المطلوب لتحليل البيانات.
      ملاحظة: على النقيض من طريقة تحديد كفو، وطريقة الشركة العامة للفوسفات هو غير الغازية ويسمح إعادة استخدام الأجنة للتحليلات لاحقة، والأهم، ورصد ديناميات / حركية عبء البكتيرية على أساس فردي. ولذا، ويسمح لخفض كبير في عدد الحيوانات، بالاتفاق مع القواعد الأخلاقية.

7. التصوير M. الأجنة المصابة abscessus-

1. تصوير حي لM. عدوى خراج
   1. جبل الأجنة تخدير تريكين (انظر 3.2.2) في 1٪ انصهار منخفضة نقطة الاغاروز في 35 ملم طبق بتري قبل الملاحظات المجهر epifluorescence. استخدام طبق أسفل الزجاج لمقلوب المجهر متحد البؤر أو في واحدة شريحة تجويف الاكتئاب لتستقيم متحد البؤر المجهري. توجيه الجنين إلى الموضع المطلوب والغطاءالاغاروز طدت مع أسماك المياه التي تحتوي على تريكين.
   2. استخدام المجهر epifluorescence مع الهدف 10 X لاقتناء مضان ونقل صور متسلسلة للجنين كامل. بدلا من ذلك، استخدم المجهر متحد البؤر مع 40X 63X أو الأهداف التي تصور نشاط الخلايا المناعية بعد العدوى.
2. التصوير ثابتة M. خراج إصابة الأجنة
   1. الموت ببطء الأجنة كما هو موضح في 6.1.1 ونقلها إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الصغيرة وإصلاح الأجنة في بارافورمالدهيد 4٪ في 1 X PBST لمدة 2 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية. إزالة امتصاص العرق عن طريق غسل الأجنة مرتين مع 1 X PBST لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: للحفاظ على مضان والأجنة الثابتة يجب أن تكون محمية من الضوء.
   2. للحفاظ على سلامة الأنسجة ومضان، يتم تحضين الأجنة تباعا في زيادة تركيز حلول الجلسرين (10، 20، 30، 40 و 50٪ المخفف في 1 X PBST)، ل10 دقيقة لكل حالة.
      ويمكن تخزين الأجنة ثابت لعدة أشهر في 50٪ الجلسرين عند 4 درجة C: ملاحظة.
   3. وضع الجنين جزءا لا يتجزأ من 50٪ الجلسرين في غرفة العرض (1B الشكل) ^31.
   4. الصورة باستخدام 40X 63X أو أهداف على المجهر متحد البؤر.

Results

على الرغم من مختلف المواقع التشريحية يمكن حقن ^32، وغالبا ما يتم استخدام حقن الوريد الذيلية لتوليد العدوى النظامية للتحليلات لاحقة بما في ذلك التجارب البقاء على قيد الحياة، البكتيرية تقرير عبء، والنشاط البلعمة أو تشكيل الحبل. يتم استخدام الحقن في العضلات الذيل لتقييم توظيف الضامة في موقع الحقن (الشكل 3A). للتحقيق ومقارنة الفوعة من المتغيرات R و S م. خراج، يتم حقن تعليق البكتيرية الفلورسنت في الوريد الذيلية من 30 HPF الأجنة (الشكل 3A)

Discussion

وقد ظهرت مؤخرا الزرد كنظام نموذج الفقاريات ممتازة لدراسة ديناميات عدوى بكتيرية باستخدام حقل واسع والتصوير متحد البؤر في الوقت الحقيقي ^36. مزيج من تعليق المتفطرات تفرقوا (بروتوكول 2.2) جنبا إلى جنب مع أساليب الحقن الدقيقة (بروتوكول 4) يسمح التهابات استنساخه النظامية، ورصد لاحق والتصور لتطور العدوى مع التركيز بشكل خاص على التفاعلات البكتيرية مع الضامة المضيف. الفوعة M. خراج في الجسم الحي يمكن التحقيق وذلك بفضل استخدام البرية من نوع الزرد الذهبي ^37.<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BBL MGIT PANTA	BD Biosciences	245114
ألبومين مصل الأبقار	Euromedex	04-100-811-E
Catalase من Bovine Liver	سيجما ألدريتش	C40
ديفكو ميدلبروك 7H10 أجار	BD Biosciences	262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth	BD Biosciences	271310
ملح إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات (تريكايين)	سيجما ألدريتش	A5040
حمض الأوليك	سيجما ألدريتش	O1008
دلتا بارافورمالديهايد	Microscopie	15710
Phenol Red	Sigma-Aldrich	319244
Tween 80	Sigma-Aldrich	P4780
Agar	Gibco Life Technologie	30391-023
منخفض الذوبان agarose	Sigma-Aldrich
أملاح البحر الفورية للمحيط	شركة Aquarium Systems Inc
الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات	أداة سوتر شركة	BF100-78-10	1 مم OD × 0.78 مم معرف
جهاز مجتذب الماصة الدقيقة	Sutter Instrument Inc		Flamming / Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector	Tritech Research		حاقن رقمي microINJECTOR, Minj-D
Tweezers	Sciences Tools Inc		Dumont # M5S
نصائح Microloader	Eppendorf