دراسة رياضيات الكيمياء من البشرة عامل نمو مستقبلات في الخلايا السليمة باستخدام الميكروسكوب المتلازم

كما تم تقديم نهج جديد في الآونة الأخيرة، إلى صورة خلايا كاملة مع البروتينات وصفت في الحالة السائلة باستخدام STEM ^1-3، أو المتلازم المجهري مضان وSTEM ^4-7. هذه المنهجية هي القادرة على دراسة التوزيع المكاني للبروتينات الغشاء والمجمعات البروتين بما في ذلك رياضيات الكيمياء على مستوى جزيء واحد في أغشية البلازما سليمة من الخلايا بأكملها. هنا، نحن تصف بروتوكول تنطوي على وضع العلامات المحددة من خطوتين من البروتينات المستقبلة مع نقاط الكم الفلورسنت (QDS) ^8، والمتلازم المجهر الضوئي وESEM-STEM. وكمثال، درسنا EGFR، وهو بروتين الغشاء الذي ينتمي إلى الفصيلة بروتين كيناز. على يجند ملزمة، ومستقبلات ينشط ثم يشكل ديمر مع آخر EGFR المنشط؛ شلال إشارة لاحقة محركات تكاثر الخلايا ^9. الطفرات غير طبيعي مما يؤدي إلى التعبير EGFR أو النشاط تلعب دورا مركزيا في أنواع عديدة من السرطان ^10. ادرس فيز الترتيب المكاني لهذه المستقبلات في خلايا الغشاء كله يوفر معلومات سياق مهمة عن وظيفتها والتغييرات المحتملة منها ^11-14. ولكنها لا تزال صعبة للتحقيق في توزيع أحادية EGFR، dimers، ومجموعات مباشرة على (شبه) المستوى الخلوي مع أساليب الفحص المجهري biochemical- أو التقليدية ^15. أسلوبنا هو قادر على تصور EGFRs مع قرار المكاني لبضعة نانومتر هذه أن مواقع البروتينات في مجمع يمكن تحديدها. الأهم من ذلك، فإن المعلومات التي تم الحصول عليها عن توزيع القياس المتكافئ تتعلق بالوضع الأصلي من البروتين في الخلية سليمة.

من أجل تحقيق مسافة قصيرة بين التسمية والمستقبلة، وEGFR المسمى مباشرة عبر EGF يجند لها، وذلك باستخدام السندات البيوتين streptavidin إلى QD. ويمكن الكشف عن هذه التسمية على حد سواء مع المجهر fluorescence- والإلكترون. وقد استخدمنا هذه التسمية للتصوير المتلازم الخلايا COS7 فيالسائل المغلقة في غرفة ميكروفلويديك سابقا ^1،16،17. ومع ذلك، وعلى حساب من مضاعفات streptavidin الجزيئات في QD، هذه التسمية قد تحفز مستقبلات المجموعات، مما يؤدي إلى كفاءة وضع العلامات المنخفضة أو تجارب مكلفة نوعا ما، وأنه من غير الممكن التوصل إلى نتيجة بشأن رياضيات الكيمياء من البروتين قيد التحقيق. ويمكن تجنب التسمية التي يسببها تجمع مستقبلات تماما عن طريق استخدام إجراءات وضع العلامات من خطوتين المعروضة هنا، مما أدى إلى تحقيق تضم EGF المعقدة البيروكسيديز التي يقترن واحد فقط، streptavidin الكم نقطة (STR-QD). يتم تحضين الخلايا لأول مرة مع EGF المعقدة البيروكسيديز، ثم الثابتة. الخطوة تثبيت تحدد النقطة الوقت الذي توقفت عمليات البروتين (اعتمادا على سرعة التثبيت). يتم تطبيق STR-QD بعد ذلك كخطوة الثانية من بروتوكول وضع العلامات. التكتل لا يحدث منذ ديناميكية الحركة غشاء من البروتينات ما يعوق مرة واحدة يتم إصلاح البروتينات. وعلاوة على ذلك، فإن الحل STR-QD، الذي هومعظم مكونات مكلفة من التجربة، ويمكن تطبيقها في تركيز منخفض الأمثل، وهذه الخطوة الثانية من وضع العلامات ليست-وقت حاسم، أي QD يمكن أن تقترن في عدة دقائق.

لدراسة رياضيات الكيمياء من EGFR كما وزعت في الخلايا بأكملها، وكانت العينات الخلوية مستعدة على رقائق السليكون ^18. بعد تطبيق العلامات QD من خطوتين، وتسجيل الصور مضان المجهر، وتشطف الخلايا مع الماء النقي، وتصويرها في دولة المائية باستخدام ESEM-STEM ^19. توفر الصور المترابطة الناتجة المعلومات حول توزيع EGFR الخلوي، ورياضيات الكيمياء في السياق الطبيعي في الخلايا المائية. تم استخدام طريقة مماثلة لدراسة البروتينات HER2 في خلايا سرطان الثدي في دراسة حديثة ^7.

1. إعداد وصفها والتثبيت الكواشف

1. إعداد العازلة الترقيم (BSA-GEL-PBS) باستخدام الفوسفات تعقيمها المالحة، ودرجة الحموضة 7.4 (PBS). الملحق مع 1٪ BSA (الزلال البقري جزء V، خالية من البيوتين) و 0.2٪ الجيلاتين (GEL، من جلد أسماك المياه الباردة) ودوامة / يهز جيدا.
   ملاحظة: يمكن تخزينها ل~ 5 أيام في 4 درجات مئوية.
2. إعداد غسل العازلة (BSA-PBS) من الفوسفات تعقيمها المالحة، ودرجة الحموضة 7.4. الملحق مع 1٪ BSA ودوامة / يهز جيدا. ملاحظة: يمكن تخزينها ل~ 5 أيام في 4 درجات مئوية.
3. تجهيز 50 ملي العازلة بورات (BB) من 200 ملي البوريك الحل الأسهم الحمضية، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 8.3 مع 200 ملي tetraborate الصوديوم. ملاحظة: يمكن تخزينها ل~ 12 شهرا عند 4 درجات مئوية.
4. إعداد 0.1 M كاكوديلات العازلة (CB) من 0.2 M الصوديوم محلول المخزون كاكوديلات، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 7.4، على أن تستكمل مع 0.1 M السكروز.
   ملاحظة: يمكن تخزين محلول المخزون فتح باب ~ 5 أيام في 4 درجات مئوية.
5. إعداد 0.1 M الجلايسين في برنامج تلفزيوني (GLY-PBS).
   ملاحظة: يمكن تخزينها ل~ 2 أشهر في 4 درجات مئوية.
6. إعداد 3٪ امتصاص العرق في CB (3٪ PFA) من تقدم طازجة أو فتح قنينة من 16٪ PFA، حل سهم، EM الصف.
   ملاحظة: يمكن تخزين محلول المخزون فتح باب ~ 5 أيام في 4 درجات مئوية.
7. إعداد 2٪ غلوتارالدهيد في CB (2٪ GA) من تقدم طازجة (أو فتح قنينة) 25٪ GA حل سهم، EM الصف.
   ملاحظة: يمكن تخزين محلول المخزون فتح باب ~ 5 أيام في 4 درجات مئوية.
8. إعداد حل التوسيم 300 نانومتر EGF-البيوتين
   1. تمييع 6 ميكرومتر-EGF البيوتين حل الأسهم في BSA-GEL-PBS، استخدم حجم 100-200 ميكرولتر في رقاقة. استخدام في غضون بضع ساعة.
9. إعداد 10 نانومتر STR-QD حل الوسم
   1. أجهزة الطرد المركزي محلول المخزون streptavidin-QD لمدة 4 دقائق في 8000 x ج، واتخاذ طاف وتمييع 01:10 في BB. أنواع مختلفة من QDS يمكن استخدامها، على سبيل المثال، QD655، أو QD800. تمييع لتركيز النهائي في BSA-GEL-PBS، استخدام 75-100 ميكرولتر في رقاقة. استخدام داخلبضع ساعة.

2. إعداد السيليكون نتريد غشاء الرقائق

1. تنظيف شريحة زجاجية المجهر، كما تستخدم لالمجهر الضوئي، بمنديل غرفة نظيفة وعالية الأداء اللوني السائل (HPLC) الصف الايثانول.
2. في طاولة العمل الصفحي تدفق الهواء مع مستوى الغبار المنخفضة، فتح 100 مم طبق بيتري، ووضع الزجاج المجهر تنظيفها في طبق. ترك الطبق مفتوحة.
3. مع ملاقط نظيفة، المغلفة بشكل تفضيلي مع ألياف الكربون أو طلاء آخر، يستغرق 4-10 الرقائق مع رقيقة (50 نانومتر) الأغشية نيتريد السيليكون، واحدا تلو الآخر، من صندوق تخزين وعلى شريحة زجاجية. الاستيلاء على الرقائق بلطف على جنوبهم وتجنب لمس الجانب العلوي هشة، تتكون من غشاء رقيق نيتريد السيليكون. نولي اهتماما كبيرا للحفاظ دائما على الجانب غشاء حتى ولا لمسها.
   ملاحظة: يجب أن يكون الرقائق مستطيلة ولها حواف مسطحة عمودي على نيتريد السيليكون التي تغطيهاوجه، بحيث يمكن عصفت بسهولة.
4. إغلاق غطاء طبق بتري وإحضاره إلى غطاء الدخان. الحصول على الأنسجة غرفة نظيفة جديدة وايداعها بجانب طبق بتري. إعداد اثنين نظيفة 200 الأكواب الزجاجية مل عن طريق ملء واحدة مع 50-70 مل الأسيتون، والآخر مع حجم مماثل من الإيثانول، سواء من HPLC الصف. نقل الرقائق من شريحة زجاجية لأول مرة على النسيج غرفة نظيفة.
5. من الأنسجة، ونقل الرقائق واحدا تلو الآخر في الكأس الأول مع الأسيتون لإزالة مقاومة طبقة واقية. الانتظار 2 دقيقة، بينما تتحرك بلطف الكأس بضع مرات للتأكد من أن الرقائق وتشطف جيدا.
6. نقل الرقائق مباشرة في كوب مع الإيثانول، دون السماح لهم تجف. الانتظار 2 دقيقة. ثم نقل الكأس إلى طاولة العمل الصفحي تدفق الهواء. الحصول على الأنسجة غرفة نظيفة جديدة.
7. نقل رقائق على الأنسجة والسماح لهم الجافة لدقائق قليلة. نقل الرقائق على شريحة زجاجية في طبق بيتري، أغلق الطبق،وإحضاره إلى نظافة البلازما.
8. إيداع شريحة زجاجية مع الرقائق في نظافة البلازما. تشغيل برنامج التنظيف 5 دقائق لجعل سطح نيتريد السيليكون محبة للماء الغشاء.
   ملاحظة: إعدادات مناسبة تطبيقها لدينا نظافة البلازما هي: 70 mTorr، وتدفق الغاز من 11.5 SCCM لO _{2 و} 35.0 SCCM لهارون، 50 W تردد الراديو إلى الأمام (RF) هدف، 5 W نطاق الترددات اللاسلكية وماكس. ينعكس RF.
9. وضع شريحة زجاجية مع رقاقة مرة أخرى في طبق بتري، وإغلاق غطاء لها. العناية للحفاظ على الرقائق عقيمة من الآن فصاعدا.
10. دراسة المناطق نافذة الرقائق تحت المجهر الخفيف لتمزق غشاء الممكنة أو المتبقية الجسيمات الترابية.
11. جلب طبق بتري إلى طاولة العمل الصفحي تدفق الهواء.
12. وضع العناصر التالية في طاولة العمل الصفحي تدفق الهواء: أنابيب / الزجاجات التي تحتوي على تعقيم 0.01٪ بولي-L-يسين حل (. PLL، مول بالوزن 150،000-300،000، العقيمة التي تمت تصفيتها، وزراعة الخلايا اختبار)، HPLCالمياه الصف، Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل الجنين البقري، DMEM دون المصل، نسيج غرفة نظيفة جديدة، معقمة لوحة 24-جيدا (يمكن أيضا لوحة ال 12 أيضا أن تستخدم)، وهي عقيمة 96- جيدا لوحة، نصائح الماصة العقيمة، ماصة، وشقة، وطرف مستدير، ملاقط.
13. أخذ 24 لوحة جيدا، وملء واحدة بشكل جيد مع PLL، وبئرين مع HPLC المياه الصف، واستخدام تقريبا. حجم 1 مل لكل بئر. تأخذ لوحة 96-جيدا وملء كل رقاقة بئرين مع المصل تستكمل DMEM واحدة بشكل جيد مع المصل خالية DMEM، استخدم تقريبا. حجم 200 ميكرولتر لكل بئر.
14. من الآن فصاعدا استخدام الملقط مع نصائح عقيمة للتعامل مع الرقائق. تحقيق ذلك، على سبيل المثال، من خلال المشتعلة لفترة وجيزة والتبريد في وقت لاحق من على نصائح من الملقط.
15. أولا نقل الرقائق من شريحة زجاجية على النسيج غرفة نظيفة.
    من الأنسجة، ونقل ما يصل إلى ستة الرقائق في شغل PLL جيدا، واحتضان والرقائق لمدة 5 دقائق.
    ليسه: للتجربة مع المزيد من الرقائق، وملء آبار إضافية في لوحة 24-جيدا.
16. شطف في وقت لاحق الرقائق عن طريق وضعها، واحدة تلو الأخرى، في أول بئر مملوءة بالماء، وهناك من في مملوءة بالماء الثاني أيضا. لا تترك الرقائق في الماء لفترة أطول من حوالي دقيقة واحدة لتجنب إزالة PLL.
17. أخيرا وضعها بشكل فردي في الآبار DMEM مملوءة من لوحة 96-جيدا. تخزين لوحة 96-جيدا في الحاضنة CO _{2 حتى} يتم إعداد تعليق الخلية.

3. إعداد خلايا في الرقائق

1. أداء ثقافة فرعية من الخلايا COS7 لإعداد تعليق الخلية مع تركيز تقريبا. 5 × 10 ⁵ خلية / مل. تأكد من أن الخلايا هي فرقت أحادية.
2. تأخذ لوحة 96-جيدا مع الرقائق وإضافة قطرة واحدة من خلية إلى تعليق كل رقاقة. الانتظار 5 دقائق.
3. البدء في دراسة مجالات نافذة الرقائق مع مجهر مقلوب لتشوبيئة نظام التشغيل اللحظة المناسبة لنقلها إلى بئر جديدة مع المصل خالية DMEM.
   ملاحظة: يتم تحقيق كثافة جيدة من الخلايا مع خلية واحدة تقريبا في 2500 ميكرون ² منطقة الموافق 24 خلايا COS7 على حجم النافذة 150 × 400 ميكرون. كثافة الخلية أعلى لديهم مخاطر لعرقلة تسطيح القصوى من الخلايا. كن على علم أنه بعد انقشاع خلية أسفل على الغشاء SIN، فإنه يحتاج 3-5 دقيقة لوضع التصاق يكفي لمقاومة عائمة قبالة أثناء نقل إلى البئر الجديد.
4. نقل رقاقة إلى البئر المقبل عندما انضمت خلايا كافية على النافذة. الحفاظ على الرقائق دائما مع الخلايا مواجهة وتجنب أي لمس هذا الجانب.
5. بعد نقل، ودراسة كل نافذة رقاقة مرة أخرى. إذا تم غسلها العديد من الخلايا وإيقاف عدد من الخلايا المتبقية غير كافية، وإعادة يسحن تعليق خلية (لتفتيت كتل الخلايا التي شكلت حديثا)، وكرر الخطوات من 3،1-3،5.
6. عندما يكون كل الرقائق نقل كافيةالتمسك الخلايا على المناطق النافذة، ونقل رقائق في البئر الماضي مع المصل خالية DMEM. وضع لوحة 96-جيدا مرة أخرى في حاضنة CO _2، والسماح للخلايا على التعافي وحلق لعدة ساعة، وأفضل O / N.

4. EGFR وصفها، التثبيت، ومضان المجهر

1. للخطوات التالية، استخدم جيدا 96 و 24 لوحة جيدا. قبل ملء الآبار مع حلول منها، واستخدام صف واحد أو عمود في رقاقة. يتم استخدام لوحة جيدا 24- تحت غطاء الدخان للخطوات التثبيت مع CB، PFA وGA. دائما نقل الرقائق مع الخلايا مواجهة وتجنب أي لمس هذا الجانب.
2. شطف الرقائق عن طريق وضع رقائق في بئر مع الطازجة BSA-GEL-PBS، ثم وضع 96 لوحة جيدا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
3. احتضان مع 300 نيوتن متر حل EGF البيوتين لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية. لأن الخلايا ستبدأ الإلتقام من EGFRs المسمى EGF، والمضي قدما في أسرع وقت ممكن إلى STEص 4.4.
4. شطف 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، و1 مرة مع CB (الآن لوحة جيدا 96 هي مرة أخرى في RT).
5. احتضان في 3٪ PFA لمدة 10 دقيقة.
6. شطف رقائق 1 مرة مع CB، و 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
7. احتضان في الغليسين-PBS لمدة 2 دقيقة، شطف 2 مرات مع 1 مرة PBS.
8. احتضان في 10 نانومتر STR-QD لمدة 10 دقيقة.
9. شطف 4 مرات مع BSA-PBS.
10. غمر رقاقة في 35 ملم صحن زجاج القاع شغل قبل مع BSA-PBS في RT.
11. الحصول على النقيض تدخل الفرق (DIC) الصور والصور مضان من الخلايا QD المسمى.
    1. استخدام هدفا الهواء 40X للصور نظرة عامة من الخلايا المسمى مع QD655. استخدام هدفا الغمر النفط (على سبيل المثال، 63X) للسماح للجمع الأكثر كفاءة من ضوء مضان المنبعثة. هذا هو مطلوب وخصوصا عندما التصوير الخلايا المسمى مع QD800.
    2. استخدام مكعب التصفية التي تفضح QDS للضوء مضان الإثارة بين 340 و 380 نانومتر، ويسمح جمع الضوء المنبعث فوق 420 نانومتر فريدةالجدول بالنسبة لمعظم QDS (تصفية مكعب A في هذه الحالة).
    3. تقليل شدة الضوء لتجنب ضوء مكثفة جدا التي قد تضر العينة. ضبط الوقت التعرض للا يقل عن 300 ميللي ثانية، بحيث يتم التقاط الإشارات من جميع QDS، مشيرا إلى أن مضان من QDS لديه سلوك وامض.
    4. ضبط شدة الضوء، والتضخيم لتوفير صور مشرقة من دون ضجيج صورة مرئية، مع التقليل من شدة الضوء.
       ملاحظة: بدلا من ذلك، أقصر وقت التعرض يمكن أن تستخدم إذا اتخذت صورة سلسلة من نفس المنطقة. هذه السلسلة يمكن معالجتها لانتاج صورة إسقاط الحد الأقصى، مما أدى إلى المتوسط، وبالتالي الحد من الضوضاء من الصورة الناتجة.
12. وضع رقاقة تصوير الظهر (الخلايا التي تواجه متابعة) في بئر من لوحة 96-جيدا مليئة BSA-PBS.
13. شطف الرقائق 1 مرات CB.
14. احتضان في 2٪ GA لمدة 10 دقيقة.
15. شطف 1 مرة في CB، و 3 مرات مع BSA-PBS.
16. متجر الرقائق حتى ESEM طmaging، في BSA-PBS الآبار معبأة سلفا من لوحة 96 بئر جديدة. لكل رقاقة ملء صف من أربعة آبار بالماء HPLC الصف.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ العينات في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع، ومع ذلك، يتم تحقيق أفضل النتائج عند إجراء سلسلة التصوير الكامل في غضون يومين. سوف QDS تبدأ ببطء لفصل من العينة، لذلك لا ينصح أن ننتظر أكثر من 10 يوما قبل الانتهاء من التصوير ESEM.
    ملاحظة: يتم تخزين الصور مضان لتحليل المستقبل. يمكن بسهولة أن تكون مرتبطة بمواقف الخلايا في الصور مع صور المجهر الإلكتروني عن طريق إضفاء الطابع المحلي على زوايا نافذة الخطيئة وقياس الأوضاع النسبية لالزوايا.
    ملاحظة: ومن المستحسن لطباعة الصور مضان عالية الجودة واستخدامها لأغراض التوجه عند تسجيل الصور ESEM.

5. ويت ESEM-الجذعية من خلايا كامل

1. إعداد ESEM لSTEM الرطب
   1. تحميل الغازي الثانوي الإلكترون دetector (GSED)، ومرحلة بلتيير، التي تحتوي على كاشف STEM (الموجود ضمن العينة).
   2. بدء تدفق مياه التبريد من خلال المسرح، وضبط درجة الحرارة إلى 3 درجات مئوية.
   3. تعيين إحداثيات س ص المرحلة إلى الصفر، وضبط المسافة عمل لحوالي 6 مم.
2. خلال التصوير ESEM، والحفاظ على لوحة 96-جيدا مع رقائق بارد، على سبيل المثال على عناصر تبريد المجمدة، في مربع الستايروفوم.
3. لتحميل عينة في precooled مرحلة ESEM-STEM، واتخاذ لوحة 96-جيدا خارج الحاوية التبريد ووضعه بالقرب من مرحلة ESEM فتح. وضع الأنسجة غرفة نظيفة جديدة بجانبه.
4. شطف بسرعة رقاقة (مع الخلايا مواجهة) عن طريق غمس أربع مرات، في كل مرة لمدة ثانية واحدة، إلى شغل جيدا بالماء HPLC الصف.
5. وصمة عار في المؤخرة لفترة وجيزة رقاقة على النسيج غرفة نظيفة ووضع رقاقة في مرحلة precooled. تأكد من أن الخلايا لا تزال رطبة، وهذا يمكن أن يكونمعترف بها من سطح عاكس (تجفيف النتائج في سطح مملة).
6. الرطب سطح العينة مع 3 ميكرولتر من المياه المبردة HPLC الصف (تأكد من عدم لمس السطح مع طرف الماصة)، وإصلاح العينة في هذه المرحلة.
7. وضع ثلاث قطرات الماء إضافية 3 ميكرولتر على الساحة القريبة من العينة.
8. إغلاق غرفة العينة
9. تطهير غرفة العينة قبل ركوب الدراجات الضغط خمس مرات بين 800 و 1500 باسكال. وضع حد لركوب الدراجات مع 800 باسكال.
10. التبديل شعاع الالكترون (30 كيلو فولت) على وفحص العينة تحت أدنى التكبير مع كل كشف، أي GSED، وكاشف STEM للبحث عن موقع نافذة رقاقة.
    ملاحظة: إذا كانت طبقة المياه سميكا جدا، قد لا تكون نافذة مرئية. في هذه الحالة، تبدأ خفض الضغط إلى 760 باسكال وانتظر دقائق قليلة. تصبح نافذة أولا مرئية مع GSED.
11. وضع نافذة غشاء الخطيئة في وسط الصورة عن طريق تحريك specimأون المرحلة وتخفيف الضغط على 750-720 باسكال.
    ملاحظة: عندما طبقة المياه رقيقة بما فيه الكفاية، يصبح الإطار أيضا واضحة مع كاشف STEM.
12. من الآن استخدام على القطعة الحقل المظلم من كشف STEM لتسجيل الصور. أولا، الحصول على واحد أو اثنين من الصور التي تبين كل الخلايا في المنطقة نافذة كاملة.
13. مقارنة هذه الصور ESEM مع الصور المجهري الخفيفة، موقع زوايا نافذة الخطيئة.
14. ربط إطارات الطريقتين المجهر تنسيق بمقارنة التكبير، والتناوب، والنسخ المتطابق ممكن. تحديد موقع الخلايا نفسها في كلتا الصورتين.
15. تحديد جزيئات الأوساخ الصغيرة جدا أو المنطقة الخليوي مع الميزات الصغيرة لضبط إعدادات التصوير، مثل ارتفاع eucentric، والتركيز على ما يرام وتصحيح عدسة وصم. العمل في التكبير على الأقل 50.000X، واستخدام مسبار الإلكترون الحالي هو نحو 0.6 غ، وهو وقت بكسل يسكن من 30 ميكرو ثانية، وحجم الصورة 1024 × 884 بكسل.
    ملاحظة: قد الإعدادات الأخرى أيضا به استخدامها طالما يتم تجنب زيادة الجرعة الإلكترون.
    ملاحظة: حتى عند العمل نظيفة جدا، وسوف السطوح رقاقة في ممارسة تحتوي دائما بعض الجسيمات الترابية، لأنه لم يتم تنفيذ البروتوكول في بيئة غرفة نظيفة.
16. لتسجيل الصور STEM من الخلايا المسمى QD، الرجوع إلى الصور مضان واختيار خلية من الفائدة.
    ملاحظة: من الأفضل أن تبدأ مع خلية تظهر إشارات QD قوية.
17. تسجيل صورة نظرة عامة STEM من هذه الخلية.
18. انتقل إلى المنطقة المحيطة حيث الحدود خلية مرئيا والتكبير للوصول 50.000X التكبير.
19. تسجيل صور تظهر QDS الفردية، واستخدام مرات يسكن بكسل من 20-30 μsec. من أجل تجنب أضرار الإشعاع، صورة كل منطقة مرة واحدة فقط مع تضخم عالية.
    ملاحظة: عادة، في هذه المرحلة على حد سواء، والتركيز، وتصحيح وصم، تحتاج بعض التعديل على ما يرام.
20. بعد تسجيل عدد كاف من الصور عالية التكبير، والتكبير التدريجي، وميلانكراس صورة نظرة عامة STEM آخر، والتي تصور المناطق بتسجيله مع ارتفاع التكبير كما المستطيلات السوداء.
    ملاحظة: ستكون هذه الصور نظرة عامة تستخدم لاحقا لربط ESEM ومضان الصور وتحديد الموقع الدقيق للصور التكبير عالية في سياق الخلوية.
21. انتقل إلى الخلية التالية من الفائدة، وتبدأ مع صورة نظرة عامة، وتسجيل سلسلة من الصور تضخم عالية، وتنتهي مع صورة نظرة عامة.
22. في نهاية جلسة التصوير ESEM، وزيادة الضغط على 850-900 باسكال قبل البدء للتنفيس عن الغرفة.
    ملاحظة: هذه زيادة الضغط يحسن من فرصة استعادة رقاقة مع سطح يزال مبلل؛ ومع ذلك، لا يمكن أن يتحقق ذلك دائما. يمكن استعادة عينة لم يسبق أن جفت في BSA-PBS، وإذا رغبت في ذلك، إعادة التحقيق في ESEM في مرحلة لاحقة في الوقت المناسب.

الشكل 1 و 2 تظهر الصور ممثل QD655 المسمى، بغشاء EGFR تصور في حالها، COS-7 المائية بالكامل الخلايا. صورة مدينة دبي للإنترنت في الشكل 1 يعطي انطباعا تضاريس غشاء الخلايا، وصورة مضان المقابلة في الشكل 1B يصور توزيع EGFR بعد 3 دقائق من-EGF البيوتين الحضانة. 1A الشكل وB تحاك كل جانب من اثنين الصور المسجلة مع هدف الهواء 40X. يتم توزيع EGFR تنشيط EGF على سطح الخلايا بأكمله. في معظم الخلايا ويمكن رؤية زيادة طفيفة من مضان (الشكل 1B) على حواف الخلية، مما يشير إلى حدوث زيادة محليا من EGFR 20. تجارب السيطرة التي أجريت باستخدام بروتوكول مماثل التحقق منها وضع العلامات EGFR محددة (لا تظهر البيانات). وتشمل هذه الضوابط: 1) وضع العلامات السيطرة من دون الحضانة السابقة للمLLS مع EGF البيوتين، أي حضانة فقط مع STR-QDS، و 2) والحضانة مع غير المعقدة البيروكسيديز EGF وSTR-QDS.

وقد حققت في ثلاث خلايا ملحوظ مع المستطيلات مع مزيد من ESEM-STEM. الصور ESEM-STEM مبين في الشكل 1C - E تظهر لمحات عامة التكبير منخفضة من هذه الخلايا. هذه الصور تعكس انتقال الخلايا الكاملة في ولاية المائية مع طبقة رقيقة من الماء المقيمين فوق الخلية وضعت على رقاقة السيليكون مع نيتريد السيليكون (الخطيئة) نافذة عرض. تم تعديل فراغ الغرفة في المجهر الواردة بخار الماء، والتوازن بين درجة حرارة العينة والضغط للحفاظ على طبقة رقيقة من السائل على الخلايا. الخلايا الفردية يمكن التعرف بسهولة على حساب شكلها وموقعها على النافذة غشاء الخطيئة. انخفاض التكبير الصور ESEM-STEM تكشف الهياكل الدقيقة، مثل أرجل كاذبة خيطية، وتمتد من حافة الخلية نحو الخلايا المجاورة، وبعض الهياكلداخل المناطق خلية أرق. المناطق الخلوية المركزية سميكة بما في ذلك النواة تظهر بيضاء بسبب انتقال العدوى عن طريق عينة من غير الممكن للإلكترونات من الطاقة المستخدمة (30 كيلو).

وسجلت صور عالية الدقة ESEM-STEM في أرق والمناطق الطرفية. تم تحديد القرار المكانية لESEM-STEM النانوية في المناطق رقيقة من الخلايا في طبقة رقيقة سائلة في دراسة سابقة 6 لتصل إلى 3 نانومتر. أربع صور عالية الدقة هو مبين في الشكل 2A - سجلت D في مواقع مستطيلات صغيرة في الشكل 1C - E. واستخدامها والتكبير كافية لتمييز QDS الفردية، والتي تظهر، وقضبان على شكل رصاصة كما مشرق، كل ملزمة للفرد EGFR. وQD655 لها أبعاد نموذجية من 6 × 14 نانومتر 2.

الشكل 2A (المقابلة لمنطقة مستطيلة أشار على الخلية في فيقوإعادة 1C) يظهر علامات QD على غشاء أضعاف قطريا عبور الصورة. هذا الهيكل الغشاء لديها كثافة EGFR أعلى من المناطق المحيطة بها غشاء. في عدة مواقع، وكانت تسميات اثنين على مقربة. يشار إلى مثالين مع المسافات بين 20 و 24 نانومتر مع السهام. يتم تفسير هذه الأزواج من تسميات على أنها تنتمي إلى dimers EGFR. الشكل 2B يعطي مثالا من حافة الخلية (1D الشكل المستطيل الأيسر)، أحادية EGFR وdimers يمكن أن ينظر إليه كذلك. الشكل 2C (الشكل 1C، المستطيل الأيمن) وسجلت في منطقة مع إشارة مضان أقل، أي أقل كثافة EGFR. ومع ذلك، وكما وجدت EGFR هنا في dimers كذلك. بالإضافة إلى ذلك، كانت مجموعتين من 10 أو 11 EGFRs الحالية (انظر الحذف). ويبين الشكل 2D مثال آخر على أضعاف غشاء (الشكل 1E) مع كتل أصغر منها 5-6 EGFRs، بالإضافة إلى العديد من مونومراتوdimers.

وكمثال على هذا النوع من المعلومات التي يمكن الحصول عليها من هذه البيانات، الزوج ارتباط وظيفة 21 ز (خ) كان مصمما لجميع المواقف التسمية في الشكل 2. لاحظ أن هذا التحليل ليس جزءا من هذا البروتوكول ووصف الإجراء في أماكن أخرى 6،7. ز (خ) هو مقياس فرصة من الجسيمات التي يمكن العثور عليها ضمن مسافة معينة شعاعي العاشر من الجسيمات المرجعية. ز (س) = 1 يمثل التوزيع العشوائي، وقيمة أكبر هي الدليل على المجموعات. تم الكشف عن مواقف ما مجموعه 210 التسميات تلقائيا في أربع صور من الشكل 2A-D، و (ز) (س) وتحسب باستخدام حجم بن ل5 نانومتر، ومرشح تجانس مع عرض النطاق الترددي من 10 نانومتر. ز (خ) منحنى (الشكل 3) يدل على مسافة QD من 25 نانومتر المفضلة مركز إلى مركز. وهكذا يست موجهة EGFRs عشوائيا ولكن جزءا كبيرا منهم يقيم في هذه المسافة المفضلة. من approximatالبريد النموذج الجزيئي 6 (الشكل 3 الشكل) فإننا نقدر أن المسافة مركز إلى مركز بين QD وجيب ملزمة EGF تصل إلى ~ مسافة 14 نانومتر، ومركز إلى مركز بين البلدين QDS تعلق على ديمر EGFR ل يكون ~ 27 نانومتر (من المرجح أن تختلف من بضعة نانومتر هذه القيمة نظرا لمرونة رابط). المسافة التسمية فضل وهكذا تتفق مع المسافة التسمية المتوقعة للديمر EGFR داخل دقة الأسلوب. ز (خ) منحنى أكبر من وحدة لمسافة تصل إلى 300 نانومتر، مما يشير إلى وجود مجموعات، بما يتفق مع البيانات. ويبين هذا التحليل أن الجزيئية للEGFR يمكن دراستها مع أسلوبنا.

ويبين الشكل 4 نتيجة مماثلة الرقم 2، إلا أنه تم إجراء وضع العلامات مع EGF-QD800، وكان يستخدم هدفا الغمر 63X النفط للصورة مضان. تؤكد هذه البيانات التي تم العثور عليها هذه النتائج نموذجية أيضا عندمايتم وضع العلامات EGFR مع QDS، التي تنبعث منها في الطيف الأحمر القريب. الشكل 4A هي صورة مضان خلية التمثيلية، ويبين الشكل 4B نفس الخلية في وضع نظرة عامة ESEM-STEM والشكل 4C هو صورة التكبير 150،000 العاشر، وسجلت على الحدود الغشاء العلوي من الخلية (انظر المستطيل في الشكل 4B). على غرار الشكل 2A و D، والتقاط الصور EGFR QD المسمى على أضعاف الغشاء ويظهر مستقبلات أحادى، مثنوي، وتتجمع. لاحظ أن الإلكترون QD كثيفة الأساسية يبدو مستدير أصغر نوعا ما ومن النوى من QDS تنبعث منها في 655 نانومتر، بما يتفق مع هم أصغر حجم الأساسية 22 من ~ 5 نانومتر.

الشكل 1. المتلازم مدينة دبي للإنترنت، ومضان ESEM-STEM من EGF-QD655 صفت EGFR على COS-7 المائية بالكامل الخلايا </stرونغ>. (A) DIC صورة للخلايا المزروعة في المنطقة نافذة غشاء الخطيئة، وإعطاء انطباع الطبوغرافية للغشاء البلازما. (B) الإسفار صورة تظهر الخلايا على النافذة غشاء الخطيئة بموقع مركزي (والتي تمثلت في مستطيل متقطع). (C - E) ثلاثة ESEM-STEM صور منخفضة التكبير من الخلايا التي تحمل علامة المستطيلات في A و B. هذه الصور نظرة عامة خلية تعمل على تحديد الموقع الدقيق للتسجيل في وقت لاحق الصور عالية الدقة. يتم وضع علامة على مكان أربع صور عالية الدقة (كما هو موضح في الشكل 2A-D) مع المستطيلات البيضاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

<stroنانوغرام> الشكل 2. عالية الدقة صور ESEM-STEM تصور غشاء ملزمة EGFRs. (A) صورة مجهرية في 75،000X التكبير من منطقة ملحوظ في الشكل 1B. العديد من أحادية واضحة. يشار إلى عدة dimers مع السهام. (B) و (C) وصور المكتسبة في 50،000X التكبير من اليسار، علامة، المناطق غشاء اليمنى على التوالي في الشكل 1C. وترد مجموعات من EGFRs. (D) الصورة المسجلة مع 50،000X التكبير في الموقع ملحوظ في الشكل 1D. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. زوج دالة الارتباط ز (خ) وظيفة من المسافة شعاعي X تحديد للأمور-حزب المسافات كلي من كل التسميات 210 الكشف في الشكل 2A-D. الذروة في 25 نانومتر يشير إلى أن QD مسافة مركز إلى مركز لديها فرصة أكبر بكثير من التي تحدث من العشوائية، حيث AG (س) = 1 يشير إلى وجود فرصة عشوائية. خط متقطع هو دليل للعين يمثل ز (خ) من توزيع عشوائي. يظهر أقحم نموذج الجزيئي التقريبي للديمر EGFR مع EGF المربوطة وstreptavidin المغلفة QDS تعلق عبر البيوتين. نماذج من streptavidin، تم الحصول على EGF وEGFR من نماذج CPK من 1stp (streptavidin)، 1EGF (EGF)، 1NQL، 2JWA، 1M17، 1IVO و2GS6 (EGFR) الهياكل في البروتين RCSB بروتين بنك المعلومات، التي أنشأتها Jmol النسخة 12.2.15. نموذج البيوتين هو كما تعادل في RCSB يجند Explorer الإصدار 1.0. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

/53186/53186fig4.jpg "/>
الرقم 4. النموذجية COS-7 الخلية المسمى مع EGF-QD800 وتصويرها مع مضان مترابط وESEM-STEM. (A) صورة الإسفار، (B) منخفضة نظرة عامة التكبير صورة ESEM-STEM. (C) عالية الدقة الصورة المسجلة في الموقع من المستطيل في ب في 150،000X التكبير. تم الكشف عن EGFRs أحادى، مثنوي، وتتجمع مماثل لوضع العلامات مع EGF-QD655. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.