يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ثقافة نموذج رواية لالمحفزة الإنسان الجذعية نشر خلية على الجيلاتين في وسائل الإعلام مكيفة المشيمة-

7.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53204

⸱

أغسطس 3, 2015

 , 
1Department of Biomedical Science, Graduate School of Medicine, Korea University

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة لنشر الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) باستخدام الوسائط المكيفة فقط المشتقة من المشيمة البشرية في طبق مغطى بالجيلاتين دون مكملات خارجية إضافية أو طبقات أساسية اصطناعية خاصة ب hPSC.

الملخص

< p class = 'jove_content'> كان انتشار الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) في وسط مكيف مشتق من الخلايا البشرية في ظروف الثقافة الخالية من المغذيات أمرا مثيرا للاهتمام. ومع ذلك، لم يتم تطوير طريقة مثالية للتكاثر بدون تغذية من الجسم الحي لمركبات السلفاسية النطاقية المرتفعة. حاليا ، تتم إضافة ركائز خارجية إضافية بما في ذلك عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) ، وهو عامل رئيسي للحفاظ على hPSC ، إلى جميع وسائط الاستزراع ويتم استخدام الطبقات السفلية الاصطناعية مثل Matrigel أو laminin في جميع الثقافات الخالية من المغذيات. في الآونة الأخيرة ، طورت مجموعتنا بروتوكولا بسيطا وفعالا لتكاثر hPSCs باستخدام وسائط مكيفة فقط مشتقة من المشيمة البشرية على طبق مغلف بالجيلاتين دون مكملات خارجية إضافية أو طبقات أساسية اصطناعية خاصة ب hPSCs. لم يتم الإبلاغ عن هذا البروتوكول من قبل وقد يمكن الباحثين من نشر hPSCs بكفاءة في ظروف الاستزراع المتوافقة مع البشر. بالإضافة إلى ذلك ، يتجنب هذا النموذج مخاطر تلوث hPSC بالمنتجات الحيوانية مثل الفيروسات أو البروتينات غير المعروفة. علاوة على ذلك ، يسهل هذا النظام الإنتاج الضخم السهل لمركبات PSC باستخدام طلاء الجيلاتين ، وهو سهل التعامل معه ، مما يقلل بشكل كبير من التكاليف الإجمالية لصيانة hPSC خارج الجسم الحي.

المقدمة

الهدف من هذا البروتوكول هو إكثار الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) في ظروف خالية من المغذيات خارج الجسم الحي المتوافقة مع البشر دون الحاجة إلى مكملات خارجية إضافية وركائز اصطناعية. حتى الآن ، كان تطوير نماذج ثقافة hPSC خارج الجسم الحي ، والتي تمكن من إدخال منتجات الاستزراع إلى العيادة ، مصدر قلق كبير في أبحاث الخلايا الجذعية. وعلى وجه التحديد، هناك مشكلتان حاسمتان بحاجة إلى معالجة. أولا ، هناك حاجة إلى نظام متوافق مع البشر خارج الجسم الحي لتكاثر hPSCs الذي يتجنب خطر التلوث بمنتجات الخلايا الحيوانية. ثانيا ، هناك حاجة إلى نموذج استزراع خال من المغذيات لتسهيل الإنتاج الضخم السهل والاقتصادي لمركبات عالية النطاق. بالنسبة للتطبيقات العلاجية لمركبات السلمون عالية الجذام والأوعية الدموية ، من الضروري تحديد العوامل التي تنظم تجديدها الذاتي وتمايزها.

منذ Xu et al. أبلغ في البداية عن جدوى استخدام الوسائط المشروطة (CM) المشتقة من الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEF) لزراعة الخلايا الليفية الجنينية للفأر على Matrigel1 ، فحصت العديد من الدراسات طرق الانتشار المثلى خارج الجسم الحي ل hPSCs2-4. ومع ذلك ، لم يتم تطوير نظام انتشار hPSC مثالي خال من التغذية من الجسم الحي لأن الطرق الحالية تتطلب ركائز خارجية إضافية بما في ذلك bFGF والأنسولين ، وهما عوامل معروفة لاستدامة hPSC ، في وسائط الاستزراع5-7. علاوة على ذلك ، يتم استخدام الطبقات السفلية الاصطناعية مثل Matrigel أو laminin في جميع الثقافات الخالية من المغذيات.

يعتمد الأساس المنطقي وراء تطوير واستخدام هذا البروتوكول على دراساتنا السابقة التي تظهر أن خلايا المشيمة البشرية تدعم بشكل ممتاز انتشار hPSCs دون مكملات bFGF8-11. يحتوي هذا البروتوكول على عدد من المزايا بما في ذلك بساطته فيما يتعلق بالمناولة وفعاليته من حيث التكلفة ، وهو ثقافة إنسانية شبه مثالية تمكن من انتشار hPSC بدون ركائز اصطناعية خارجية. يتضمن تطبيق CM المشتق من المشيمة البشرية (hPCCM) لمركبات السلم والأوعية الدموية الهيدرولية 3 خطوات. أولا ، يتم عزل خلايا المشيمة عن المشيمة البشرية وزراعتها. ثانيا ، يتم إنتاج hPCCM من الخلايا المستنبتة. ثالثا ، يتم استزراع hPSCs باستخدام hPCCM ويتم تأكيد خصائصها.

سيسهل هذا البروتوكول التطبيقات السريرية لمركبات hPSC ودراسات آليات انتشار hPSC وارتباطه. في هذه الورقة ، يتم تقديم بروتوكول التكاثر الناجح لمركبات hPSCs في hPCCM على طبق مغلف بالجيلاتين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بيان الأخلاق: وقد أجريت الدراسة المشيمة البشرية مستقبلا، مع موافقة مجلس المراجعة المؤسسية للبحوث البشري من جامعة كوريا (AN09085-001). أجريت جميع التجارب في-جرثومة الحرة منشأة غرفة نظيفة في المركز الطبي لجامعة كوريا. تمت الموافقة على تصميم والإجراءات باستخدام hPSCs التجريبي من قبل مجلس المراجعة المؤسسية من المركز الطبي في جامعة كوريا (AN12277-003).

1. إعداد الآلات، الثقافة وسائل الإعلام، وأطباق

  1. معطف جميع الأطباق الثقافة بنسبة 0.1٪ الجيلاتين. المالحة الأوتوكلاف الفوسفات مخزنة (PBS) وملقط. تعقيم مقص جراحي، أنابيب microcentrifuge، والشاش على 121 درجة مئوية تحت £ 15 رطل لمدة أكثر من 15 دقيقة.
  2. 0.25٪ التربسين الاثيلين أمين رباعي حمض الخل استعداد استعد مسبقا (التربسين-EDTA) واستعد مسبقا سائل الإعلام والثقافة تصفيتها (DMEM) تحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 100 U / البنسلين مل، و 100 غرام / مل streptomycقبل البدء في الإجراءات.

2. عزل الخلايا من المشيمة البشرية

  1. الحصول على أنسجة المشيمة بعد ولادة قيصرية قسم الولادة، من النساء الحوامل صحية تمر الإجهاض الطبيعي أو العلاجي في 7-32 أسبوعا من الحمل بعد الحصول على الموافقة المسبقة الخطية.
  2. لدينا أخصائي الولادة المشيمة البشرية لوحات المشيمي منفصلة جراحيا (HPCS) من المشيمة. احتضان هذه في 0.25٪ التربسين-EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، ثم يغسل مع 5 مل PBS.
  3. عزل الزغابات المشيمية من HPCS باستخدام مقص. تخطر على الزغابات وغسلها ثلاث مرات مع 1ML PBS. بعد تنميق، ضع الزغابات المشيمية في أنبوب microfuge باستخدام طرف ماصة. غسل العينات مع 500 ميكرولتر PBS التي pipetting صعودا وهبوطا، وأنابيب الطرد المركزي لمدة 120 x ج لمدة 3 دقائق. غسل الأنسجة مرتين مع 500 ميكرولتر من قبل تحسنت مستنبت.
  4. خلايا الثقافة في المتوسط ​​على لوحات الجيلاتين المغلفة في 37 ° C، في 5٪ CO 2 ، وتحت 95٪ الرطوبة. قبل معطف جميع لوحات مع الجيلاتين 0.1٪ لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. سوف مستعمرات الخلايا مثل الخلايا الليفية تشكيل ونمو ملتصقة ما يقرب من 5-7 أيام بعد بدء الثقافة في نفس المتوسطة.
  5. تبادل المتوسطة كل 2-3 أيام حتى مرور الثالث. خلال الثقافة، وإزالة الحطام الخلية عائمة في مستنبت. وتزايد الخلايا الليفية الرحمية نعلق على طبق من ذهب. ثقافة الخلايا مثل الخلايا الليفية المستمدة من HPC حتى مرور 10 عشر ثم حصادها للثقافات HESC بعد trypsinization وميتوميسين-C (10 ميكروغرام / مل) العلاج.
  6. قبل التجميد HPCS كعينات الاسهم، استخدم عكس النسخ-البلمرة المتسلسل (RT-PCR) للتأكد من أن HPCS ليست ملوثة مع مسببات الأمراض التي تصيب عادة المشيمة، بما في ذلك الميكوبلازما (M. المخمرة، M. الأنافية الخنزيرية، M. ارجينين، M . الفويهى، M. اللعابية، M. هومينيس، M. للرئة، M. arthritidis، M. neurolyticum، M. hyopneumoniae،وM. capricolum) والأنواع البكتيرية، الميورة الحالة لليوريا، وذلك باستخدام مجموعة الكشف عن الميكوبلازما.
    1. اتبع تعليمات الشركة الصانعة لأداء RT-PCR، استخدم كل الاشعال ومخاليط المنصوص عليها في عدة. استخدام supernatants من الخلايا التي تم زراعتها لمدة 36 يوما للكشف عن الميكوبلازما. إضافة 3 ميكرولتر من هذه العينات لمخاليط PCR وتنفيذ الإجراء 1 ش PCR لمدة 35 دورات، يتألف كل منها من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    2. إضافة بعناية 0.5 ميكرولتر من 1 الحادي PCR المنتج إلى خليط PCR وتنفيذ الإجراء 2 الثانية PCR لمدة 30 دورات باستخدام نفس الشروط كما كان من قبل. تحليل المنتجات تضخيمها من قبل 1٪ هلام الاغاروز الكهربائي. تطبيق 10 ميكرولتر من كل من شارع 1 و 2 الثانية المنتجات PCR إلى المواد الهلامية.
  7. إذا تم العثور على HPCS أن تكون ملوثة مع مسببات الأمراض، والقضاء على هذهباستخدام مزيج من المضادات الحيوية (BM-السيكلين)، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. إضافة الوسيلة الجديدة التي تحتوي على 10 ميكروغرام / مل من BM-السيكلين 1 لمدة 3 أيام، ثم علاج الخلايا مع 5 ميكروغرام / مل BM-السيكلين 2 لمدة 4 أيام أخرى. كرر هذه الدورة مرتين ومن ثم التحقق من وجود تلوث الميكوبلازما مرة أخرى.

3. خلايا حصاد الإنسان المشيمة المستمدة مكيفة متوسط ​​(hPCCM)

  1. بعد استبعاد التلوث، وعلاج الخلايا المرفقة (85-90٪ التقاء؛ (1.5 × 10 7 خلايا / قارورة) مع ميتوميسين-C (10 ميكروغرام / مل) لمدة 2 ساعة و 30 دقيقة، ويغسل خلايا ثلاث مرات مع 10 مل برنامج تلفزيوني. احتضان الخلايا مع المتوسط ​​قبل تحسنت دون ميتوميسين-C لمدة 24 ساعة.
  2. بعد يوم واحد من العلاج، واحتضان خلايا في 10 مل المتوسطة (DMEM-F12 تستكمل مع 20٪ خروج المغلوب المصل استبدال [KOSR]، 0.1 ملم β المركابتويثانول، 1٪ NEAA، و 1٪ البنسلين ستربتومايسين). بعد 24 ساعة من الحضانة، والحصاد CM في أنبوب مخروطي 15 مل وتصفية CM باستخدام فلتر حقنة 0.22 ميكرون.
  3. إضافة 10 مل أخرى من الوسيلة الجديدة والحضانة. جمع كل supernatants من ثقافات كل يوم لمدة 1 أسبوع وتجميد المتوسطة تحصد في -80 ° C. تجنب تكرار تجميد أذاب دورات.

4. ثقافة الإنسان الخلايا الجذعية الجنينية (hESCs) وتحريض الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs)

  1. الحصول الجنينية خطوط الخلايا الجذعية البشرية، H1 و H9 الخلايا (المدرجة في التسجيل NIH HESC تحت اسم WA01 وWA09، على التوالي) والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة التوجيهية-1: الجذع (القلفة) -1 والتوجيهية 2 (IISH1i- BM) من معهد أبحاث معهد ويسيل (ماديسون، WI، الولايات المتحدة الأمريكية). يجب إذابة الخلايا ومثقف باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  2. لمجموعة المراقبة، وخلايا الثقافة على أطباق الغشاء القاعدي مصفوفة المغلفة في استخدامها على نطاق واسع تحديدا مستنبت حرة المصل خالية من وحدة التغذية وعند 37 درجة مئوية و5٪ CO 2. في البداية، البذور 80-100 كتل من hPSCs طن 35 ملم الأطباق. تنمو الخلايا في هذه الأطباق حتى 70-80٪ التقاء وبشكل روتيني خلايا مرور لمرة واحدة كل 5-6 أيام، وذلك باستخدام الطرق الميكانيكية أو الأنزيمية (Dispase)، زراعة الفرعية. غسل الخلايا مرتين مع المتوسط ​​ومنها لوحة في نسبة 1: 4. استبدال المتوسطة مع المتوسطة الطازجة كل يوم.
  3. للمجموعات التجريبية، وخلايا الثقافة في hPCCM على الأطباق قبل المغلفة مع الجيلاتين 0.1٪ وأداء الركض روتيني مرة كل 5 أيام، إما ميكانيكيا أو إنزيمي. لوحة الخلايا في نسب في حدود 1: 6-1: 10. hPSCs نعلق على الجيلاتين داخل 2 يوما بعد النقل. استبدال المتوسطة مع المتوسطة الطازجة يوميا.

5. توصيف المحفزة الإنسان الخلايا الجذعية

ملاحظة: توصيف hPSCs باستخدام عدة طرق، مثل تلطيخ الفوسفاتيز القلوية، مناعية، الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR)، والنشاف الغربي.

  1. المناعي تلطيخ
    1. لimmunofluorescencالبريد تلطيخ، hPSCs ثقافة وإصلاح الخلايا في غرف الشريحة 8 جيدا مع 4٪ (ث / ت) لامتصاص العرق لمدة 10 دقيقة. ثم، permeabilized الخلايا بنسبة 0.1٪ (V / V) تريتون-X100 لمدة 15 دقيقة، ومنع الخلايا لمدة 1 ساعة مع 3٪ (V / V) مصل الحصان العادي في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ (V / V) Tween- 20. يغسل PBS مرتين لمدة 5 دقائق بين كل خطوة.
    2. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية (OCT-4، SSEA4، TRA-1-81، TRA-1-60، التخفيف من 1: 1000) O / N عند 4 درجات مئوية ومع الأجسام المضادة الثانوية.
    3. قبل التركيب، واحتضان الخلايا مع 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) لمدة 5 دقائق في الظلام. غسل الخلايا بشكل صارم ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل والجافة الخلايا تماما، في الظلام. الحفاظ على الخلايا في مضان المتوسطة المتزايدة وننظر إليها تحت المجهر مضان.
  2. QRT-PCR
    1. عزل الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا باستخدام عدة RNeasy مصغرة وفقا لمواصفات الشركة الصانعة وتحديد الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام نانو قطرة مقياس الطيف الضوئي.
    2. توليف [كدنا بإضافة 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع لتحتوي بنسبة ضئيلة 20 ميكرولتر خليط التفاعل (DT) الاشعال ومرتفع II عكس الناسخ. اتبع تعليمات الشركة الصانعة في هذا الإجراء.
    3. تضخيم كدنا] توليفها مع نظام معدل الذكاء بيو راد iCycler، وذلك باستخدام معدل الذكاء SYBR الأخضر QPCR ميكس ماجستير وتسلسل التمهيدي هو موضح في الجدول التكميلي S1. تطبيع القيم عتبة دورة من الجينات التي تهم تلك نازعة غليسيرألدهيد-3-فوسفات (GAPDH).
  3. الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) تلطيخ
    1. كشف النشاط AP باستخدام خلية ES توصيف كيت، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    2. في يوم 5، ونضح وسائل الإعلام وإصلاح hPSCs مع بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 12 دقيقة. لا overfix. وتحديد الخلايا لمدة تزيد عن 2 دقيقة يؤدي إلى تثبيط إنزيم الفوسفاتيز القلوية. نضح تثبيتي، وشطف مع 1X شطف العازلة. لاتسمح الآبار لتجف بين الخطوات.
    3. إضافة ما يكفي من حل تلطيخ لتغطية كل بئر (1 مل لكل بئر من صحن 35 ملم). احتضان لوحات في الظلام في RT لمدة 15 دقيقة.
    4. بعد الحضانة، وغسل الصحون مع 1X شطف العازلة. تغطية الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X لمنع جفاف ودراسة وصورة الخلايا الملون باستخدام مجهر أوليمبوس.
  4. البقعة الغربية
    1. إجراء تحليل لطخة غربية كما هو موضح سابقا في 9. لفترة وجيزة، وتحديد تركيزات البروتين في الخلية لست]. حل كميات متساوية من البروتين على دوديسيل الصوديوم وكبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (SDS-PAGE) جل ونقل البروتينات على غشاء البولي فينيل الفلوريد (PVDF).
    2. منع وصمة عار وتحقيق ذلك O / N مع الأجسام المضادة الأولية المختلفة في 4 ° C؛ في وقت لاحق احتضان وصمة عار مع الأجسام المضادة الثانوية HRP-مترافق لمدة 1 ساعة. يغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة في كل مرة بين حضانات. كشف الإشارات باستخدام كاشف ECL.
  5. قصيرة جنبا إلى جنب كرر (STR) تحليل
    1. كانت تحصد hPSCs من السيطرة والمجموعات التجريبية في نفس المقطع. تم استخراج DNA الجينومية باستخدام طقم DNA مايكرو، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. تضخيم الحمض النووي الجيني لمدة 16 المكاني وراثية مختلفة باستخدام أدوات AmpF / STR PCR التضخيم، وفقا لمواصفات الشركة الصانعة والكهربائي الشعري أجريت باستخدام محلل الوراثية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ومن مزايا هذه الطريقة نشر hPSC هو أنه يستخدم مكونات يفرز من خلايا الإنسان. والخطوة الأكثر ciritical في البروتوكول هو العزلة والثقافة من الخلايا المشتقة من المشيمة البشرية. وهذا يتطلب وتشريح دقيق من جزء محدد من HPC لوحة الزغب الشكل يظهر 1 إجراءات المستمدة من المشيمة البشرية العزلة الخلية. هذه العملية بسيطة ومريحة لعزل الخلايا، ويمكن أن تتم في غضون 1 ساعة. كما هو موضح في الشكل 2، والأنسجة تعلق على طبق وتشبه الخلايا الليفية الخلايا ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد تم تطوير هذا النموذج إلى نشر بنجاح hPSCs، مع الحفاظ على خصائصها، وأنسنة ظروف ثقافة خالية من التغذية بدون إضافة عوامل النمو المؤتلف خارجية مثل bFGF أو الأنسولين، مما يتيح التلاعب hPSCs في المكروية أنسنة. bFGF مكملات خارجي هو شائع وتطبيق الطبقات التحتية مثل Matrigel أو Laminin الحالي هو ضروري لتغذية خالية من زراعة من hPSCs 14.

هذا البروتوكول هو بسيط وسهل التنفيذ. ومع ذلك، بعض الخطوات الحاسمة لنجاحها....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وتشير المؤلفين جود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

فإن الكتاب أود أن أشكر قريبا تشيول كونج (MD، دكتوراه، أستاذ مشارك، قسم التوليد وأمراض النساء، جامعة كلية طب كوريا) لتوفير أنسجة المشيمة. وأيد هذا العمل في جزء من المنح (R1211902) من المؤسسة الوطنية للبحوث كوريا (جبهة الخلاص الوطني)، وجمهورية كوريا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
شركة Mitomycin-CSigma-AldrichCorporation M428710 & mu ؛ جم / مل
طقم الكشف عن الميكوبلازماTaKaRa Bio Inc.# 6601
MatrigelBD Biosciences# 354277
mTeSR1STEMCELL Technologies Inc.# 05850
DispaseWorthington Biochemical CorporationLS021001 مجم / مل
الجيلاتينSigma-Aldrich CorporationG25000.10٪
BM-CyclinRoche799 05010 & mu ؛ جم / مل
مجموعة صغيرة RNeasy Qiagen74104
نانو إسقاط الطيف الضوئيالحرارية فيشر Scientific Inc
iQ SYBR الأخضر qPCR ماستر ميكس  مختبرات Bio-Rad# 170-8882AP
ES مجموعة توصيف الخلاياChemicon International، Inc. ،SCR001
Power cDNA Synthesis Kit   ؛iNtRON التكنولوجيا الحيوية25011
QIAamp® مجموعة الحمض النووي الصغيرةQiagen56304
AmpF / STR & reg ؛ تحديد الهوية® طقم تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسلApplied Biosystems Inc.4322288
Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer شركة Applied Biosystems Inc.

المراجع

  1. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
  2. Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Reprod. 70 (3), 837-845 (2004).
  3. Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60(2010).
  4. Jin, S., Yao, H., Weber, J. L., Melkoumian, Z. K., Ye, K. A synthetic, xeno-free peptide surface for expansion and directed differentiation of human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (11), e50880(2012).
  5. Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
  6. Xu, C., et al. Basic fibroblast growth factor supports undifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium. Stem Cells. 23 (3), 315-323 (2005).
  7. Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
  8. Park, Y., et al. Human feeder cells can support the undifferentiated growth of human and mouse embryonic stem cells using their own basic fibroblast growth factors. Stem Cells Dev. 20 (11), 1901-1910 (2011).
  9. Park, Y., et al. The efficacy of human placenta as a source of the universal feeder in human and mouse pluripotent stem cell culture. Cell Reprogram. 12 (3), 315-328 (2010).
  10. Park, Y., et al. Undifferentiated propagation of the human embryonic stem cell lines, H1 and HSF6, on human placenta-derived feeder cells without basic fibroblast growth factor supplementation. Stem Cells Dev. 19 (11), 1713-1722 (2010).
  11. Seok, K., et al. Human placenta-derived feeders support prolonged undifferentiated propagation of a human embryonic stem cell line, SNUhES3: comparison with human bone marrow-derived feeders. Stem Cells Dev. 16 (3), 421-428 (2007).
  12. Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
  13. Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
  14. Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542. J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدراتطلاء الجيلاتينعزل الزغابات الكوريونيةتكوين مستعمرات الخلايا الليفيةتحضير الوسط المكيفالزراعة الخالية من الخلايا المغذيةالمكملات الخارجيةالإنتاج الكمي
ثقافة نموذج رواية لالمحفزة الإنسان الجذعية نشر خلية على الجيلاتين في وسائل الإعلام مكيفة المشيمة-
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.