جيل من التكامل خالية الإنسان المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية عن طريق الشعر المستمدة من الخلايا الكيراتينية

اكتشاف الناجمة عن النشاط البشري الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) قد أحدثت ثورة في مجال الطب التجديدي، وتوفير وسيلة عملية لتوليد الخلايا الجذعية المريض محددة ^1-3. وقد ولدت hiPSCs بنجاح من مختلف أنواع الخلايا الجسدية، بما في ذلك الخلايا الليفية ^{4،5، 6،7} الخلايا المكونة للدم والخلايا الظهارية الكلوية من البول ⁽⁸⁾ والخلايا الكيراتينية ^9،10. حتى الآن، الخلايا الليفية الجلد والخلايا المكونة للدم تمثل مصادر الخلايا الأكثر استخداما لتوليد iPSCs المريض محددة. يمكن القول، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن خزعات الجلد وجمع الدم هي الإجراءات الطبية الروتينية والمصارف البيولوجية كبيرة من المرضى عينات الدم أو الجلد وأنشئت في كثير من البلدان هذه.

وعلى النقيض من خلايا الدم والخلايا الليفية الجلدية التي تتطلب أساليب الاستخراج الغازية، الكيراتينية تمثل نوع من الخلايا يمكن الوصول إليه بسهولة لتوليد hiPSC. Keratinocytوفاق هي خلايا الكيراتين الغنية الظهارية التي تشكل حاجز البشرة الخارجية للجلد وتوجد أيضا في الأظافر والشعر ^11. على وجه الخصوص، الكيراتينية ويمكن الاطلاع على غمد الجذر الخارجي (ORS) من بصيلات الشعر، وهي طبقة الخلايا الخارجية التي يغطيها جذع الشعرة مع غمد الجذر الداخلية (IRS) خلايا ^(12، الشكل 1). كما جمع الشعر هو إجراء بسيط لا يتطلب المساعدة من العاملين في المجال الطبي، فإنه يوفر فرصة للمرضى لجمع وإرسال عينات من الشعر الخاصة للمختبرات، والتي من شأنها أن تسهل إلى حد كبير جمع عينات من المرضى لتوليد hiPSC. يكون الكيراتينية البشرة أيضا أعلى كفاءة إعادة برمجة وحركية إعادة برمجة أسرع مقارنة مع الخلايا الليفية، إضافة إلى مزايا استخدام الخلايا الكيراتينية كما الخلايا تبدأ لتوليد hiPSC ^9،13. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تتولد hiPSCs استخدام السكان الخلية الآخرين داخل بصيلات الشعر،بما في ذلك خلايا الجلد حليمة التي تقع في قاعدة ^14،15 بصيلات الشعر.

التقارير السابقة للجيل التوجيهية باستخدام الخلايا المشتقة من الشعر غالبا ما تستخدم أساليب برمجة فيروسات أو القائم على lentiviral ^9،14،15. ومع ذلك، وهذه الأساليب الفيروسية إدخال التكامل الجيني غير مرغوب فيه من الجينات المحورة الخارجية خلال إعادة برمجة. في المقارنة، واستخدام ناقلات episomal يمثل ممكنا، طريقة إعادة برمجة غير الفيروسي لتوليد iPSCs خالية من التكامل ^4. لقد سبق وضعت لذلك، طريقة بسيطة فعالة من حيث التكلفة وغير فيروسية لإعادة برمجة الخلايا الكيراتينية في hiPSCs باستخدام ناقلات episomal ¹³ بكفاءة. نحن هنا نقدم بروتوكول مفصل لتوليد hiPSCs المستمدة من الخلايا الكيراتينية، بما في ذلك اشتقاق الخلايا الكيراتينية من التقطه الشعر، وتوسيع وصيانة الخلايا الكيراتينية وإعادة برمجة لاحقة لتوليد hiPSCs.

جمع عينة شعر الإنسان من الأفراد يتطلب موافقة أخلاقية من قبل لجنة أخلاقيات البحوث البشرية في المؤسسات المضيفة وينبغي أن يتم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.

1. عزل الخلايا الكيراتينية من الشعر التقطه

1. ذوبان الجليد خارج الخلية مصفوفة (ECM) حل (أي Matrigel) على الجليد O / N.
2. باستخدام نصائح ماصة قبل المبردة، إضافة 200 ميكرولتر حل ECM إلى 12 مل من المبرد المتوسطة DMEM / F12. معطف لوحة 12-جيدا مع 1 مل من محلول ECM المخفف في كل بئر. احتضان لوحة المغلفة O / N عند 37 درجة مئوية. غسل لوحة مغطاة قبل تحسنت DMEM / F12 المتوسطة قبل الاستخدام.
3. جمع الشعر البشري الأساسي من رأس الفرد عن طريق وضع الأصابع على مقربة من جذور الشعر ونتف الشعر في حركة واحدة سريعة وسلسة. تحقق للتأكد من أن كل شعرة جمعت يحتوي على بصيلات الشعر سليمة وتحديد مرحلة النمو للأمم المتحدة الشعردير مجهر تشريح (الشكل 1).
   1. جمع 10/5 الشعر طور التنامي من كل فرد لاستخراج الخلايا الكيراتينية. التقطه عملية الشعر في أقرب وقت ممكن لضمان نجاح الاشتقاق من الخلايا الكيراتينية.
      ملاحظة: يوضح الشكل 1 مورفولوجية الشعر في مراحل مختلفة من دورة النمو. الشعر طور التنامي في مرحلة النمو، مع طبقة خارجية واضحة على البشرة المحيطة طول الشعر، والمعروفة باسم ORS. من ناحية أخرى، والشعر تساقط الشعر يمثل الشعر في طور الراحة وليس لديها ORS مرئية، ولكن لديه الكرة واضحة من الخلايا التي تغطي جذور الشعر، والمعروفة باسم انتفاخ تساقط الشعر.
4. وضع عينات الشعر في طبق بتري تحتوي على 10 مل من المضادات الحيوية ميكس لغسل لمدة 5 دقائق على RT.
5. باستخدام مقص معقم وملقط، وقطع المفرط عمود الشعر، وترك جزء الشعر مع بصيلات الشعر سليمة وحول 0،5-1 سم من جذع الشعرة.
6. هيئة تنظيم الاتصالات بعنايةnsfer جزء 1 الشعر في كل بئر من لوحة المغلفة ECM باستخدام ملقط.
7. باستخدام ماصة 1 مل، إضافة حوالي 3 قطرات من خروج المغلوب المصل استبدال (KSR) متوسطة (~ 100-200 ميكرولتر) للعينات الشعر.
   ملاحظة: حافظ على شظايا الشعر على اتصال وثيق على سطح لوحة للسماح للمرفق واللاحقة كيراتينية ثمرة. إضافة وسائل الإعلام المفرط في هذه الخطوة قد يسبب شظايا الشعر لتطفو ويقلل من فرصة للنجاح المرفق الشعر.
8. احتضان عينات الشعر في الحاضنة 37 درجة مئوية مع CO ₂ 5٪ والسماح للبصيلات الشعر إرفاق O / N. في اليوم التالي، إضافة بلطف 3 قطرات أخرى من KSR المتوسطة (~ 100-200 ميكرولتر) للحفاظ على عينات الشعر رطبة.
9. مراقبة عينات الشعر يوميا للتأكد من أن بصيلات الشعر وقد أرفقت بنجاح. عموما الحجز على بصيلات الشعر هو واضح في غضون 1-3 أيام. الشعر الكثيف وعادة ما تكون أسهل إرفاق بالمقارنة مع الشعر الجميلة، والشعر الجميلة لديها أعلىاتجاه لتعويم التي تعيق عملية الحجز.
   1. بمجرد أن تعلق على الشعر للوحة المغلفة، إضافة 500 ميكرولتر من KSR المتوسطة إلى البئر. اتخاذ مزيد من الحذر عند إضافة المتوسطة كعينات الشعر ربما لم ترتبط بقوة. من هذه النقطة، وتغيير وسائل الاعلام كل يوم 2.
      ملاحظة: يجب أن يكون الامتداد الكيراتينية مرئية من المنطقة ORS من شظية الشعر بعد 3-7 أيام (الشكل 2A-B). السماح للالكيراتينية لتنمو لتصل إلى 14 يوما قبل الركض الخلايا كما هو موضح في المقطع التالي.

2. صيانة والركض من الخلايا الكيراتينية

1. قبل معطف لوحة 6 جيدا باستخدام أدوات طلاء مصفوفة. إضافة 680 ميكرولتر من المتوسطة التخفيف من عدة إلى كل بئر، تليها 6.8 ميكرولتر من محلول طلاء مصفوفة. يهز لوحة لضمان توزيع موحد من الحل مصفوفة طلاء على لوحة.
2. السماح لوحة المغلفة لاحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. إزالةالحل طلاء مصفوفة قبل الطلاء من الخلايا الكيراتينية.
3. فصل الخلايا الكيراتينية في تعليق خلية واحدة مع 500 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين لكل بئر لمدة 2-5 دقيقة عند 37 ° C. إبطال نشاط التربسين مع 500 ميكرولتر من مصل (على سبيل المثال، الجنين مصل بقري (FBS) المتوسطة) وجمع في أنبوب معقم 15 مل. إزالة شظية الشعر باستخدام ملقط معقم.
4. تحديد عدد الخلايا التي تحصد باستخدام haemocytometer.
5. الطرد المركزي الخلايا لمدة 3 دقائق في 200 ز س. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وتكرار الطرد المركزي. نضح في برنامج تلفزيوني و resuspend بيليه خلية في المتوسط ​​الطازجة الكيراتينية.
6. لوحة أسفل 4 × 10 ⁴ الخلايا الكيراتينية في بئر واحدة من لوحة المغلفة ECM في وجود الكيراتينية المتوسطة. الحفاظ على الخلايا الكيراتينية في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ (الشكل 2C). تغيير وسائل الاعلام كل يوم ومرور الخلايا عندما الثقافة ~ 80٪ متموجة، مبادرة الخوذ البيضاءالفصل قد يستغرق حوالي 2-7 أيام اعتمادا على عدد مرور وانتشار نسبة الخلايا الكيراتينية. ينبغي توسيع الخلايا الكيراتينية المشتقة لتوليد الأسهم المجمدة كافية باستخدام أساليب التجميد البطيء القياسية الحفظ بالتبريد ^16.
   ملاحظة: شروط الثقافة وصفه تدعم التوسع في عدد السكان متجانسة من الخلايا الكيراتينية مع نموذجي الحصوه التشكل (الشكل 2C). في بعض الأحيان، عدد قليل من الخلايا الكيراتينية متباينة، مع التشكل كبيرة ومسطحة وفقدوا إمكانية الاستنساخ، يمكن ملاحظة في الثقافة. توصيف الخلايا القرنية يمكن أن يؤديها المناعية باستخدام أجسام مضادة ضد cytokeratin 14 كما سبق وصفه ^(17). وينبغي أيضا أن يتم اختبار خطوط الخلايا الكيراتينية التي أنشئت لالميكوبلازما بعد 1-3 المقاطع باستخدام عدة متاحة تجاريا.

3. توليد hiPSCs من الخلايا الكيراتينية عن طريق Episomal المتجهات

1. قبل معطف لوحة 6 جيدا مع0.1٪ الجيلاتين (2 مل / جيد). السماح الجيلاتين لمعطف لمدة 20 دقيقة على الأقل في RT.
2. لتجربة برمجة، الكيراتينية استخدام في موعد أقصاه مرور 6. فصل الخلايا الكيراتينية في تعليق خلية واحدة مع 1 مل من 0.25٪ التربسين لكل بئر لمدة 2-5 دقيقة عند 37 ° C. تعطيل التربسين مع 1 مل من وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل (على سبيل المثال، وسائل الإعلام FBS) وجمع في أنبوب 15 مل.
3. خلايا الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 x ج و resuspend الخلايا الكيراتينية في المتوسط. لوحة 1 × 10 ⁵ -1.5 × 10 ⁵ الخلايا الكيراتينية لكل بئر في لوحة مهيلم O / N.
4. في اليوم التالي (يوم 0)، والتحقق من لوحة لضمان الخلايا هي 50-60٪ متموجة.
   ملاحظة: إذا الكيراتينية أقل من 50٪ ~ متكدسة أنها قد لا تنمو بشكل جيد بعد ترنسفكأيشن.
5. في يوم 0، نفذ ترنسفكأيشن من ناقلات episomal إعادة برمجة على الخلايا الكيراتينية، وذلك باستخدام نسبة من 8 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن إلى 2 ميكروغرام مجموع DNA البلازميد.
   1. اتخاذ 0.5 ميكروغرام لكل من 4 البلازميدات (pCXLE-EGFP، pCXLE-hOct3 / 4-shP53F، pCXLE-HSK، pCXLE-الهول) وتمييع في 100 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​المصل (على سبيل المثال، OPTI-MEM).
      ملاحظة: يتم استخدام البلازميد pCXLE-EGFP لمراقبة الكفاءة ترنسفكأيشن في الخلايا الكيراتينية وليس مطلوبا لإعادة البرمجة الناجحة.
   2. إضافة 8 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن إلى DNA المخفف. مزيج عبها الأنبوب. السماح للمزيج رد فعل DNA للراحة دون عائق في RT لمدة 15 دقيقة.
   3. استبدال المتوسطة الكيراتينية مع المتوسط ​​الطازجة.
   4. بلطف إضافة مزيج رد فعل الحمض النووي للثقافة الكيراتينية واحتضان في الحاضنة 37 درجة مئوية مع CO ₂ 5٪ لمدة 4 ساعة.
      ملاحظة: لا ينصح لأداء لفترات طويلة ترنسفكأيشن O / N في القرنية لأنها تظهر بقاء منخفض بعد ترنسفكأيشن.
   5. بعد 4 ساعات بعد ترنسفكأيشن، استبدل المتوسطة الكيراتينية مع المتوسط ​​الطازجة.
6. في يوم 1 (1 يوم آخر العابرالخمج (العدوى))، وتغيير المتوسطة الخلايا الكيراتينية وتحقق كفاءة ترنسفكأيشن من خلال تقدير النسبة المئوية للخلايا إيجابية EGFP تحت المجهر الفلورسنت. وعادة ما يلاحظ> 60-70٪ كفاءة ترنسفكأيشن لالكيراتينية الأولية باستخدام هذا البروتوكول.
7. في يوم 2، وتكرار ترنسفكأيشن كما هو موضح في الخطوة 3.5. أن اثنين transfections التوالي عادة تحقيق> 90٪ كفاءة ترنسفكأيشن. ثقافة الكيراتينية عادة ما تصل التقاء بحلول نهاية ترنسفكأيشن الثاني.
   1. إعداد طبق 10 سم من الماوس الخلايا الليفية الجنينية (MEF) المغذية لكل رد فعل برمجة. إعداد مغذيات MEF المعطل ميتوتيكلي كما هو موضح سابقا ^(18).
   2. قبل معطف طبق 10 سم مع 5 مل من 0.1٪ الجيلاتين لمدة 20 دقيقة على الأقل. لوحة 4 × 10 ⁶ MEF المعطل ميتوتيكلي في صحن 10 سم في FBS المتوسطة. السماح للخلايا لتسوية وإرفاق O / N في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.
8. في يوم 3، هارسترة الخلايا الكيراتينية مع 0.25٪ التربسين كما هو موضح في الخطوة 3.2 و 3.3. Resuspend والخلايا الكيراتينية في KSR المتوسطة وصفيحة 90٪ من الخلايا الكيراتينية من 1 بئر من لوحة 6 جيدا في صحن 10 سم المغذية MEF مع KSR المتوسطة.
9. من يوم 4 وما بعده، تغيير المتوسطة KSR كل يوم.
   1. بدلا من ذلك بعد يوم 18، واستبدال مستنبت كل يوم الثاني على التوالي.
      ملاحظة: سوف الكيراتينية غير برمجتها تتوقف عن التكاثر، في حين المستعمرات hiPSC مع حدود المعرفة التي تشبه الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) ستخرج من يوم 14-21.
10. عزل المستعمرات hiPSC عن طريق تشريح اليدوي من يوم 21 وما بعده. تجنب المستعمرات hiPSC أن تتجمع معا بشكل وثيق وفقط اختيار المستعمرات hiPSC التي تكون مفصولة بشكل واضح من الآخرين.
    ملاحظة: المستعمرات hiPSC يمكن التقاطها في وقت سابق، ولكن المستعمرة مع حدود محددة قد لا يكون واضحا في نقطة زمنية سابقة نظرا لحجم مستعمرة صغيرة. قد تختلف كفاءة إعادة برمجة بين فرقويتأثر المريض erent في الخلايا الكيراتينية، وأيضا بسبب عوامل أخرى مثل عدد مرور أو معدل انتشار الخلايا الكيراتينية.
    1. لتشريح اليدوي للمستعمرات hiPSC، استخدام إبرة 26G لخفض المستعمرات hiPSC تحت المجهر تشريح. قطع مستعمرة hiPSC إلى قطع صغيرة حول 300-600 ميكرون في الطول. نقل القطع من أحد hiPSC مستعمرة في لوحة التغذية MEF الجديدة (2.5 × 10 ⁴ MEF / سم ²⁾ لإنشاء خط نسيلي من hiPSCs. في البداية، ثقافة كل سطر نسيلي hiPSC في بئر واحدة من 12 لوحة أو ثقافة الجهاز أطباق جيدا، ثم توسع إلى 6 شكل لوحة جيدا.
    2. الحفاظ على خطوط نسيلي المعمول بها hiPSCs في KSR المتوسطة على مغذيات MEF. وبمجرد أن تصل إلى ثقافة 70-80٪ confluency مع المستعمرات hiPSC ~ 1.5 مم في القطر، hiPSCs مرور باستخدام الأساليب القياسية الأنزيمية الركض (Accutase، Dispase أو كولاجيناز IV) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
11. تميز تأسيس خط hiPSCالصورة لتأكيد تعدد القدرات وقدرتها على التمايز إلى ممثل خلايا الطبقات الجرثومية الثلاث في المختبر و / أو في الجسم الحي ^13،19. أيضا، خطوط hiPSC بشكل روتيني التجريبى أنشئت لالميكوبلازما باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا للتأكد من أنها خالية من مسببات الأمراض. مراقبة روتينية الاستقرار الجيني خطوط hiPSC التي كتبها تنميط نووي أو المستندة إلى مجموعة التباين في عدد النسخ (CNV) التحليل.

الشعر يمر عبر 3 مراحل مختلفة من دورة النمو: طور التنامي (مرحلة النمو)، فترة التراجع (مرحلة الانحدار) وتساقط الشعر (مرحلة الراحة) 20،21. بصيلات الشعر الشعرالمتنامي يحتوي على طبقات متعددة من ظهارة. وتشمل هذه الطبقات على ORS، IRS ورمح الشعر (الشكل 1). طور التنامي الشعر في نهاية المطاف يخضع انتقال إلى المرحلة فترة التراجع التي تميزت موت الخلايا المبرمج من ORS وإنهاء رمح الشعر التمايز. أخيرا، فترة التراجع التي تمر بمرحلة انتقالية الشعر إلى مرحلة تساقط الشعر، حيث توقف الخلايا وبصيلات تساقط الشعر تصبح هادئة مع تيلوغن مميزة انتفاخ 20،21.

ويوضح الشكل 1 مورفولوجية الشعر تساقط الشعر والشعر الشعرالمتنامي. نحن نستخدم عادة الشعر الشعرالمتنامي لكيراتينية الاشتقاق. بعد هذا البروتوكول، الامتداد كيراتينية يمكن ملاحظة في أقرب وقت بعد 3 أيام المرفقات الشعر (الشكل 2A) وسوف تستمر إلى proliferate (الشكل 2B). في تجربتنا، قد تفشل بعض الشعر طور التنامي إرفاق أو لا يلتزمون كيراتينية ثمرة. وهكذا جمع لا يقل عن 5 - 10 شعرة التنامي من كل فرد لضمان نجاح العزلة الخلايا الكيراتينية. وفي وقت لاحق، والخلايا الكيراتينية يمكن passaged على لوحة جديدة والحفاظ على مقاطع متعددة (الشكل 2C). من المهم أن نلاحظ أن هناك نموا أفضل من الخلايا الكيراتينية على مصفوفة طلاء مع الكيراتينية المتوسطة كما هو موضح في الباب 2، مقارنة ل Matrigel مع KSR المتوسطة.

بعد التوسع، والخلايا الكيراتينية يمكن برمجتها لتوليد hiPSCs كما هو موضح في القسم 3. الشكل 3A يظهر المستمدة من الخلايا الكيراتينية نموذجية hiPSC مستعمرة بعد 32 يوما من إعادة برمجة. ومن الشائع أن نلاحظ بعض التمايز في وسط مستعمرة hiPSC. مرة واحدة التقطت يدويا، hiPSCs المستمدة عادة عرض النواة إلى ارتفاع نسبة حشوية ومستعمرة المحددة المربوطة آرى (الشكل 3B). ويمكن بعد ذلك أن توصف خطوط الخلايا التي أنشئت من hiPSCs لتعدد القدرات كما هو موضح سابقا 13،19، مثل التعبير عن علامات المحفزة OCT4، NANOG وTRA-160 (الشكل 3C-E).

الشكل 1. صور الممثل من الشعر التقطه في مراحل النمو المختلفة. (A) رسم بياني يوضح الشعر في مرحلة طور التنامي أو تساقط الشعر. صور الطوري يظهر الشعر التقطه في (ب) مرحلة تساقط الشعر و(C) طور التنامي المرحلة. HS رمح = الشعر؛ IRS = الجذر الداخلية غمد. ORS = الجذر الخارجي غمد. على نطاق وبار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. صور الممثل hiPSCs المشتقة من الخلايا الكيراتينية. (A) صورة المرحلة النقيض من يوم 32 الثقافة برمجة تظهر المشتقة من الخلايا الكيراتينية hiPSC المشتركlony. (B) اختيار يدويا hiPSCs المشتقة من الخلايا الكيراتينية مع التشكل مماثلة لhESCs. المناعية من hiPSCs مع علامات المحفزة (C) NANOG و (D) OCT4 و (E) TRA-160 في hiPSCs المستمدة من الخلايا الكيراتينية. على نطاق وبار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.