العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية الهرمية هي مواقع معظم نقاط الاشتباك العصبي مثير في الثدييات قشرة الدماغ. يصف هذا الأسلوب التحليل الكمي 3D من الأشكال التضاريسية العمود الفقري في القشرية الخلايا العصبية الهرمية glutamatergic الإنسان المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكمي ثلاثي الأبعاد من شجيري العمود الفقري من الخلايا العصبية الهرمية المستمدة من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العمود الفقري شجيري هي نتوءات صغيرة التي تتوافق مع مقصورات بعد متشابك من نقاط الاشتباك العصبي مثير في الجهاز العصبي المركزي. وهي موزعة على طول التشعبات. مورفولوجيا يعتمد إلى حد كبير على نشاط الخلايا العصبية، وهي ديناميكية. العمود الفقري شجيري تعبر عن مستقبلات glutamatergic (أمبا ومستقبلات NMDA) على سطحها وعلى مستوى كثافة بعد المشبكي. كل العمود الفقري يسمح الخلايا العصبية للسيطرة على نشاط الدولة والمحلي بشكل مستقل. وقد الأشكال التضاريسية العمود الفقري درس على نطاق واسع في الخلايا الهرمية glutamatergic من القشرة الخارجية للدماغ، وذلك باستخدام كلا النهجين في الجسم الحي والثقافات العصبية التي تم الحصول عليها من الأنسجة القوارض. ظروف عصبية مرضية يمكن أن تكون مرتبطة إلى تغير تحريض العمود الفقري والنضج، كما هو مبين في القوارض الخلايا العصبية مثقف والتحليل الكمي ذات بعد واحد 1. توضح هذه الدراسة بروتوكول للتحليل الكمي 3D من الأشكال التضاريسية العمود الفقري باستخدام cortic الإنسانالخلايا العصبية آل المستمدة من الخلايا الجذعية العصبية (الأسلاف القشرية في وقت متأخر). تم الحصول على هذه الخلايا في البداية من الخلايا الجذعية المحفزة. هذا البروتوكول يسمح للتحليل الأشكال التضاريسية العمود الفقري في فترات ثقافة مختلفة، ومع المقارنة الممكنة بين الخلايا الجذعية المحفزة التي تم الحصول عليها من الأفراد التحكم مع تلك التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من الأمراض النفسية.
المقدمة
العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية الهرمية القشرية هي نتوءات صغيرة ورقيقة والتي يتم توزيعها على طول التشعبات القاعدية وقمية من هذه الأنواع الفرعية العصبية في القوارض، الرئيسيات، والدماغ البشري. فهي مواقع لمعظم نقاط الاشتباك العصبي مثير وعرض وظائف أساسية في التعلم والعمليات المعرفية. الهياكل التفصيلية في العمود الفقري شجيري الإنسان تم دراستها فنيا من قبل المجهر الإلكتروني (2). ومع ذلك، فإن هذا النهج هو مضيعة للوقت، ويمثل عبء العمل الثقيل. وفي الآونة الأخيرة، تم الإبلاغ عن ثلاثي الأبعاد (3D) إعادة بناء مورفولوجية شجيري العمود الفقري في قشرة الدماغ البشري باستخدام برامج معينة مجتمعة لدليل كبير تحليل العمود الفقري 3.
الخضراء البروتين مضان (GFP) التكنولوجيا بالإضافة إلى المناعي تمثل أداة دقيقة لتحديد العمود الفقري وقياس الشكل بواسطة المجهر مضان. هذا النهج يمكن تطبيقها بسهولة على الخلايا العصبية مثقف. هاوالاصدار، تم الإبلاغ عن أي بيانات عن تحليل النضج العمود الفقري والتشكل على الخلايا العصبية البشرية المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة (التوجيهية).
وكان الهدف من هذه الدراسة لوصف البروتوكول الذي يسمح التصوير العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية البشرية المستزرعة في المختبر. تم استخدام العلامات GFP، متحد البؤر المجهري والتحليل 3D مع وحدة الشعيرة الراسم من البرامج Imaris في هذا البروتوكول. خطوات الثقافة التي هي ضرورية للحصول على الخلايا العصبية glutamatergic القشرية من طبقات من الثاني إلى الرابع من الخلايا الجذعية العصبية (NSC) هي أيضا لفترة وجيزة الموصوفة هنا. وقد تم بالفعل نشر بروتوكول كامل لإنتاج NSC الإنسان في أي مكان آخر 4.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. العصبية الثقافة
ملاحظة: إعادة برمجة الخلايا الليفية في الخلايا الجذعية المحفزة، والالتزام النسب الظهرية الدماغ الانتهائي، الاشتقاق، والتضخيم، والخدمات المصرفية من الأسلاف القشرية في وقت متأخر (نظام الإجراءات الجزائية) وصفت في Boissart وآخرون (4). تم إجراء تمايز الخلايا العصبية من الخلايا مثل نظام الإجراءات الجزائية أيضا وفقا لBoissart آخرون 4 مع تعديلات طفيفة. وقد وضعت إجراءات أخرى لإعادة البرمجة المباشرة من الخلايا الليفية إلى خلايا الجذعية المحفزة تليها التمايز بهم إلى الخلايا العصبية. تم الإبقاء على هذا البروتوكول لأنه يسمح للإنتاج انتقائي من الخلايا العصبية glutamatergic الهرمية.
- علاج لوحات ثقافة 6 جيدا مع coverslips الزجاج مع بولي الأورنيثين (مخفف إلى 1/6 في DPBS، تركيز الأسهم 0.01٪) O / N، تليها ثلاث غسلات في DPBS. ثم إضافة laminin (تركيز المخزون 1 ملغ / مل، مخففة 500 مرة في DPBS) لا يقل عن 10 ساعة تحت غطاء محرك السيارة تدفق .
- لوحة وإيفاد NSC في منخفض الكثافة (50000 خلية / سم 2) في لوحات ثقافة 6 جيدا مع الزجاج coverslips في 3 مل من مستنبت تتألف من DMEM / F12 (500 مل)، 2 قارورة (5 مل لكل منهما) من N2 ملحق، 2 قارورة (10 مل لكل منهما) من B27 الملحق، 10 مل من القلم، الستربتوميسين (البنسلين = 10000 وحدة / مل وإستربتومايسين = 10000 وحدة / مل)، 1 مل من 2 المركابتويثانول (الأسهم الحل: 50 ملم) و laminin (1 / 500)، من دون عوامل النمو. خطوة حاسمة: إجراء هذه الخطوة بعناية بإضافة خلايا مع الحركات الدورية بطيئة من أجل الحد من تجميع الخلية.
- إزالة مستنبت. إضافة المتوسطة N2B27 الطازجة التي تحتوي على 2 ميكروغرام / مل من محلول laminin جديدة للحفاظ على الخلايا العصبية تعلق على الزجاج coverslips وتجنب تراكمها. تغيير المتوسط كل 3 أيام. الابقاء على بعض من المتوسط المتبقية (200 ميكرولتر) قبل إضافة متوسطة جديدة لمنع الخلية من التجفيف. بدلا من ذلك، والمضي قدما بسرعة وتغيير الحجم الكلي (3 مل).
ملاحظة: تم ناقلات lentiviral GFP تفضلت التي تقدمها مختبر الدكتور أوفه Maskos في معهد باستور (باريس)، وأعد وفقا لبروتوكول نشر 5. والدافع GFP التعبير عن طريق الماوس فسفوغليسرات كيناز (PGK) المروج. لهذه الدراسة، كان عيار الفيروسية من 400 نانوغرام / ميكرولتر (حل الأسهم في برنامج تلفزيوني 1X).
- تنبيغ الخلايا العصبية البشرية التوجيهية المشتقة في أي خطوة من النضج بواسطة الجسيمات الفيروسية عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من محلول المخزون تحتوي على 40 نانوغرام من GFP ناقلات lentiviral في ثقافة جيدا (6 لوحات جيدا)، واحتضان لمدة 48 ساعة في مستنبت الطازجة. ملاحظة: للحصول على هذا البروتوكول، ومدة الحضانة يسمح وضع العلامات جيد للهياكل العمود الفقري.
3. المناعي
ملاحظة: من أجل تحسين وضع العلامات على التشكل العمود الفقري كله، تم إجراء وسم المناعي باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة GFP في ظروف permeabilized.
- إزالة مستنبت وإصلاح الخلايا transduced coverslips على 4٪ لامتصاص العرق لمدة 10 دقيقة في RT، ثم يغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني 1X (10 دقيقة لكل منهما).
- coverslips Immerge في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.05٪ تريتون (100X) و 10٪ مصل الحصان لمدة 1 ساعة على RT، ثم يغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني 1X.
- إضافة 100 ميكرولتر من 1X PBS تستكمل مع 4٪ مصل الحصان والأجسام المضادة الأولية (1/1000) التي أثيرت ضد GFP والمخففة بعامل 1000 على كل ساترة. احتضان في مربع O الظلام / N عند 4 درجات مئوية، ثم يغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
- تمييع اليكسا فلور الأضداد 488 مترافق (1/200) في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.5٪ من توين 20 واحتضان لمدة 1 ساعة على RT. ثم يغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني 1X وجبل coverslips على الشرائح الزجاجية مع تصاعد المتوسطة لمضان المجهر.
4. شجيري العمود الفقري التصوير
- أداء التصوير متحد البؤر من خلال متحد البؤر المجهر الليزر المسح الضوئي.
- حدد الخلايا العصبية السليمة مع هرمي التشكل لالثانية وتشجر شجيري كاملة، وتحديد ما لا يقل عن 10 الخلايا العصبية في حالة من تجارب منفصلة. تحديد 60-100 ميكرون في التغصنات.
- الحصول على صور باستخدام النفط 40X NA = 1.3 هدف وخط ليزر 488 نانومتر لGFP الإثارة، وبلغت ذروتها قوة نموذجية على مستوى العينة حوالي 20 مللي واط. مجموعة حجم بكسل حوالي 80 نانومتر لأخذ عينات العمود الفقري شجيري بشكل صحيح.
ملاحظة: إن الدعوة تحليل لاحقة للصورة التي ضجيج لا تفسد تجزئة المناسبة من التشعبات والعمود الفقري. مع الإعدادات أخذ العينات والطاقة المكانية المذكورة أعلاه، لاحظنا أن بكسل يسكن الوقت من 3.15 ميكرو ثانية كافية لجمع ما يكفي من الفوتونات لبناء مثل هذه الصورة. للحصول على عينات قاتمة، ويمكن تحسين جودة الصورة عن طريق حساب متوسط 2-4 بالاشعة. قد تكون هناك حاجة إلى اكتساب العديد من البلاط XY لتغطية المنطقة من اهتمام، والتي ثم يجب مخيط معا قبل المعالجة. - لأخذ عينات من حجم الخلايا العصبية كله، الحصول على Z-المكدس، معوZ تباعد تتراوح بين 150 نانومتر إلى 300 نانومتر، مما أسفر عن 20-30 شرائح Z.
ملاحظة: القرار المكانية الجانبي يتحقق مع هذه الإعدادات هو 234 نانومتر، والقرار المحوري هو 591 نانومتر. أخذ العينات المختارة هنا هي كافية، ولكن كما القرار المحوري أكبر من أصغر حجم العمود الفقري للتصوير، وتحليل تفضل العمود الفقري التي تمتد أفقيا من التشعبات.
5. 3D الكمي لشجيري العمود الفقري
ملاحظة: المقاطع التالية تصف على وجه التحديد استخدام البرنامج Imaris للتحليل. تطبيقات بديلة موجودة، بما في ذلك NeuronStudio 15 أو Metamorph 8، والتي يمكن أن توفر نتائج مماثلة.
استخدام الإعدادات الأساسية التالية:
- ونتيجة لمرحلة ما قبل المعالجة، استخدم تصفية جاوس من خلال مرافق معالجة الصور المقدمة من قبل البرنامج. إجراء التصفية جاوس عن طريق معالجة الصور> Smooشيء> مرشح التمويه. تعيين عرض مرشح ليكون مساويا لحجم بكسل في XY.
- إجراء تتبع شبه التلقائي من التشعبات، وذلك باستخدام وحدة الشعيرة الراسم من البرنامج.
- أولا، تقدير القطر التغصنات، باستخدام أداة المسافة في علامة التبويب شريحة من البرنامج.
- في علامة التبويب فق، انقر على أداة الشعيرات. لمتانة أفضل، ويعتمد هذا البروتوكول على تتبع شبه الآلي. انقر على إنشاء التلقائي تخطي. واجهة وحدة يظهر الآن على علامة التبويب رسم. هنا، حدد أرجية مستقلية المنشأ كوسيلة من وسائل، التغصنات كنوع، وإدخال قطر التغصنات المقدرة.
- استخدام اختر وضع المؤشر، وتحول المؤشر إلى مربع. مفتاح Shift بزر الماوس الأيمن فوق نقطة انطلاق التغصنات. ملاحظة: البرنامج ينفذ الحسابات الأولية.
- حرك المؤشر على طول التغصنات. من نقطة البداية (تمثيلإد كمجال الأزرق)، ويظهر خط أصفر يمثل مسار التغصنات على الأرجح. التحول من اليسار انقر على نقطة النهاية التغصنات.
- أداء العمود الفقري تجزئة الآلي. ملاحظة: أشواك على التغصنات تتبع هي التي يمكن العثور عليها تلقائيا من قبل واجهة وحدة.
- في واجهة وحدة، انقر فوق علامة التبويب الخلق. في إعادة المنسدلة القائمة، واختيار إعادة التغصنات قطر والتحقق من المربع بيانات الاحتفاظ بها. ثم انقر فوق إعادة الإنشاء.
- تعيين العتبة بحيث يتوافق مع حجم مجزأة إلى حجم التغصنات الفعلي. كما خوارزمية، حدد أقصر مسافة من نصف القطر خريطة انقر على زر التالي.
- تحديد أصغر قطر الرأس العمود الفقري وطول القصوى، مرة أخرى باستخدام أداة المسافة في علامة التبويب شريحة من البرنامج، ثم يعود إلى علامة التبويب تفوق وأدخل المعلمات. Fأو هذا البروتوكول، والقيم حول 200-300 نانومتر عن الحد الأدنى من قطر و 4 ميكرون لطول القصوى هي نقطة انطلاق جيدة. لا تحقق السماح فرع العمود الفقري مربع. انقر على زر التالي.
- ضبط عتبة النقاط البذور بحيث يشير اللون الأزرق يمثل العمود الفقري لتوطين رؤوس العمود الفقري الفعلي. انقر على زر التالي. ملاحظة: يتم احتساب الأساسية الآن، ويمكن أن تكون طويلة.
- تصنيف العمود الفقري عن طريق الذهاب إلى علامة التبويب أدوات واجهة وحدة. انقر على صنف العمود الفقري. في واجهة المستخدم المطالبة، تأكد أن هناك أربع فئات، يحددها التشكل على النحو التالي: قصير و: طول <1 ميكرون. الفطر: الطول (العمود الفقري)> 3 وعرض ماكس (الرأس)> يعني العرض (الرقبة) × (2)؛ طويل ورفيع: متوسط العرض (الرأس) ≥ متوسط العرض (الرقبة). أرجل كاذبة خيطية، مثل: طول ≤ 4 ميكرون (بلا رأس).
ملاحظة: موواجهة مصح يولد أربعة أشياء خيوط جديدة تحتوي على نتائج التصنيف. - البيانات الإحصائية تصدير: على أي من هذه الواجهات وجوه أربعة، انتقل إلى علامة التبويب الاحصائيات.
انقر على تصدير جميع الاحصائيات إلى زر ملف.
ملاحظة: يمكن تصديرها القيم إحصائية أخرى عن التشعبات (. على سبيل المثال، الطول والمساحة، يعني قطر، وعمق فرع، المتفرعة زاوية، وحجم، الخ)، والعمود الفقري (على سبيل المثال، الاستقامة، منطقة المرفق، وطول وحجم متميزة أجزاء العمود الفقري، وقطر العمود الفقري، الكثافة، الخ.)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
توضح هذه الدراسة بروتوكول موحد لالعمود الفقري الكمي من التشعبات مثقف الخلايا العصبية الهرمية المستمدة من IPSC. هذا البروتوكول يسمح للتحليل العمود الفقري النضج على الخلايا العصبية البشرية والمقارنة ممكنة مع نضوج العمود الفقري في مستوى الثقافات القوارض العصبية وكذلك في الجسم الحي في النماذج الحيوانية.
يمثل الشكل 1A مخطط للخطوات مختلفة من الثقافة التي تسمح للإنتاج الخلايا العصبية الهر...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
اعتمد الكمي من الميزات المورفولوجية من الخلايا العصبية الهرمية على البرنامج. تم استخدام واجهة الشعيرة الراسم لتقسيم الخلايا العصبية والعمود الفقري، وكان يستخدم وحدة XT لتحليلها.
لتحليل دقة تقنية لدينا، ونحن أول مقارنة قياس المعلمات الشكلية (الطول والمساحة والحجم الكلي العمود الفقري عند الاقتضاء)، مع تلك التي نشرت باستخدام الفئران الخلايا العصبية الهرمية ناضجة في الثقافة 6 و 7 و أنسجة الدماغ البشري
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من قبل معهد باستور، ومؤسسة بيتنكور-شولر، والمركز الوطني للبحوث العلمية، وجامعة باريس ديدرو، والوكالة الوطنية للبحوث (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism) ، ومؤسسة Conny-Maeva الخيرية ، ومؤسسة Cognacq Jay ، ومؤسسة Orange ، ومؤسسة Fondamental Foundation. L.G. مدعومة بزمالة جامعية من وزارة الصحة. نحن نقدر مساعدة BitPlane على وجه الخصوص جورجيا جولفيس ، في المرحلة الأولى من هذا العمل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| D-PBS (1x) ، sans Calcium ، Magnesium et Phenol Red | Gibco / Life Technologies | 14190169 | |
| Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Mouse Laminin | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2< / sub> Supplement | Gibco / Life Technologies | 17502048 | |
| B-27 Supplement بدون فيتامين أ (50 ضعفا) | جيبكو / لايف تكنولوجيز | 12587010 | |
| DMEM / NUT. MIX F-12 W / GLUT-I | Gibco / Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal Med SFM | Gibco / Life Technologies | 21103049 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco / Life Technologies | 31350-010 | |
| Penicillin-Steptomycin | Gibco / Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP مصل الأرانب متعدد النسيلة الأجسام المضادة | Gibco / Life Technologies | A-6455 | |
| مصل الحصان | Gibco / Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit ؛ | Gibco / Life Technologies | A11034 | |
| الأجسام المضادة للتوبولين متعددة النسيلة المضادة للبيتا III | Millipore | AB9354 | |
| غطاء زجاجي 13 مم | VWR | 631-0150 | |
| إطالة كاشف الذهب المضاد للتلاشي مع DAPI | Gibco / Life Technologies | P36931 | |
| Tween (R) 20 Bioextra ، سائل لزج | سيجما ألدريتش تشيمي | P7949 | |
| تريتون X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| الخلايا الليفية البشرية | Coriell Cell Line Biorepository | GM 4603 و GM 1869 | معهد كوريل للبحوث الطبية ، كامدن ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر | Zeiss (ألمانيا) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG و Zurich | 6.4.0 إصدار | Filament Tracer و Imaris XT وحدات ضرورية |
| برنامج Huygens | Huygens ، SVI ، إصدار هولندا | Pro | اختياري (لاختبار التفكيك) |
المراجع
- Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
- Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
- Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
- Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).
- Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).
- Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).
- Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794(2011).
- Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).
- Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
- Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
- Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (4), e1997(2008).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
