Method Article

الكمي ثلاثي الأبعاد من شجيري العمود الفقري من الخلايا العصبية الهرمية المستمدة من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية

DOI:

10.3791/53197

⸱

October 10th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Human Genetics and Cognitive Functions, Institut Pasteur, 2CNRS URA 2182 'Genes, synapses and cognition', Institut Pasteur, 3Human Genetics and Cognitive Functions, Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, 4Plateforme d' Imagerie Dynamique, Imagopole, CiTech, Institut Pasteur, 5Neuroplasticity and Therapeutics, CECS, I-STEM, AFM, Evry

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية الهرمية هي مواقع معظم نقاط الاشتباك العصبي مثير في الثدييات قشرة الدماغ. يصف هذا الأسلوب التحليل الكمي 3D من الأشكال التضاريسية العمود الفقري في القشرية الخلايا العصبية الهرمية glutamatergic الإنسان المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العمود الفقري شجيري هي نتوءات صغيرة التي تتوافق مع مقصورات بعد متشابك من نقاط الاشتباك العصبي مثير في الجهاز العصبي المركزي. وهي موزعة على طول التشعبات. مورفولوجيا يعتمد إلى حد كبير على نشاط الخلايا العصبية، وهي ديناميكية. العمود الفقري شجيري تعبر عن مستقبلات glutamatergic (أمبا ومستقبلات NMDA) على سطحها وعلى مستوى كثافة بعد المشبكي. كل العمود الفقري يسمح الخلايا العصبية للسيطرة على نشاط الدولة والمحلي بشكل مستقل. وقد الأشكال التضاريسية العمود الفقري درس على نطاق واسع في الخلايا الهرمية glutamatergic من القشرة الخارجية للدماغ، وذلك باستخدام كلا النهجين في الجسم الحي والثقافات العصبية التي تم الحصول عليها من الأنسجة القوارض. ظروف عصبية مرضية يمكن أن تكون مرتبطة إلى تغير تحريض العمود الفقري والنضج، كما هو مبين في القوارض الخلايا العصبية مثقف والتحليل الكمي ذات بعد واحد 1. توضح هذه الدراسة بروتوكول للتحليل الكمي 3D من الأشكال التضاريسية العمود الفقري باستخدام cortic الإنسانالخلايا العصبية آل المستمدة من الخلايا الجذعية العصبية (الأسلاف القشرية في وقت متأخر). تم الحصول على هذه الخلايا في البداية من الخلايا الجذعية المحفزة. هذا البروتوكول يسمح للتحليل الأشكال التضاريسية العمود الفقري في فترات ثقافة مختلفة، ومع المقارنة الممكنة بين الخلايا الجذعية المحفزة التي تم الحصول عليها من الأفراد التحكم مع تلك التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من الأمراض النفسية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية الهرمية القشرية هي نتوءات صغيرة ورقيقة والتي يتم توزيعها على طول التشعبات القاعدية وقمية من هذه الأنواع الفرعية العصبية في القوارض، الرئيسيات، والدماغ البشري. فهي مواقع لمعظم نقاط الاشتباك العصبي مثير وعرض وظائف أساسية في التعلم والعمليات المعرفية. الهياكل التفصيلية في العمود الفقري شجيري الإنسان تم دراستها فنيا من قبل المجهر الإلكتروني (2). ومع ذلك، فإن هذا النهج هو مضيعة للوقت، ويمثل عبء العمل الثقيل. وفي الآونة الأخيرة، تم الإبلاغ عن ثلاثي الأبعاد (3D) إعادة بناء مورفولوجية شجيري العمود الفقري في قشرة الدماغ البشري باستخدام برامج معينة مجتمعة لدليل كبير تحليل العمود الفقري

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. العصبية الثقافة

ملاحظة: إعادة برمجة الخلايا الليفية في الخلايا الجذعية المحفزة، والالتزام النسب الظهرية الدماغ الانتهائي، الاشتقاق، والتضخيم، والخدمات المصرفية من الأسلاف القشرية في وقت متأخر (نظام الإجراءات الجزائية) وصفت في Boissart وآخرون (4). تم إجراء تمايز الخلايا العصبية من الخلايا مثل نظام الإجراءات الجزائية أيضا وفقا لBoissart آخرون 4 مع تعديلات طفيفة. وقد وضعت إجراءات أخرى لإعادة البرمجة المباشرة من الخلايا الليفية إلى خلايا الجذعية المحفزة تليها التمايز بهم إلى الخلايا العصبية. تم الإبقاء على هذا البروتوكول لأ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه الدراسة بروتوكول موحد لالعمود الفقري الكمي من التشعبات مثقف الخلايا العصبية الهرمية المستمدة من IPSC. هذا البروتوكول يسمح للتحليل العمود الفقري النضج على الخلايا العصبية البشرية والمقارنة ممكنة مع نضوج العمود الفقري في مستوى الثقافات القوارض العصبية وكذلك في الجسم الحي في النماذج الحيوانية.

يمثل الشكل 1A مخطط للخطوات مختلفة من الثقافة التي تسمح للإنتاج الخلايا العصبية الهرمية ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اعتمد الكمي من الميزات المورفولوجية من الخلايا العصبية الهرمية على البرنامج. تم استخدام واجهة الشعيرة الراسم لتقسيم الخلايا العصبية والعمود الفقري، وكان يستخدم وحدة XT لتحليلها.

لتحليل دقة تقنية لدينا، ونحن أول مقارنة قياس المعلمات الشكلية (الطول والمساحة والحجم الكلي العمود الفقري عند الاقتضاء)، مع تلك التي نشرت باستخدام الفئران الخلايا العصبية الهرمية ناضجة في الثقافة 6 و 7 و أنسجة الدماغ البشري

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من قبل معهد باستور، ومؤسسة بيتنكور-شولر، والمركز الوطني للبحوث العلمية، وجامعة باريس ديدرو، والوكالة الوطنية للبحوث (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism) ، ومؤسسة Conny-Maeva الخيرية ، ومؤسسة Cognacq Jay ، ومؤسسة Orange ، ومؤسسة Fondamental Foundation. L.G. مدعومة بزمالة جامعية من وزارة الصحة. نحن نقدر مساعدة BitPlane على وجه الخصوص جورجيا جولفيس ، في المرحلة الأولى من هذا العمل.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
D-PBS (1x) ، sans Calcium ، Magnesium et Phenol RedGibco / Life Technologies14190169
Poly-L-Ornithine Solution BioreagentSigma AldrichP4957
Mouse LamininDutscher Dominique354232
N2< / sub> SupplementGibco / Life Technologies17502048
B-27 Supplement بدون فيتامين أ (50 ضعفا)جيبكو / لايف تكنولوجيز12587010
DMEM / NUT. MIX F-12 W / GLUT-IGibco / Life Technologies31331028
Neurobasal Med SFMGibco / Life Technologies21103049
2-mercaptoethanolGibco / Life Technologies31350-010
Penicillin-SteptomycinGibco / Life Technologies15140-122
GFP مصل الأرانب متعدد النسيلة الأجسام المضادةGibco / Life TechnologiesA-6455
مصل الحصانGibco / Life Technologies16050130
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit   ؛Gibco / Life TechnologiesA11034
الأجسام المضادة للتوبولين متعددة النسيلة المضادة للبيتا IIIMilliporeAB9354
غطاء زجاجي 13 ممVWR631-0150
إطالة كاشف الذهب المضاد للتلاشي مع DAPIGibco / Life TechnologiesP36931
Tween (R) 20 Bioextra ، سائل لزجسيجما ألدريتش تشيميP7949
تريتون X-100Sigma Aldrich ChimieX100-100ML
الخلايا الليفية البشريةCoriell Cell Line BiorepositoryGM 4603 و GM 1869معهد كوريل للبحوث الطبية ، كامدن ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤرZeiss (ألمانيا)LSM 700
Imaris SoftwareBitplane AG و Zurich6.4.0 إصدارFilament Tracer و Imaris XT وحدات ضرورية
برنامج HuygensHuygens ، SVI ، إصدار هولنداProاختياري (لاختبار التفكيك)
Software

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
  2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dendritic Spine QuantificationHuman Induced Pluripotent Stem CellsConfocal Microscopy Imaging3D Spine AnalysisNeural Stem Cell DifferentiationGFP Lentivirus TransductionAnti GFP Antibody StainingDendritic Spine MorphologyGlutamatergic Neuron CultureSpine Density Measurement

Related Articles