مقالة منهجية

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

DOI:

10.3791/53183

⸱

نوفمبر 30, 2015

 ,  ,  , 
1Program in Genetics & Genome Biology, The Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics, The University of Toronto, 3Program in Genomics of Differentiation, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, 4Departments of Pediatrics and Neurology, University of Michigan

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، نصف طريقة مباشرة لإجراء تحليل Evans Blue Dye (EBD) على يرقات سمك الزرد. هذه التقنية هي أداة قوية لتوصيف سلامة العضلات الهيكلية وتحديد نماذج أسماك الزرد للحثل العضلي ، وهي طريقة قيمة لتطوير علاجات جديدة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نموذج الزرد هو نظام ناشئ لدراسة الاضطرابات العصبية العضلية. في دراسة الأمراض العصبية العضلية ، تعد سلامة الغشاء العضلي محددا حاسما للمرض. حتى الآن ، تعرض العديد من الحالات العصبية العضلية ألياف عضلية متدهورة مع سلامة غشاء غير طبيعية. ويلاحظ هذا بشكل شائع في ضمور العضلات. صبغة إيفانز الزرقاء (EBD) هي صبغة حيوية قابلة للاختراق للخلايا يتم أخذها بسرعة في خلايا متدهورة أو تالفة أو موت الخلايا المبرمج. في المقابل ، لا تمتصه الخلايا ذات الغشاء السليم. يستخدم حقن EBD بشكل شائع للتأكد من سلامة العضلات في نماذج الفئران للأمراض العصبية والعضلية. ومع ذلك ، تتطلب تجارب EBD هذه تشريح العضلات و / أو التقسيم قبل التحليل. في المقابل ، يتم تصور امتصاص EBD في أسماك الزرد في مستحضرات حية سليمة. هنا ، نوضح منهجية بسيطة ومباشرة لإجراء حقن EBD وتحليلها في أسماك الزرد الحية. بالإضافة إلى ذلك ، نظهر استراتيجية الحقن المشترك لزيادة فعالية تحليل EBD. بشكل عام ، تقدم مقالة الفيديو هذه مخططا لإجراء حقن EBD وتوصيفه في نماذج أسماك الزرد للأمراض العصبية العضلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
تشكل الحثل العضلي < p class = 'jove_content'> مجموعة من أمراض العضلات البشرية المنتشرة وغير المتجانسة ذات السمات النسيجية المرضيةالمحددة 1،2. تشمل الأعراض المرتبطة عادة بهذه المجموعة المدمرة من الأمراض ضعف العضلات وتنكس العضلات وفقدان الحركة والوفيات المبكرة1،3. الآليات المرضية الأولية للضمور العضلي هي فقدان البروتينات التي تعمل على استقرار الساركوليما ، ومجمعات الغشاء المرساة ، والتوسط في إشارات الخلية عبر الغشاء4-6. على سبيل المثال ، يؤدي الفقدان الكامل لبروتين الديستروفين ، وهو بروتين سقالة أولي لمركب الديستروفين والبروتين السكري ، إلى زعزعة استقرار الغشاء العضلي في ضمور العضلات الدوشيني7. نظرا لحقيقة أن معظم ضمور العضلات ينتج عن طفرات في البروتينات التي تشارك في الارتباط بين المصفوفة خارج الخلية والهيكل الخلوي الساركولي ، فإن الملاحظة الشائعة على المستوى الخلوي هي فقدان السلامة العجزية8،9. هذا الفهم للآلية المرضية الأولية المرتبطة بالحثل العضلي هو نتاج سنوات عديدة من البحث باستخدام أنظمة النماذج الحيوانية2،10-15. ومع ذلك ، على الرغم من التقدم في هذا المجال ، لا تزال هناك خيارات علاجية محدودة لعلاج أو إدارة مجموعة من الأنواع الفرعية للحثل. يرجع هذا التقييد للعلاجات القابلة للتطبيق إلى عدة عوامل رئيسية: 1) صعوبة استراتيجيات العلاج الجيني ، 2) التكرار العالي لحالات مرض de-novo والافتقار المقابل إلى نماذج حيوانية قابلة للترجمة ، و 3) الافتقار إلى استراتيجيات صارمة لاختبار العواقب الفسيولوجية للعوامل العلاجية المفترضة مع مقاييس نتائج واضحة وقابلة للتكرار.

للتغلب على بعض هذه القيود ، تستخدم العديد من المختبرات بما في ذلك مختبراتنا سمك الزرد كنظام لنمذجة ودراسة الأمراض العصبية العضلية البشرية2. حتى الآن ، أثبتت أسماك الزرد أنها أداة قيمة في أبحاث الأمراض. تم استخدام نموذج أسماك الزرد لتحديد الطفرات المسببة للأمراض البشرية الجديدة والتحققمن صحتها 16،17 ، وتوضيح آليات التسبب في الأمراض غير المميزة17،18 ، وتحديد الاستراتيجيات العلاجية الجديدة12،19. تم تحقيق هذه التطورات ، جزئيا ، من خلال نقاط القوة الكنسية لنظام أسماك الزرد مثل وضوحها البصري ، وسهولة التلاعب الجيني ، والقدرة على التكاثر بأعداد كبيرة20. بالإضافة إلى ذلك ، أثبتت أسماك الزرد أنها قابلة للتعديل لشاشات الأدوية واسعة النطاق21 ، وهي طريقة قيمة لتحديد العلاجات الجديدة22-24. فيما يتعلق بأبحاث أمراض العضلات ، يتم استكمال نقاط القوة هذه بالقدرة على عزل ألياف العضلات الهيكلية لأسماك الزرد المفردة عن طريق التفكك25 والقدرة على فحص تنظيم الألياف العضلية في الجسم الحي باستخدام ظاهرة بصرية تسمى الانكسارالثنائي 26 ، والتي تسمح مجتمعة بالتحديد السريع لسلامة العضلات عيانية. بغض النظر عن هذه المرافق المتاحة ، هناك حاجة مستمرة إلى مزيد من تطوير الأدوات لتعزيز التحقيق.

قمنا نحن وآخرون بتكييف بروتوكول لحقن EBD وتحليله في نموذج أسماك الزرد. EBD هي صبغة حيوية نفاذة للخلايا تمتصها الخلايا التالفة أو المتدهورة أو الخلايا المبرمجة ثم يتم تصورها تحت التألق27. حتى الآن ، تم استخدام تحليل EBD على نطاق واسع لتحليل سلامة غشاء العضلات في نماذج الفئران لأمراض العضلات والهيكل العظميوالقلب 8،9،27. ومع ذلك ، في مستحضرات الثدييات ، تتطلب العضلات المحصودة عادة تقسيما شاقا أو تشريحا قبل التحليل. في أسماك الزرد ، يمكن التحليل المباشر بأعداد كبيرة باستخدام الحية والسليمة. في مقالة الفيديو هذه ، سنوضح منهجية إجراء حقن وتحليل EBD في يرقات الزرد الحية ، مع صور تمثيلية لامتصاص EBD في الخط المتحور لضمور الزرد sapje15،28. علاوة على ذلك ، نقدم استراتيجية الحقن المشترك التي تسمح بزيادة القياس الكمي لمستحضرات EBD.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد لوحات أجار حقن (الوقت: 45 دقيقة)

  1. تغلي 2٪ إلى 3٪ الاغاروز في وسائل الإعلام E3 والسماح حل لتبرد قليلا على مقاعد البدلاء. ملاحظة: عدد من لوحات حقن يجري إعداد يملي كمية الاغاروز المطلوبة. كل لوحة حقن تحتاج حوالي 35 مل من محلول الاغاروز.
  2. بعد الغليان، والسماح للالاغاروز لتبرد حتى يتم التوصل إلى درجة الحرارة المطلوبة (على سبيل المثال، 45 ° C) حسب تعليمات الشركة المصنعة للحقن القالب و.
  3. صب حوالي 35 مل من تبريد الاغاروز في صحن 100 ملم.
  4. وضع واحدة من نهاية يفضل حقن القالب إلى الحل، ثم وضع ما تبقى من العفن على حل الاغاروز (وهذا سوف يساعد على التقليل من حدوث فقاعات الهواء).
  5. يسمح الحل الاغاروز ليصلب إما في RT أو 4 درجات مئوية لمدة حوالي 30 دقيقة.
  6. استخدام ملعقة لفصل واحدة من نهاية العفن من الاغاروز صلبة. إزالة ببطء ما تبقى من م قديم.

2. إعداد ايفانز الأزرق صبغ (EBD) حقن مزيج (الوقت: 30 دقيقة)

  1. جعل الأسهم 1٪ من EBD في حل 1X رينغر (155 ملي كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 2 ملي CaCl 2، 1 ملم MgCl 2، 2 ملي نا 2 هبو 4 و 10 ملي HEPES و 10 ملي الجلوكوز، ودرجة الحموضة 7.2)، والتي يمكن تخزينها في RT.
  2. جعل حل الأسهم من ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) -dextran MW 10000 كيلو دالتون في 25 ملغ / مل في حل 1X قارع الأجراس وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  3. إعداد حقن مزيج من قبل تمييع EBD إلى 0.1٪ بشكل مباشر في حل سهم من الأسهم FITC-ديكستران (أي لحجم العمل النهائي من 100 ميكرولتر: مزيج 10 ميكرولتر من 1٪ EBD في 90 ميكرولتر من الأسهم ديكستران FITC).
  4. تماما مزيج حقن دوامة (يجب أن يتحول إلى اللون الأخضر) والابتعاد عن الضوء المباشر عن طريق لف حقن مزيج أنبوب في رقائق الألومنيوم.

3. EBD حقن إعداد (الوقت: حوالي 30 دقيقة)

والأنف والحنجرة "> ملاحظة: بروتوكول يعمل بشكل أفضل مع يرقات 3-7 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية).

  1. لوحة حقن ما قبل الحارة لRT.
  2. إعداد جهاز الحقن عن طريق ترتيب micromanipulator على لوحة معدنية والوقوف بجانب المجهر المستخدمة للحقن. بدوره على الهواء مدفوعة تحكم microinjection. ملاحظة: إن نظام حقن فضل تختلف من مختبر ويجب أن لا تتغير نتيجة التحليل.
  3. مرة أخرى ملء حقن إبرة مع ما يقرب من 2-4 ميكرولتر من EBD المزيج.
  4. معايرة حجم الحقن إلى ما يقرب من 5 NL من EBD المزيج. ملاحظة: سوف حقن حجم المعايرة يعتمد على طريقة المعايرة. A حقن مكبس مدفوعة يمكن تعيين مباشرة إلى وحدة تخزين حقنة تعطى عن طريق الحقن في حين ضغط الغاز ستحتاج حجم الحقن معايرة عبر حجم بلعة مع استخدام ميكرومتر.
  5. لوحة حقن الرطب مع حل 1X قارع الأجراس وإزالة الزائدة من الآبار.
  6. قبل علاج اليرقات مع 0.04٪ إيثيل 3-أمينوبنزوات methanesulfonate ش.م.لر (تريكين) المخفف في حل 1X رينغر لشل حركة اليرقات قبل بدء الحقن. ملاحظة: ضمان اليرقات هي immotile تماما لا يقل أهمية عن حقن الصحيح هو صعب مع أي حركة المتبقية.
  7. وضع اليرقات مخدرة في الآبار لوحات حقن أجار باستخدام ماصة الزجاج. تأكد من أن اليرقات تماما داخل البئر والكذب على جانبهم. ملاحظة: عدد يرقات لكل بئر هو ما يصل الى المجرب.
  8. بعد أن يتم وضع اليرقات في الآبار، وإزالة الزائدة حل رينغر للحد من حركة اليرقات داخل البئر. ترك المبلغ المتبقي من الحل بحيث اليرقات لا يذوى.

4. حقن بيريكارديال من اسماك الزرد اليرقات مع EBD (الوقت: تعتمد على عدد من اليرقات عن طريق الحقن، ويقدر 03/01 ساعة)

  1. وضع لوحة الحقن التي تحتوي على يرقات على نطاق تشريح حيث سيتم إجراء الحقن.
  2. ضع إبرة الحقن التي تحتوي على ماصةوEBD خلط أكثر من اليرقات الزرد.
  3. إعادة وضع لوحة حقن عن طريق تناوب عليه حتى إبرة الحقن بالقرب من القلب اليرقات وحوالي 45 درجة من الناحية البطنية من المحور الأمامي الخلفي.
  4. إدراج إبرة حقن في الوريد الكاردينال المشتركة (لجنة تنسيق المفردات) في منطقة الوريد في الجزء الأمامي من صفار حيث الوريد وانتقل في البداية في الاتجاه الظهري (الشكل 1). ملاحظة: التكبير حتى 40X من قد يكون من المفيد أن نرى بوضوح لجنة تنسيق المفردات.
  5. ضخ 5 NL من EBD مزيج والحفاظ على حقن إبرة في المنصب لمدة 5-8 ثانية للحد من التسرب المباشر للEBD المزيج. ملاحظة: سوف حقن الجيد يجب أن يكون صبغ تلوين ينظر في حجرات القلب (الشكل 1). إن لم يكن لوحظ EBD المزيج في القلب، ثم عن طريق الحقن في 5 NL إضافية من EBD المزيج قد تكون كافية لإحداث امتصاص الصبغة. بدلا من ذلك، يمكن التخلص منها الجنين.
    ملاحظة: في بعض الحالات، قد قلب توقف الضرب. إذا كانت هذه سccurs، مواصلة رصد اليرقات 20-40 ثانية. عادة، والقلب يستأنف الضرب كما يتحرك الصبغة عن طريق الدورة الدموية.
  6. الانتقال إلى اليرقات وتكرار القادمة.
  7. تحديد الأجنة المحقونة بنجاح من خلال مراقبة وجود FITC-ديكستران في الأوعية الدموية فورا بعد الحقن (الشكل 2).

5. الحضانة وEBD امتصاص (الوقت: 4-6 ساعة)

  1. بعد حقن العدد المرغوب فيه من اليرقات، وضخت عودة اليرقات إلى حل 1X قارع الأجراس دون تريكين في 100 ملم الأطباق.
  2. الحفاظ أطباق ملفوفة في رقائق الألومنيوم. ملاحظة: حفظ اليرقات حقن في الظلام يزيد بشكل كبير معدلات البقاء على قيد الحياة ويضمن أكبر من الاتساق في قوة الإشارة. التفاف في رقائق الألومنيوم أهمية خاصة لفترة من الزمن أن اليرقات خارج الحاضنة.
  3. السماح اليرقات لاحتضان في 28.5 درجة مئوية لمدة 4-6 ساعة لضمان امتصاص EBD كافية.

    4. 6. تصور EBD في العضلات (الوقت: تعتمد على عدد من الحقن اليرقات ونوع المجهر، ويقدر 0.5-3 ساعة)

    1. قبل التصوير، تخدير اليرقات مع 0.04٪ تريكين لمنع الحركة.
    2. مشاهدة اليرقات تحت مضان أحمر لتحديد ما إذا EBD امتصاص يحدث في العضلات والهيكل العظمي (الشكل 3).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم حقن حقن مزيج EBD إلى لجنة تنسيق المفردات من المسوخ متماثل sapje والبرية من نوع الأشقاء في 3 DPF. الحقن التي تملأ حجرات القلب (الشكل 1B) ثم تم تحليل للحقن ناجحة من خلال وضع تصور-FITC ديكستران في الأوعية الدموية تحت مخضر (الشكل 2).

بعد فترة حضانة 4 ساعة، تم فحص EBD امتصاص على مستوى أجسودي باستخدام المجهر مضان. أظهرت الأشقاء نوع البرية لا مضان EBD في أي ألياف العضلات مرئية (الشكل 3A)، في حين أظهرت المسوخ متماثل sapje EBD امتصاص، مشيرا إلى الأضرار التي لحقت غشاء العضلات 15 (الشكل 3B).

figure-results-1
الشكل 1. حقن EBD حقن المزيج في الوريد الكاردينال المشتركة (لجنة تنسيق المفردات) لامبري الزردس. (A) Uninjected الجنين. السهم يدل على المكان المثالي لحقن CCV. (B) حقن الناجح إلى لجنة تنسيق المفردات. الصبغة يدخل حجرات القلب (السهم) ويبدأ في ضخ من خلال الأوعية الدموية. (C) وحقنة CCV ناجحة تؤدي في بعض أو كل الصبغة دخول الكيس المحي من الجنين (السهم). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. الأجنة يمكن فرز للحقن ناجحة من خلال مراقبة توزيع FITC ديكستران تحت مخضر في جميع أنحاء الأوعية الدموية بعد الحقن وقبل EBD امتصاص فورا.الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الرقم 3: سوف تتخذ EBD بنسبة الألياف مع الأغشية التالفة الأشقاء (A) Wildtype تظهر أي مضان EBD في الألياف العضلية. (B) Sapje ​​متحولة متماثل مع مضان EBD داخل الألياف العضلية متعددة (السهام). تم حقن جميع اليرقات مع حقن مزيج EBD وتحليلها بعد فترة حضانة 4 ساعة على 3 DPF. تم فرز الأشقاء والمسوخ التي كتبها الألياف العضلية مفرزة قبل حقن CCV. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الزرد آخذة في الظهور بوصفه أداة قوية لدراسة 2،29 الأمراض العصبية والعضلية. حتى الآن، تم استخدام نظام الزرد للتحقق من صحة العضلات جديدة المسببة للأمراض الطفرات 16،17،30، توضيح pathomechanisms رواية 18، وتحديد العقاقير العلاجية جديدة محتملة 12،24. وقد أنشأت هذه الجهود الجماعية للفائدة الزرد لنموذج الأمراض العصبية والعضلية الإنسان. ومع ذلك، على الرغم من التقدم المحرز مع نماذج الزرد والثدييات، وهناك خيارات العلاج محدودة للمرضى داخل مجموعة واسعة من الحالات العصبية والعضلية. وبالتالي، وجود ارتفاع الطلب على تطوير علاج لهذه المجموعة من الأمراض المدمرة. في موازاة هذا الطلب على العلاجات غير يقابل ذلك من ضرورة الابتكار التجريبي المستمر، فضلا عن تحليل دقيق للتحقق من نماذج حيوانية جديدة واستراتيجيات علاجية المفترضة.

ويستخدم تحليل EBD عادة في نماذج الماوس لالأنسجة الدراسة وتلف الخلايا في الدماغ والقلب والعضلات والهيكل العظمي 27،31. وأبرزها، ويستخدم على نطاق واسع في EBD نماذج الماوس من مختلف الأنواع الفرعية ضمور العضلات لإظهار شدة العضلات عدم الاستقرار الغشاء وتلف 8. استخدام EBD للكشف عن الأضرار غشاء العضلات معلمة داعمة إنشاء التشابه بين النموذج الحيواني للدولة مرض الإنسان 9. قوة EBD في الماوس أدى عدة مختبرات، بما في ذلك منطقتنا، لتطوير وتطبيق EBD لنماذج الزرد من الأمراض العصبية والعضلية. نظرا لانطباق تحليل EBD، بنشاط يجري تنفيذها هذه التقنية لإثبات نماذج الزرد إلى حالة مرض الإنسان 11،15،22،24،32. واليرقات مع أغشية العضلات التالفة يكون EBD امتصاص وبالتالي مضان أحمر داخل الألياف العضلية. مضان لوحظ في الفضاء بين الألياف، ولكن ليس ضمن ألياف العضلات الفردية قد تكون أيضا مفيدة من الألياف فصل من الغشاء القاعدي في تيكان غياب الضرر الغشاء، وتوفير التفاصيل التشخيص مفيدة. تحليل EBD لديه إمكانية تطبيق ما بعد التحقق من صحة النموذج الحيواني. وقد أظهرت الجهود من مختبرنا مؤخرا أن تحليل EBD هو مفيد في التحقق من صحة الأدوية العلاجية قد تكون رواية 24. تحديد ما إذا كانت العلاجات المحتملة تقلل أو تلغي EBD امتصاص في نماذج الأمراض العصبية والعضلية يمكن أن تدل على العمل العلاجي المناسب 8. هذا النوع من التحليل يمكن أن تساعد في إنشاء آلية (ق) من العلاجات ويوسع تطبيق تحليل EBD.

كما هو الحال مع العديد من التقنيات، وتحليل EBD لديه العديد من المحاذير التي يجب مراعاتها أثناء التصميم والممارسة التجريبية. على سبيل المثال، يمكن أن يكون تحديا لتحديد لجنة تنسيق المفردات نظرا لسماكة الأنسجة مع التقدم في السن. بالإضافة إلى ذلك، فمن السهل أن تتلف اليرقات في إعداد قبل وأثناء الحقن التامور، والحد من التهم التجريبية وزيادة الحاجة إلى الإعدادية أعداد كبيرة من اليرقات.وعلاوة على ذلك، يمكن أن الأضرار المادية التي لحقت اليرقات أثناء المناولة والحقن يؤدي إلى ايجابيات كاذبة عن العضلات التالفة يمكن أن يستغرق فترة تصل EBD. من أجل التغلب على بعض هذه العقبات، التي وصفناها استراتيجية الحقن المشترك في هذه المقالة الفيديو التي تسمح سهولة تحديد وموثوق بها اليرقات مع نجاح ضخ صبغة مباشرة بعد الحقن وقبل تحليل لاحقة. ضوابط شارك في حقن FITC-ديكستران لنجاح الحقن عن طريق السماح للتأكيد EBD في الأوعية الدموية قبل امتصاص عن طريق الألياف العضلية. هذا يمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص حيث يصبح EBD مضان منتشر بشكل كبير في اليرقات بعد عدة ساعات إذا لم تجمع في الألياف العضلية. على هذا النحو، يمكن أن يكون من الصعب الكشف عنها. وبالإضافة إلى ذلك، في عداد المفقودين لجنة تنسيق المفردات وحقن EBD في صفار البيض أو تجويف الجسم يمكن، بعد الحضانة، يؤدي في مضان أحمر منتشر مماثل للسيطرة على الأجنة، ولكن مع احتمال انخفاض امتصاص الألياف العضلية التالفة. بشكل جماعي، هذه المغارةATS تشير حقن EBD يتطلب الصبر والممارسة من أجل تحقيق نتائج متسقة وموثوق بها.

في كل شيء، ونحن تصف طريقة عملية واضحة لإجراء تحليل EBD على يرقات الزرد. حتى الآن، واستخدام الزرد كنظام نموذج، خصوصا كنموذج الأمراض التي تصيب البشر، وقد يتوسع بسرعة. ومن المقرر جزئيا إلى استمرار تطوير وتعديل التقنيات التجريبية التي تعمل على تحسين بناء على المزايا الحالية للنظام الزرد هذا التوسع. توفر تقنية الحقن EBD أداة إضافية وقوية لترسانة الباحث للتحقق من صحة ودراسة نماذج أمراض العضلات الزرد. التنفيذ المستمر وتعديل هذه التقنية لديه القدرة التي تساعد في الكشف استراتيجيات علاجية جديدة وكذلك آليات المسببة للأمراض.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة أو الصراعات الأخرى ذات الاهتمام.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونود أن نشكر ترينت وو للحصول على المساعدة الفنية له. علينا أيضا أن نعترف قسم طب الأطفال في مستشفى الأطفال المرضى وعلاج الخلقي ضمور العضلات (CMD) للحصول على التمويل السخي لهذا المشروع.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الفلورسين إيزوثيوسيانات ديكستران MW 10،000SigmaFD10S
Evean Blue DyeSigmaE2129
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate ملحSigmaA5040
100 مم طبق بتريFischerbrandFB0875712قاعدة قالب الحقن
الشعيرات الدموية الزجاجيةالجدارأدوات الدقة العالميةTW100F-4لإبرة الحقن
AgaroseBioshopAGA001قالب الحقن
أدوات العلوم التكيفيةTU-1قالب الحقن
كلوريد الصوديومBioshopSOD001محلول Ringer
كلوريد البوتاسيومBioshopPOC888محلول Ringer
كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدراتمحلول SigmaM2670Ringer
أحادي الهيدرات أحادي القاعدةSigmaS9638محلول Ringer
HEPESSigmaH4034محلول Ringer
GlucoseBioBasicGB0219محلول Ringer
كلوريد الكالسيومSigmaC1061Ringer
رقيقة الدقيق

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community. Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).
  2. Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies). FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).
  3. Lancet, , 381-845 (2013).
  4. Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).
  5. Campbell, K. P., Kahl, S. D. Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein. Nature. 338, 259-262 (1989).
  6. Cohn, R. D., Campbell, K. P. Molecular basis of muscular dystrophies. Muscle Nerve. 23, 1456-1471 (2000).
  7. Yoshida, M., Ozawa, E. Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma. J Biochem. 108, 748-752 (1990).
  8. Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).
  9. Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle. J Biochem. 118, 959-964 (1995).
  10. Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).
  11. Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).
  12. Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).
  13. Guyon, J. R., et al. Modeling human muscle disease in zebrafish. Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).
  14. Cavanna, J. S., et al. Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus. Genomics. 3, 337-341 (1988).
  15. Bassett, D. I., et al. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
  16. Horstick, E. J., et al. Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy. Nat Commun. 4, (1952).
  17. Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
  18. Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
  19. Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
  20. Detrich, H. W., Westerfield 3rd,, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
  21. Whitfield, T. T., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral. , 123-241 (1996).
  22. Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).
  23. Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, (2013).
  24. Waugh, T. A., et al. Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 Forthcoming.
  25. Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations. J Vis Exp. 50259, (2013).
  26. Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. 50925, (2013).
  27. Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
  28. Guyon, J. R., et al. Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin. Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).
  29. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  30. Majczenko, K., et al. Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores. Am J Hum. , (2012).
  31. Wooddell, C. I., et al. Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice. Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).
  32. Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة