مقالة منهجية

تقييم محيط بالغدد التناسلية حساسية والبروستات ماست تنشيط خلية في نموذج الفأر من فصل الأمهات حديثي الولادة

DOI:

10.3791/53181

⸱

أغسطس 13, 2015

 ,  ,  , 
1Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن قياس حساسية وتنشيط الخلايا البدينة الميكانيكية محيط بالغدد التناسلية في البروستاتا من الذكور C57BL / 6 الفئران التي خضعت في وقت مبكر نموذج ضغوط الحياة - فصل الأمهات حديثي الولادة، وذلك للحث على نموذج ما قبل السريرية لمتلازمة آلام الحوض / المزمنة المزمنة التهاب البروستات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب البروستاتا المزمن / متلازمة آلام الحوض المزمنة (CP / CPPS) يحتوي على انتشار عمر 14٪ و هو التشخيص المسالك البولية الأكثر شيوعا للرجال الذين تقل أعمارهم عن 50 عاما، ومع ذلك هو اضطراب مزمن آلام الحوض لا يقل عن فهمها ودراستها. مجموعة فرعية كبيرة من المرضى الذين يعانون من ألم مزمن في الحوض التقرير بعد أن شهدت ضغوط الحياة في وقت مبكر أو إساءة المعاملة، التي يمكن أن تؤثر بشكل ملحوظ على أداء وتنظيم الغدة النخامية، الغدة الكظرية (HPA) المحور. تنشيط الخلايا البدينة، وهو ما ثبت على أن تزاد في كل من البول وإفرازات البروستاتا أعرب من المرضى CP / الهادئ، وينظم جزئيا تفعيل المصب من محور HPA. وقد استخدم الأطفال حديثي الولادة فصل الأمهات (NMS) لأكثر من عقدين من الزمن لدراسة نتائج ضغوط الحياة في وقت مبكر من نماذج القوارض، بما في ذلك التغيرات في المحور HPA والحساسية الحشوية. نحن هنا نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام NMS كنموذج قبل السريرية لCP / CPPS في الذكور C57BL / 6 الفئران. وصفنا منهجيةلأداء NMS، وتقييم آلام جلدية الميكانيكية محيط بالغدد التناسلية، والأدلة النسيجي للتنشيط الخلايا البدينة. ونحن نقدم أيضا أدلة على أن الإجهاد النفسي المبكر يمكن أن يكون لها تأثيرات طويلة الأمد على الجهاز البولي التناسلي الذكور في الفئران.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

آلام الحوض المزمنة ليست في حد ذاتها مرضا، بل هو مصطلح يرتبط مع الألم المستمر عفوية و / أو استحضر التي يعاني منها المرضى الذين شخصت مع متلازمة القولون العصبي (IBS)، والتهاب المثانة الخلالي / متلازمة المثانة المؤلمة (IC / PBS)، التهاب الأعضاء الأنثوية، أو التهاب البروستاتا المزمن / متلازمة آلام الحوض المزمنة (CP / الهادئ). وغالبا ما المرضية هذه المتلازمات ومشاركة العديد من الخصائص في أنه ليس لديهم علم الأمراض المرتبطة بها أو تحديد المسببات الكامنة، وإن كان قد أظهرت ضعف في جهاز المناعة والجهاز العصبي المركزي، والجهاز العصبي المحيطي للمساهمة في صيانة وتطور هذه الاضطرابات 1 -3. المرضى الذين يعانون من ألم مزمن في الحوض أكثر عرضة للتقديم مع أعراض إضافية، واضطرابات الألم الوظيفية واضطرابات المزاج، بما في ذلك القلق، والاكتئاب، واضطراب الهلع 4-6 والذي ارتبط مع سير تغير من hypothalamic- غير ذات صلة الحوض- pituitary-الغدة الكظرية (HPA) المحور 10/07. التعرض لضغوط الحياة في وقت مبكر أو الصدمة هو عامل خطر كبير لتطوير تشوهات HPA وما يرتبط بها من متلازمات الألم المزمن 10،11 وعلى هذا النحو، مجموعة فرعية كبيرة من المرضى الذين يعانون من اضطرابات آلام الحوض وظيفية بأنهن شهدت أحداث الطفولة السلبية مثل سوء المعاملة أو الإهمال 12-14.

نماذج القوارض الفصل حديثي الولادة الأمهات (NMS)، والتي تنطوي على إزالة الجراء من السد لفترة معينة من الوقت خلال فترة preweaning، وقد استخدمت على مدى العقدين الماضيين لدراسة نتائج ضغوط الحياة في وقت مبكر. بشكل عام، وقد تبين NMS لزيادة HPA محور التنشيط، والسلوكيات مثل القلق الناتجة، التي تؤثر بشكل مباشر على التعبير الجيني داخل منطقة ما تحت المهاد، فضلا عن عرقلة تنظيم المصب من الهياكل الحوفي 15-18. وقد تبين أن تعطل سير السليم محور HPA للمساهمة في زيادة القولون والمستقيم 19-22 والمهبل 16 حساسية المعروضة من قبل القوارض NMS النماذج، ولكن على الرغم من توصيف واسعة من تأثير على المدى الطويل بعد الولادة التهاب المثانة 23-25، وتأثير ضغوط الحياة في وقت مبكر قد ذهب إلى حد كبير غير مدروسة في الأجهزة التناسلية. ولذلك، فإن الدراسة التالية تصف كيفية أداء NMS في الفئران وبعد ذلك تقييم حساسية الميكانيكية محيط بالغدد التناسلية وتسلل الخلايا البدينة / التنشيط في البروستاتا للتحقق من استخدام الفئران الذكور للمرفق كنموذج قبل السريرية لCP / الهادئ.

لجميع المزمنة اضطرابات ألم الحوض تشخيص، CP / CPPS ربما تكون متلازمة الأقل المعترف بها جيدا، وتميزت، على الرغم من وجود انتشار عمر ما يقرب من 14٪ 26 و تكاليف المريض سنوية تقدر ب 4400 $ (مرتين أن آلام أسفل الظهر أو المفاصل التهاب المفاصل 27). المرضى الذين يعانون من CP / CPPS الألم تقرير في العجان والمستقيم والبروستاتا والقضيب والخصيتين، و / أو البطن 28، تجربة مرحبايتم تشخيص درجة gher من الضغط النفسي من المرضى التحكم 29، والحاضر عادة مع أعراض أو مع الحوض المزمنة الألم أو الإضطرابات المزاجية المرضية 5،29-31. العدوى المتكررة، ظهارة تتسرب منها المياه، والتهاب الأنسجة العصبية، وأمراض المناعة الذاتية كلها قد يظن كأسباب محتملة الكامنة وراء CP / CPPS 2،32،33، فضلا عن تنشيط الخلايا البدينة وتحبب 34. وإفرازات البروستاتا وأعرب عن الرجال مع CP / CPPS زادت تريبتاز الخلايا البدينة وعامل نمو الأعصاب (NGF) مستويات 34، وأكدت دراسة لاحقة أن تريبتاز وكربوكسي ببتيداز A (CPA3)، علامة على تنشيط الخلايا البدينة، وزادت أيضا في البول للمرضى CP / CPPS 35. لقد كان دور محتمل للالخلايا البدينة في بداية وصيانة CP / الهادئ محورا رئيسيا من البحوث الحيوانية على هذه المتلازمة حتى الآن. نموذج القوارض الأكثر استخداما تستخدم لدراسة CP / الهادئ هو التهاب البروستات الذاتية التجريبية (EAP) نموذج جنرالerated عن طريق الحقن تحت الجلد من مستضد البروستاتا في مساعد كاملة فرويند، الذي ينتج في درجات مختلفة من التهاب البروستاتا حسب الأنواع والسلالة المستخدمة 34،36-39. وقد تبين تسلل الخلايا البدينة وتفعيل / تحبب لزيادة الحث التالية من EAP 34،35،40. الفئران المعدلة وراثيا نقص في أي من الخلايا البدينة 34 أو مستقبلات تريبتاز PAR2 35 لا تتطور حساسية تكتيك البروستاتا التالية EAP، على عكس الفئران wildtype EAP. في حين أن هذا النموذج قبل السريرية يعيد العديد من خصائص CP البشرية / الهادئ، وبروتوكول الاستقراء هو لا يدل على حالة الإنسان، والتي لديها مسببات متنوعة، وغالبا ما لا تنطوي على التهاب المباشر، والعدوى، او الاصابة البروستات.

تأثير ضغوط الحياة في وقت مبكر على تطوير CP / CPPS في البشر إلى حد كبير ذهب بدون تحقيق. ومع ذلك، فإن الدراسة التي هو جين تاو، وآخرون. 41، أثبتت أن لين الذين أفادوا تاريخ الجسدية في مرحلة الطفولة، والعاطفية، و / أو كان الاعتداء الجنسي بشكل ملحوظ أكثر احتمالا للتعرض لأعراض توحي CP / الهادئ. علاوة على ذلك، أظهرت أن كلا من الألم وعشرات البولية وزيادة في المرضى الذين لديهم تاريخ من الإساءة الجسدية والعاطفية. لقد أثبتنا سابقا أن نفس النموذج NMS في الإناث C57BL / 6 الفئران تنتج الحساسية عن طريق المهبل والشاذ التعبير الجيني في كل من المهبل والمثانة توحي HPA مختلة الناتج محور 16. هذه الأدلة جنبا إلى جنب مع ارتفاع معدل انتشار CP / المرضى الهادئ مع تقديم التواكب المرضي أخرى 42، بما في ذلك IC / PBS واضطرابات المزاج، والتي أكثر وضوحا ثبت أن تكون مرتبطة مع الحياة في وقت مبكر التعرض الإجهاد 12-14، ويوفر الأساس المنطقي لاستخدام نموذج NMS للتحقيق CP / CPPS في الفئران.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول تتفق مع المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة وفقا للمبادئ التوجيهية المحددة من قبل مركز جامعة كانساس الطبية المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

1. حديثي الولادة الأم الفصل (NMS)

  1. مراقبة السدود الحوامل يوميا لولادة القمامة.
    ملاحظة: اليوم يعتبر القمامة ولدت P0.
  2. على P1، إزالة السد من قفص المنزل ووضع في وعاء الثانوية نظيفة.
  3. فرك حفنة من الفراش بين الأيدي النظيفة-القفاز للحفاظ على رائحة قفص المنزل.
  4. إضافة عمق 1-2 سم من الفراش قفص المنزل في نظيفة، وصفت بشكل مناسب 2 L زجاج الدورق. إضافة ما يقرب من نصف أي تخصيب المواد الفراش الإضافية التي هي موجودة في قفص المنزل، على سبيل المثال، nestlet، ورقة تغضن، إلى كوب زجاجي.
  5. بلطف وضع كافة الجراء من القمامة واحدة، كل على حدة، في نفس الكأس.
  6. المكان على الفورالكأس في حاضنة عقد في 33 درجة مئوية و 50٪ الرطوبة لمدة 180 دقيقة.
  7. إزالة السد من الحاوية الثانوية وعودتها إلى قفص المنزل. العودة قفص المنزل لموقعه سكن مناسب داخل الحظيرة.
  8. كرر هذا الإجراء لكل القمامة تمر NMS، وذلك باستخدام قفازات نظيفة والحاويات الثانوية لكل القمامة / السد.
  9. في نهاية فترة الفصل 180 دقيقة، وعودة الفضلات إلى أقفاص وطنهم في نفس الترتيب كما تم إزالتها.
  10. استرداد قفص المنزل من القمامة الأولى التي تم فصلها في وقت سابق اليوم. إزالة السد من قفص المنزل ووضع في وعاء الثانوية نظيفة.
  11. إزالة الكأس الأول من الحاضنة وفرك حفنة من الفراش بين أيدي القفاز نظيفة للحفاظ على رائحة قفص المنزل أثناء التعامل مع الجراء.
  12. بلطف نقل الجراء، بشكل فردي، من الدورق إلى قفص المنزل.
  13. عودة أي التخصيب والفراش المتبقية في الكأس لقفص المنزل.
  14. العودة السد من الحاوية الثانوية إلى قفص المنزل وإعادته إلى موقعه سكن مناسب داخل الحظيرة.
  15. شطف الكأس مع الماء وإعادته إلى الحاضنة. استخدام نفس الكأس لكل القمامة في جميع أنحاء الداخلي الانفصال.
  16. كرر هذا الإجراء لكل القمامة تمر NMS في نفس الترتيب كما تم وضعها في الحاضنة.
  17. كرر هذا الإجراء بأكمله لكل خضوعه القمامة NMS كل يوم من خلال P21.
  18. فطم الجراء للمرفق وساذجة على P22 عن طريق وضع تتزاحم من نفس الجنس معا في أقفاص نظيفة كاملة مع الغذاء والماء. يجب أن تكون ولدت الجراء ساذجة ويضم تحت نفس الشروط الفئران للمرفق، ولكن يخضع أي معالجة إضافية خارج العادية المهام تربية الحيوانات.

2. محيط بالغدد التناسلية الميكانيكية الحساسية

  1. إعداد جهاز فون فراي
    1. جعل الفئران إلى قاعة الاختبار، والسماح لهم للتأقلم لمدة 30دقيقة في حين تبقى في أقفاص وطنهم.
    2. إعداد منطقة الاختبار عن طريق وضع underpad ماصة تحت سلك شبكة قمة الجدول ارتفاع (79 سم × 28 سم) التي توفر مساحة كافية للسماح للمحقق بالاقتراب من الجانب السفلي دون مذهلة الفئران، ما يقرب من 55 سم في الطول.
    3. وضع ما يصل إلى 12 الفئران، بشكل فردي، في ظل واضحة، غرف بلاستيكية مثقبة (11 سم × 5 سم × 3.5 سم) على رأس جدول سلكية. وضع جسم ثقيل على رأس الدوائر لمنع الفئران من الهرب.
    4. تأقلم الفئران لمدة 30 دقيقة إضافية على الشاشة قبل تقييم الحد الأدنى للسحب.
  2. تقييم محيط بالغدد التناسلية الميكانيكية الحساسية
    1. تنفيذ الأسلوب من أعلى إلى أسفل باستخدام مجموعة قياسية من متدرج المجذوذه فون فراي 43. استخدام المجذوذه التالية: 1.65 جم، 2.36 جم، 2.83 جم، 3.22 جم، 3.61 جم، 4.08 جم، 4.31 جم، و4.74 غرام.
      1. عقد قاعدة ز حيدة 3.22 وفضح أحادية تراجعخيوط.
        ملاحظة: قد لا يكون بعض النماذج لتراجع حيدة.
      2. وضعه التحقيق بحيث يتم توجيه حيدة عموديا وعند الفأر هو في حالة تأهب، قادرة على الحركة، ويتم توزيع وزن الجسم بالتساوي بين الكفوف الخلفيتين تطبيقه إما إلى الجانب الأيسر أو الأيمن من كيس الصفن، وتجنب خط الوسط، حتى طفيف لوحظ منعطف في خيوط.
      3. عقد حيدة في مكان لمدة 10 ثانية أو حتى يظهر الحيوان ردا ايجابيا.
        ملاحظة: يعتبر استجابة إيجابية لتكون رعشة السريع أو القفز استجابة لطلب حيدة أو لعق أو سلوك العض الموجهة نحو حيدة. إذا تحرك الماوس أثناء تطبيق حيدة 10 ثانية دون عرض هذه السلوكيات، لا بد من إعادة اختبار حيدة بعد مدة لا تقل عن بقية 1 دقيقة طويلة. إذا كان الماوس لا يتحرك ولا يسلك أي من فوق السلوكيات المدرجة خلال تطبيق حيدة 10 ثانية، ويعتبر ردا سلبيا.
      4. تسجيل ردا على ذلك، إما سلبية أو إيجابية، في دفتر المختبر أو الكمبيوتر المحمول، وتكرار هذا الإجراء على كل من الفئران المتبقية باستخدام 3.22 ز حيدة.
      5. اختبار كل من الفئران مرة أخرى باستخدام حيدة المناسبة القادمة. ملاحظة: إذا عرضت الماوس ردا سلبيا على 3.22 غرام حيدة، تطبيق 3.61 ز حيدة بنفس الطريقة وتسجيل استجابة. إذا عرضت الماوس ردا إيجابيا على 3.22 غرام حيدة، تطبيق 2.83 ز حيدة وتسجيل استجابة.
    2. تواصل اختبار كل فأر باستخدام القادمة حيدة أكبر أو أصغر، حسب الاقتضاء، ل4 تطبيقات إضافية بعد لوحظ أول رد إيجابي.
    3. عودة الفئران لأقفاص المنزل.
    4. استخدام قيمة النهائية فون فراي حيدة تطبيقها في سلسلة محاكمة في وحدات سجل لحساب 50٪ عتبة ز الانسحاب كما هو موضح في Chaplan وآخرون. 43.
عنوان "> 3. المحمضة طولويدين الأزرق ماست تلوين الخلية

  1. تجهيز الأنسجة
    1. تشريح الأنسجة البروستاتا 44 من الفئران التي تم perfused لintracardially مع الثلج الباردة بارافورمالدهيد 4٪ 45. بوستفيكس الأنسجة في 4٪ امتصاص العرق لمدة 1 ساعة على RT ثم cryoprotect في 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني 1X في 4 درجات CO / N.
    2. إعداد (30 مل) حمام صغير من هيبتان ووضعه على الثلج الجاف.
    3. شطف أنسجة البروستاتا في برنامج تلفزيوني 1X والجافة باستخدام واجب ضوء مسح.
    4. إدراج أنسجة البروستاتا في هيبتان الباردة حتى يتم تجميده.
    5. المكان على الفور أنسجة البروستاتا المجمدة في cryomold تحتوي على تركيب وسائل الاعلام ومكان على الثلج الجاف حتى تجمد.
    6. متجر cryomolds في -20 ° C.
    7. قطع مستعرض أنسجة البروستاتا في 7 cryosections ميكرون سميكة باستخدام ناظم البرد.
    8. مكان 8-12 cryosections غير التسلسلي التي تمتد على طول الأنسجة، وعلى شرائح المجهر موجبة الشحنة.
    9. متجر الانتهاء الشرائح في -20 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
  2. إعداد المحمضة طولويدين الأزرق
    1. إضافة 1 غرام من طولويدين الأزرق O إلى 100 مل 70٪ من الإيثانول ودوامة حتى في محلول لإعداد محلول المخزون 1٪. ويمكن تخزين الحل السهم عند RT لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع.
    2. إضافة 1 جم كلوريد الصوديوم إلى 100 مل من الماء في كوب وضعت على رأس لوحة ضجة.
    3. ضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول كلوريد الصوديوم باستخدام 12 M حمض الهيدروكلوريك حتى مجموعة من درجة الحموضة 0.5 - 1.0 يتحقق.
    4. إعداد 0.25٪ طولويدين الأزرق الحل العمل من خلال الجمع بين 8 مل من محلول المخزون طولويدين الأزرق و 32 مل من 1٪ كلوريد الصوديوم الحل. ماصة صعودا وهبوطا لضمان الدمج الكلي للمحلول المخزون طولويدين الأزرق ومزيج باستخدام الدوامة. يجب أن يتم حل العمل الطازجة والتخلص منها بعد استخدام.
  3. تلطيخ Cryosections البروستاتا
    1. إزالة الشرائح التي سيتم تجهيزها من الفريزر والسماح لتتوازن لRT لحوالي 30 مفي.
    2. غسل أقسام الأنسجة عن طريق غمس بشكل فردي الشرائح لمدة حوالي 1 ثانية إلى 50 مل أنبوب مخروطي يحتوي على كمية كافية من 1X PBS للتأكد من أن أقسام الأنسجة محمولة على الشريحة سيتم مغمورة تماما. تسمح الشرائح للهواء الجاف على منشفة ورقية.
    3. مكان الشرائح في وعاء زجاجي تلطيخ تحتوي على ما يكفي 0.25٪ تعمل الحل طولويدين الأزرق للتأكد من أن أقسام الأنسجة محمولة على الشريحة سوف تكون مغمورة تماما واحتضان لمدة 10 - 15 دقيقة في حين على الكرسي الهزاز منصة وضعت في 15 دورة في الدقيقة.
    4. تراجع الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X لحوالي 1 ثانية لتغسل الزائدة طولويدين الأزرق.
    5. وضع الشرائح في مربع الشريحة أو رف في مثل هذه الطريقة أن الشرائح على الجانبين للسماح لتصريف المياه.
    6. تجفيف الشرائح في الفرن عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة أو O / N في RT.
    7. يذوى الشرائح بسرعة باستخدام الكحول، والسماح للشرائح حتى يجف تماما بين التعرض للكحول. الشرائح الجافة من خلال تجفيف على منشفة ورقية لالثاني محو ظهورهم وحواف مع واجب ضوء مسح.
      1. تزج الشرائح في 95٪ ETOH لحوالي 1 ثانية، والسماح ليجف تماما. كرر هذا الإجراء 1-10 مرات حتى يجف الأنسجة أكثر الزرقاء من الأرجواني.
      2. تزج الشرائح في 100٪ ETOH لحوالي 1 ثانية، والسماح ليجف تماما. كرر هذا الإجراء 1-10 مرات حتى الأنسجة مظلمة إلى اللون الأزرق المتوسط، ولكن ليس الأرجواني.
    8. إصلاح وصمة عار التي يحتضنها الشرائح في 100٪ الزيلين لمدة 3 دقائق. السماح ليجف.
    9. ساترة الشرائح مع الجلسرين، PBS، أو وسائل الإعلام تصاعد دائم قائم على زيلين. استنزاف وسائل الإعلام الزائدة وتخزينها في RT.
  4. خلايا ماست تحديد مقدار
    1. تصور طولويدين أقسام الأنسجة الأزرق الملون في 20X التكبير باستخدام المجهر الضوئي (الشكل 2).
    2. عد عدد من الخلايا البدينة الحالية داخل منطقة تصور والتفريق بين الخلايا البدينة غير degranulated وdegranulated. 40X تعظمايون قد يكون من الضروري لتأكيد الوضع التحبيب في بعض الخلايا البدينة.
      ملاحظة: الخلايا البدينة غير degranulated يحمل metachromasia كثيفة مع عدم وجود أو خافت مخطط النووي و / أو أي قذف الحبيبية حول الخلية. الخلايا البدينة Degranulated يحمل metachromasia أقل كثافة ولديها مخطط واضح واضح للنواة و / أو حبيبات الحرة داخل السيتوبلازم وخارج الحدود الخلية.
    3. تواصل تقييم عدد من الخلايا البدينة غير degranulated وdegranulated في مجملها من قسم الأنسجة الحالي. كرر هذا الإجراء على لا يقل عن 7 أقسام منفصلة إضافية، والتي تمتد على طول كل الأنسجة.
    4. حساب النسبة المئوية للdegranulated (DG) إلى إجمالي الخلايا البدينة لكل الأنسجة / الماوس وفقا للمعادلة التالية: (DG الخلايا البدينة / مجموع الخلايا البدينة) × 100.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأظهرت الفئران التي خضعت NMS الأدلة السلوكية يدل على CP / الهادئ. عند اختباره مع سلسلة متدرجة من المجذوذه فون فراي، الفئران للمرفق القديمة أسابيع 8 (ن = 4) ظهور آلام جلدية الميكانيكية محيط بالغدد التناسلية بالمقارنة مع نظرائهم ساذجة (ن = 5، الشكل 2). ويتضح هذا الأمر انخفاضا كبيرا (P <0.01؛ ر الطالب اختبار) في العتبة انسحاب الميكانيكية التي أثارت استجابة سلوكية إيجابية، كما هو مسجل رعشة السريع أو القفز استجابة لطلب حيدة أو لعق أو سلوك العض الموجهة نحو ح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول منهجية لاستخدام الضغط حديثي الولادة، في شكل NMS، للحث على symptomology يدل على CP / CPPS في الفئران الذكور البالغين. كما الكبار، وتعرض الفئران للمرفق آلام جلدية الميكانيكية محيط بالغدد التناسلية كبير، وكذلك دليل على تحبب الخلايا البدينة في أنسجة البروستاتا. استخدام NMS هو نهج جديد لتطوير نموذج ما قبل السريرية لCP / الهادئ في أنه يعيد ضغوط الحياة المبكر الذي غالبا ما أوردته المرضى الذين يعانون من ألم مزمن في الحوض 12-14، فضلا عن دمج التعريفي غير الغاز...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا جانيل ريالز وراشيل سوبل وفرانك وانغ على المساعدة الفنية. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R03 DK080182 (JAC) ، و R01 DK099611 (JAC) ، و R01 DK103872 (JAC) ، ومنحة مركز التميز في البحوث الطبية الحيوية (COBRE) P20 GM104936 (JAC) ، وأموال بدء التشغيل والدعم الأساسي من جائزة كانساس للتطوير المؤسسي (IDeA) P20 GM103418 ، والدعم الأساسي من Kansas IDDRC P30 HD002528 ، وبرنامج زمالة ماديسون وليلى الذاتي (ANP).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الحوامل C57BL / 6 إناث الفئران نهر تشارلز027يجب مراقبة الإناث الحوامل الموقوتات أو غير الموقوتات يوميا للولادة المنزلية.
2 لتر من الدورق الزجاجيSigma-AldrichCLS10002Lسيتم الاحتفاظ بكل فضلات NMS في نفس الدورق طوال فترة الفصل البالغة 21 يوما.
حاضنة الهواء القسري VWR ، VWR الدولية الأساسية414005-124يجب أن تقام الحاضنة عند 33 درجة ؛ C و 50٪ رطوبة.
مقيم حسي لاختبار اللمس ، مجموعة من 20 (مقياس تجميل Semmes-Weinstein Von Frey لتقييم اللمس)Stoelting58011يجب استخدام الشعيرات الأحادية التالية لتقييم حساسية الفترة التناسلية: 1.65 جم ، 2.36 جم ، 2.83 جم ، 3.22 جم ، 3.61 جم ، 4.08 جم ، 4.31 جم ، و 4.74 جم.
الضميمة الحيوانية (12 فأر 6 جرذان)IITC435تأكد من وضع جسم ثقيل فوق حاويات الفردية المصنوعة من الأكريليك لمنع الفئران من الهروب.
حامل شبكي للفئران والجرذان (12 فأر 6 فئران)IITC410ضع الوقوف على سطح طاولة ثابت للوصول المريح.
ملحي مخزن بالفوسفاتSigma-AldrichP5493يخفف مخزون 10x PBS إلى 1x PBS.
بارافورمالدهايدسيجما ألدريتشP6148هناك حاجة إلى محلول بارافورمالدهايد بنسبة 4٪ لاختراق الفئران داخل القلب والأنسجة اللاحقة استعدادا لتلوين الخلايا البدينة.
السكروزSigma-AldrichS5016الأنسجة الثابتة Cryoprotect في محلول السكروز بنسبة 30٪ عند 4 درجات ؛ ج بين عشية وضحاها.
HeptaneSigma-Aldrich246654قم بتبريد السباع على الثلج الجاف لتجميد الأنسجة.
معيار Cryomold  VWR International4557للمساعدة في تجميد أنسجة البروستاتا قبل تقطيع ناظم
Tissue-Tek OCTCompound Sakura458312 × 125 مل
VWR Superfrost Plus Micro SlideVWR International48311-70375 × 25 × 1 مم
Toluidine Blue OSigma-Aldrich198161معتمد من قبل لجنة البقع البيولوجية. مناسب للاستخدام كصبغة متلازمة اللون للخلايا البدينة.
الإيثانول ، المطلق (200 برهان)فيشر ScientificBP2818-4درجة البيولوجيا الجزيئية ، كواشف فيشر الحيوية ؛ ستكون هناك حاجة إلى حلول 95٪ و 100٪ لتجفيف عمليات القطع الملطخة بالتبريد قبل تصور الخلايا البدينة.
كلوريد الصوديومSigma-AldrichS9888يجب أن يكون محلول كلوريد الصوديوم المحمض طازجا قبل تلطيخ التشريح بالتبريد.
GeneMate Sterile 50 مل أنابيب الطرد المركزي BioExpressC-3394أنابيب يمكن التخلص منها تستخدم لخلط عناصر توليدين الزرقاء أو غمس الشرائح في 1xPBS.
طبق تلطيخ كوبلين ل 10 شرائح ، مع غطاء زجاجي أرضيفيشر ساينتفيك08-815يحمل ما يصل إلى 10 قياسي 3 × 1 بوصة. (75 × 25 مم) تنزلق من الخلف إلى الخلف. استخدم أطباق منفصلة لمحلول عمل Toluidine Blue و 95٪ EtOH و 100٪ EtOH والزيلين.
الزيلين (النسيجي)فيشر ScientificX3Pبمجرد الجفاف ، يتم تنظيف الأنسجة بالزيلين.
يمكن استخدام صناديق الشرائح المجهرية ، صناديق VWR International 82003 ذات 100 مكانلتخزين ونقل الشرائح.
فيشربراند مجهر شريحة مربعفيشر العلمي22-363-400عادة ما تكون صناديق الشرائح هذه صغيرة بما يكفي لتناسب داخل التبريد.
الجلسرينسيجما ألدريتشG5516الجلسرين هو وسيلة تركيب تقليدية.
متوسط التركيب ، ريتشارد آلان ScientificVWR International4111يربط وسط التركيب بقوة الغطاء بالشريحة.
نظارات الغطاء الصغير، مستطيلة، رقم 1VWR International48393-106يتم وضع غطاء فوق الأنسجة المجففة والمنظوفة لحماية العينة.
مجهر ضوئينيكونتم إيقاف مجهر البحث الآلي المتقدم Eclipse 90i ، الذي يستخدمه مختبرنا ، واستبداله ب Eclipse Ni-E. & nbsp ؛  
محلول

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mehik, A., Leskinen, M. J., Hellstrom, P. Mechanisms of pain in chronic pelvic pain syndrome: influence of prostatic inflammation. World journal of urology. 21, 90-94 (2003).
  2. Schaeffer, A. J. Epidemiology and evaluation of chronic pelvic pain syndrome in men. International journal of antimicrobial agents. 31, Suppl 1. S108-S111 (2008).
  3. Wesselmann, U. Neurogenic inflammation and chronic pelvic pain. World journal of urology. 19, 180-185 (2001).
  4. Arnold, L. D., Bachmann, G. A., Rosen, R., Kelly, S., Rhoads, G. G. Vulvodynia: characteristics and associations with comorbidities and quality of life. Obstetrics and gynecology. 107, 617-624 (2006).
  5. Bullones Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 189, S66-S74 (2013).
  6. Warren, J. W., van de Merwe, J. P., Nickel, J. C. Interstitial cystitis/bladder pain syndrome and nonbladder syndromes: facts and hypotheses. Urology. 78, 727-732 (2011).
  7. Heim, C., Newport, D. J., Bonsall, R., Miller, A. H., Nemeroff, C. B. Altered pituitary-adrenal axis responses to provocative challenge tests in adult survivors of childhood abuse. The American journal of psychiatry. 158, 575-581 (2001).
  8. Mayson, B. E., Teichman, J. M. The relationship between sexual abuse and interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Current urology reports. 10, 441-447 (2009).
  9. Rao, U., Hammen, C., Ortiz, L. R., Chen, L. A., Poland, R. E. Effects of early and recent adverse experiences on adrenal response to psychosocial stress in depressed adolescents. Biological psychiatry. 64, 521-526 (2008).
  10. Videlock, E. J., et al. Childhood trauma is associated with hypothalamic-pituitary-adrenal axis responsiveness in irritable bowel syndrome. Gastroenterology. 137, 1954-1962 (2009).
  11. Tyrka, A. R., et al. Childhood parental loss and adult hypothalamic-pituitary-adrenal function. Biological psychiatry. 63, 1147-1154 (2008).
  12. Chitkara, D. K., van Tilburg, M. A., Blois-Martin, N., Whitehead, W. E. Early life risk factors that contribute to irritable bowel syndrome in adults: a systematic review. The American journal of gastroenterology. 103, 765-774 (2008).
  13. Jones, G. T., Power, C., Macfarlane, G. J. Adverse events in childhood and chronic widespread pain in adult life. Results from the 1958 British Birth Cohort. 143, 92-96 (2009).
  14. Peters, K. M., Killinger, K. A., Ibrahim, I. A. Childhood symptoms and events in women with interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Urology. 73, 258-262 (2009).
  15. Mahony, S. M., Hyland, N. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Maternal separation as a model of brain-gut axis dysfunction. Psychopharmacology. 214, 71-88 (2011).
  16. Pierce, A. N., Ryals, J. M., Wang, R., Christianson, J. A. Vaginal hypersensitivity and hypothalamic-pituitary-adrenal axis dysfunction as a result of neonatal maternal separation in female mice. Neuroscience. 263, 216-230 (2014).
  17. Ladd, C. O., Huot, R. L., Thrivikraman, K. V., Nemeroff, C. B., Plotsky, P. M. Long-term adaptations in glucocorticoid receptor and mineralocorticoid receptor mRNA and negative feedback on the hypothalamo-pituitary-adrenal axis following neonatal maternal separation. Biological psychiatry. 55, 367-375 (2004).
  18. Malley, D., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Neonatal maternal separation in the rat impacts on the stress responsivity of central corticotropin-releasing factor receptors in adulthood. Psychopharmacology. 214, 221-229 (2011).
  19. Chung, E. K., Zhang, X. J., Xu, H. X., Sung, J. J., Bian, Z. X. Visceral hyperalgesia induced by neonatal maternal separation is associated with nerve growth factor-mediated central neuronal plasticity in rat spinal cord. Neuroscience. 149, 685-695 (2007).
  20. Coutinho, S. V., et al. Neonatal maternal separation alters stress-induced responses to viscerosomatic nociceptive stimuli in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G307-G316 (2002).
  21. Moloney, R. D., et al. Early-life stress induces visceral hypersensitivity in mice. Neuroscience letters. 512, 99-102 (2012).
  22. Wijngaard, R. M., et al. Peripheral alpha-helical CRF (9-41) does not reverse stress-induced mast cell dependent visceral hypersensitivity in maternally separated rats. Neurogastroenterol Motil. 24, 274-282 (2012).
  23. DeBerry, J., Ness, T. J., Robbins, M. T., Randich, A. Inflammation-induced enhancement of the visceromotor reflex to urinary bladder distention: modulation by endogenous opioids and the effects of early-in-life experience with bladder inflammation. J Pain. 8, 914-923 (2007).
  24. Randich, A., Uzzell, T., DeBerry, J. J., Ness, T. J. Neonatal urinary bladder inflammation produces adult bladder hypersensitivity. J Pain. 7, 469-479 (2006).
  25. Shaffer, A. D., Ball, C. L., Robbins, M. T., Ness, T. J., Randich, A. Effects of acute adult and early-in-life bladder inflammation on bladder neuropeptides in adult female rats. BMC urology. 11, 18(2011).
  26. Pontari, M. A., Joyce, G. F., Wise, M., McNaughton-Collins, M. Urologic Diseases in America, P. Prostatitis. The Journal of urology. 177, 2050-2057 (2007).
  27. Calhoun, E. A., et al. The economic impact of chronic prostatitis. Archives of internal medicine. 164, 1231-1236 (2004).
  28. Nickel, J. C., et al. Category III chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: insights from the National Institutes of Health Chronic Prostatitis Collaborative Research Network studies. Current urology reports. 9, 320-327 (2008).
  29. Mehik, A., Hellstrom, P., Sarpola, A., Lukkarinen, O., Jarvelin, M. R. Fears, sexual disturbances and personality features in men with prostatitis: a population-based cross-sectional study in Finland. BJU international. 88, 35-38 (2001).
  30. Clemens, J. Q., Brown, S. O., Calhoun, E. A. Mental health diagnoses in patients with interstitial cystitis/painful bladder syndrome and chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: a case/control study. The Journal of urology. 180, 1378-1382 (2008).
  31. Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 182, 2123-2131 (2009).
  32. Murphy, S. F., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Immune mediators of chronic pelvic pain syndrome. Nature reviews. Urology. 11, 259-269 (2014).
  33. Parsons, C. L. The role of a leaky epithelium and potassium in the generation of bladder symptoms in interstitial cystitis/overactive bladder, urethral syndrome, prostatitis and gynaecological chronic pelvic pain. BJU international. 107, 370-375 (2011).
  34. Done, J. D., Rudick, C. N., Quick, M. L., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Role of mast cells in male chronic pelvic pain. The Journal of urology. 187, 1473-1482 (2012).
  35. Roman, K., Done, J. D., Schaeffer, A. J., Murphy, S. F., Thumbikat, P. Tryptase-PAR2 axis in experimental autoimmune prostatitis, a model for chronic pelvic pain syndrome. Pain. 155, 1328-1338 (2014).
  36. Donadio, A. C., Depiante-Depaoli, M. Inflammatory cells and MHC class II antigens expression in prostate during time-course experimental autoimmune prostatitis development. Clinical immunology and immunopathology. 85, 158-165 (1997).
  37. Keetch, D. W., Humphrey, P., Ratliff, T. L. Development of a mouse model for nonbacterial prostatitis. The Journal of urology. 152, 247-250 (1994).
  38. Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP). Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).
  39. Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).
  40. Rivero, V. E., Iribarren, P., Riera, C. M. Mast cells in accessory glands of experimentally induced prostatitis in male Wistar rats. Clinical immunology and immunopathology. 74, 236-242 (1995).
  41. Hu, J. C., Link, C. L., McNaughton-Collins, M., Barry, M. J., McKinlay, J. B. The association of abuse and symptoms suggestive of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: results from the Boston Area Community Health survey. Journal of general internal. 22, 1532-1537 (2007).
  42. Riegel, B., et al. Assessing psychological factors, social aspects and psychiatric co-morbidity associated with Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome (CP/CPPS) in men - A systematic review. Journal of psychosomatic research. 77, 333-350 (2014).
  43. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).
  44. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. Journal of visualized experiments : JoVE. , e3791(2012).
  45. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  46. Martinov, T., Mack, M., Sykes, A., Chatterjea, D. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51212(2013).
  47. Lutgendorf, S. K., et al. Diurnal cortisol variations and symptoms in patients with interstitial cystitis. The Journal of urology. 167, 1338-1343 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة