Method Article

توظيف الرقمية القطرة PCR لكشف الطفرات BRAF V600E في البارافين جزءا لا يتجزأ من خطوط الخلايا المعيار المرجعي الفورمالين الثابتة

DOI:

10.3791/53190

⸱

October 8th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Institute of Pharmaceutical Science, Department of Pharmacy, College of Pharmacy, Seoul National University, 2The Center for Anti-Cancer CDx, N-Bio, Seoul National University, 3ABION CRO, 4ABION Inc., R&D Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف من هذا الفيديو هو إظهار كيفية تنفيذ استخراج الحمض النووي الآلي من (FFPE) إشارة خطوط الخلايا الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين القياسية وقطرة الرقمية PCR (ddPCR) تحليل للكشف عن الطفرات النادرة في عملية إعداد سريرية. الكشف عن الطفرات في عينات FFPE يوضح فائدة سريرية من ddPCR في عينات FFPE.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ddPCR هي طريقة PCR شديدة الحساسية تستخدم نظام مستحلب الماء والزيت. باستخدام مولد القطرات ، يتم تقسيم عينة الحمض النووي المستخرجة إلى ~ 20,000 قطرة من الماء في الزيت بحجم النانو ، ويحدث تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في قطرات فردية. يتمثل نهج ddPCR في تحديد طفرات التسلسل ، وتغييرات عدد النسخ ، وتحديد عمليات إعادة الترتيب الهيكلي التي تتضمن الجينات المستهدفة. هنا ، نوضح استخدام ddPCR كتقنية قوية لتحديد طفرات BRAF V600E النادرة بدقة في خطوط الخلايا القياسية المرجعية FFPE ، وهو أمر مفيد في تحديد الأفراد المصابين بالسرطان. في الختام ، توفر تقنية ddPCR إمكانية تحديد الطفرات النادرة المحددة بدقة في الجينات المختلفة في أنواع مختلفة من عينات FFPE.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تراكم الطفرات الوراثية في الجينات التنظيمية الرئيسية يغير برمجة الخلية الطبيعية مثل تكاثر الخلايا، والتمايز، والبقاء على قيد الحياة، مما يؤدي إلى السرطان 1. كيناز مسار RAS-RAF-MAP يتوسط الاستجابات الخلوية إلى إشارات النمو. يمكن أن الطفرات أنكجنيك BRAF تنجم عن طفرات في الجين سائق BRAF، والتي قد تتسبب في BRAF oncoprotein لتصبح مفرط 2. الطفرات في جين BRAF يؤدي أيضا إلى إشارات المصب فرط نشاط عن طريق منظمة مجاهدي خلق وERK 3، الذي، بدوره، يؤدي إلى نمو الخلايا المفرط والانتشار بشكل مستقل عن النمو بوساطة عامل التنظيم 4-6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. استخراج الحمض النووي من خطوط الخلايا FFPE المعيار المرجعي

ملاحظة: للحصول على هذا الإجراء، تم إجراء استخراج الحمض النووي من الخطوط المرجعية FFPE الخلية القياسية (HD598، HD593، HD617، HD273 وwildtype (WT)) باستخدام FFPE DNA الأنسجة العزلة عدة كما هو موضح في البروتوكول أدناه. وقد تحقق استخراج الحمض النووي الآلي باتباع إرشادات الشركة المصنعة لمجموع عزل الحمض النووي.

  1. باستخدام مشراح وكتلة FFPE الأصلي، وإعداد يدويا أقسام جديدة قبل استخراج الحمض النووي وتحليل، وفقا للإجراءات ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحليل ddPCR لدينا، درسنا BRAF V600E إشارة طفرة FFPE خطوط الخلايا القياسية. القارئ قطرة يتصل برنامج كمبيوتر محمول تحليل بيانات الكمبيوتر على التوالي. ويعرف كل قطرة الفردية على أساس السعة الفلورسنت على أنها إما إيجابية أو سلبية. البرامج المقدمة من قبل الشركة المصنعة يسمح أيضا قطع المعرفة من قبل المستخدم إدخالها إلى تحديد عتبة بين قطرات الإيجابية والسلبية. يتم استخدام عدد من قطرات الإيجابية والسلبية في عينة لحساب تركيز الهدف من حيث النسخ / ميكرولتر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نسلط الضوء على تطبيق ddPCR وعزل الحمض النووي من الإشارة FFPE القياسية عينات خط الخلية لتقييم محدد تحور الجين. في هذه الدراسة، تم استخدام TPS الآلي DNA طريقة العزلة التي يمكن تكييفها بسهولة، الآلي، ويمكن أن تستوعب ما يصل إلى 48 عينات مختلفة في وقت واحد، مما يتيح للتجارب على نطاق أوسع وتقلب أقل. واحدة من القيود المفروضة على عزل الحمض النووي في العمل الحالي هو أن كل عينة FFPE هي فريدة من نوعها، وسوف تختلف بعضها البعض في الملوثات السطحية، الفلورا الميكروبية، و / أو الخلفيات الورا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ميونغ Ryuri أوه، سي يون كيم، ويونغ كيم DEUG هم موظفون من ABION CRO.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا البحث من قبل برنامج R & D للجمعية مؤسسة البحوث الوطنية (جبهة الخلاص الوطني)، بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي (منحة رقم 2013M3C8A1075908).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
هاميلتون MICROLAB STARlet IVD أداةSiemens10701001أداة عزل الحمض النووي الآلي
QX200 Droplet Generator  Bio-Rad772BR1119
QX200 قارئ قطراتBio-Rad771BR1497
آلة PCR التقليدية قادرة على تعديل621BR17718
PX1 PCR لوحة السدادةBio-Rad770BR1575
QuantaSoft برنامجBio-Rad
طقم عزل الحمض النووي  
VERSANT كواشف تحضير الأنسجة مربع 1   ؛سيمنز10632398
VERSANT كواشف تحضير الأنسجة مربع 1   ؛نصائح Siemens10632399
CO-REطفرات
ddPCR
Bio-Rad BR186-30102X تركيز
DG8 خرطوشة  Bio-Rad BR186-4008
زيت مولد قطراتBio-Rad   ؛BR-186-3005
طوقاBio-Rad  BR186-3006
قارئ النفطBio-Rad  BR-186-3004
وقت المنحدر تحليل Siemens ddPCR Supermix  قطرات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
  2. Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
  3. Solit, D. B.,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Digital Droplet PCRBRAF V600E MutationFFPE Cell LinesDNA ExtractionTissue Preparation SystemDroplet GeneratorPCR AmplificationDroplet ReaderMutation ProfilingMolecular Oncology

Related Articles