يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تنقية ماوس سفن الدماغ

24.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53208

⸱

نوفمبر 10, 2015

 ,  ,  , 
1Collège de France, Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Unité Mixte de Recherche 7241, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2Centre Interdisciplinaire de Recherche en Biologie, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and Paris Science, Lettre Research University, 4Université Paris Descartes, Faculté de Pharmacie, Université Paris Diderot

في هذه المقالة

ملخص

نصف بروتوكولا يسمح بتنقية حجرة الأوعية الدموية في دماغ الفأر. تشمل الأوعية الدماغية المعزولة الخلايا البطانية المرتبطة بتقاطعات ضيقة وتحيط بها صفيحة قاعدية مستمرة ، وحضجة ، وخلايا عضلية ملساء وعائية ، بالإضافة إلى أغشية أبطانية حول الأوعية الدموية.

الملخص

في الدماغ، أكثر من نظام الأوعية الدموية تتكون من حاجز انتقائي، حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​الذي ينظم تبادل الجزيئات والخلايا المناعية بين الدماغ والدم. وعلاوة على ذلك، يتطلب الطلب الهائل التمثيل الغذائي الخلايا العصبية لائحة لحظة إلى لحظة تدفق الدم. والجدير بالذكر أن شذوذ هذه الأنظمة هي السمات المميزة المسببة لمعظم أمراض الدماغ. بما في ذلك الإصابة بالورم الأرومي الدبقي، والسكتة الدماغية، وذمة، والصرع، والأمراض التنكسية (مثلا: مرض باركنسون ومرض الزهايمر)، وأورام الدماغ، وكذلك حالات الالتهابات مثل التصلب المتعدد، والتهاب السحايا والدماغ الخلل الناجم عن الإنتان. وبالتالي، فهم الأحداث يشير إلى تحوير علم وظائف الأعضاء الدماغية يمثل تحديا كبيرا. الكثير من التبصر في خصائص الخلوية والجزيئية من مختلف أنواع الخلايا التي يتكون منها نظام الدماغية يمكن الحصول عليها من الثقافة الأساسية أو الخلية الفرز من أنسجة المخ فصلها حديثا. ومع ذلك،لا يتم الاحتفاظ بخصائص مثل الخلية القطبية، مورفولوجيا والعلاقات بين الخلايا في هذه الاستعدادات. تم تصميم البروتوكول الذي وصفنا هنا لتنقية شظايا سفينة الدماغ، مع الحفاظ على السلامة الهيكلية. وتبين لنا أن السفن معزولة تتكون من الخلايا البطانية مختومة من قبل منعطفات ضيقة التي تحيط بها الصفيحة القاعدية مستمرة. Pericytes، خلايا العضلات الملساء وكذلك الأغشية المحيطة بالأوعية نجمية endfeet لا تزال تعلق على طبقة الخلايا البطانية. وأخيرا، نحن تصف كيفية إجراء التجارب المناعية على السفن الدماغ تنقيته.

المقدمة

يتطلب الأداء السليم للنظام العصبي المركزي (CNS) بيئة خارج الخلية درجة عالية من التنظيم، ومطالبها التمثيل الغذائي ضخمة مقارنة مع الأجهزة الأخرى 1. الجهاز العصبي المركزي هي أيضا حساسة للغاية لمجموعة واسعة من المواد الكيميائية، وغير مؤذية عادة إلى الأجهزة الطرفية ولكن إلى ذلك، أعصاب. لضمان الأداء السليم، أكثر من "CNS الأوعية الدموية تشكل عائقا البطانية. حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​التي تسيطر على تدفق الجزيئات والأيونات وكذلك مرور الخلايا المناعية بين الدم والدماغ، وبالتالي المحافظة على التوازن السليم 2، ولكن أيضا تحد من دخول الأدوية العلاجية، والعلاج مما يعوق الاضطرابات العصبية 3. على المستوى الخلوي، وحافظ على BBB أساسا من منعطفات ضيقة واسعة بين الخلايا البطانية والتعبير استقطابا للنقل هروب رأس المال ومعدل transcytosis منخفضة جدا (4). خصائص ووظائف BBB وبفعل معظمهم من شمال شرقخلايا ighboring 4. على وجه الخصوص، pericytes تلعب دورا هاما في تحريض والحفاظ على BBB 5،6. كونها خلايا مقلص، pericytes أيضا تنظيم تدفق الدم 7 كما تفعل خلايا العضلات الملساء المحيطة السفن الكبيرة. وأخيرا، النجمية، فإن الخلايا الدبقية الرئيسية في الدماغ، وترسل العمليات الكبيرة اسمه endfeet حول معظم الأوعية الدموية في الدماغ 8 و تعدل BBB النزاهة والهدوء المناعي 9، ونقل نواتج الأيض في الخلايا العصبية 10، ولحث على اقتران ضيق بين نشاط الخلايا العصبية و تدفق الدم 11،12.

القدرة على دراسة الخصائص الجزيئية والخلوية للنظام الدماغية هي حاسمة لتوصيف أفضل مساهمته في علم وظائف الأعضاء والدماغ الفيزيوباثيا. لمعالجة هذه المسألة، وقد وضعت استراتيجيات لعزل نظام الدماغية في المخ، والتي تسمح لإعداد سليمة شظايا سفينة الدماغ. الدماغي السفينة صوقد وصفت urification في البداية باستخدام العقول البقري 13 وتحسنت وتتكيف مع الأنواع الأخرى، وخاصة القوارض 14. في هذه الدراسة الأخيرة، تم إدخال استخدام مرشحات من أحجام مختلفة لفصل الأوعية الدماغية في لكسور التخصيب في السفن من أقطار مختلفة. ومن المثير للاهتمام، في مثل هذه الاستعدادات، تبقى الخلايا البطانية خصائص الأيض الخاصة 15، وظائف نقل 16 والاستقطاب 17. هنا، نحن تصف بالتفصيل هذا البروتوكول، وكذلك إثبات أن السفن معزولة تحتفظ معظم من هم في الهياكل الموقع. الخلايا البطانية تبقى مرتبطة من قبل منعطفات ضيقة ومحاطة الصفيحة القاعدية مستمرة. Pericytes وخلايا العضلات الملساء لا تزال تعلق على طبقة الخلايا البطانية، وكذلك الأغشية المحيطة بالأوعية نجمية. ومع ذلك، يتم استبعاد الخلايا النجمية، الخلايا الدبقية، الخلايا العصبية و oligodendrocytes. وأخيرا، نحن تصف الإجراء لأداء المناعية على السفن الدماغ معزولة.

حتى الآن وقد أجريت معظم الدراسات الجزيئية والخلوية المتعلقة بنظام الدماغية على تنقية خلايا الدماغ سفينة فصلها باستخدام سلالات مراسل الماوس محددة الخلية أو الإجراءات القائمة على المناعية 18،19 الفرز الخلية. على الرغم من أن هذه التقنيات تتيح للعزلة من الذهب الخالص تقريبا السكان الخلية الدماغية، الخلايا المعزولة يفقد تماما في الموقع التشكل والتفاعل، وهذا بدوره يؤثر بشكل كبير ممتلكاتهم الجزيئية والخلوية. وصف بروتوكول هنا، مما يسمح لعزل شظايا الدماغية بأكملها دون الحاجة للأجسام معينة أو بقع الماوس المعدلة وراثيا، ويقدم بديلا جيدا كما في الهيكل العام للالأوعية الدماغية المعزولة يتم حفظها، وبالتالي تقليل تداعيات على ممتلكاتهم الجزيئية. ويمكن بعد ذلك أن تستخدم سفن معزولة لدراسة النشاط الجيني، تخليق البروتين والتنظيم على BBB كما هو موضح في الآونة الأخيرة 20،21 . وأخيرا، بالمقارنة مع الليزر التقاط تسليخ مجهري 22،23 هذا البروتوكول غير مكلفة وسهلة لأداء وقدرة على التكيف بسرعة إلى أي مختبر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. حلول والمواد

  1. إعداد الحلول سفينة العزلة: B1، إضافة 1.5 مل من HEPES 1M إلى 150 مل من HBSS. B2، إضافة 3.6 غرام من ديكستران إلى 20 مل من B1. B3، إضافة 1 غرام من BSA إلى 100 مل من B1.
  2. تعديل حامل المرشح عن طريق قطع الجزء السفلي من الجزء العلوي الشد.
  3. إعداد الحلول المناعية: حل التثبيت، 4٪ لامتصاص العرق في PBS الرقم الهيدروجيني 7.4. Permeabilization / عرقلة الحل، يخفف مصل الماعز إلى 5٪ وتريتون X100 إلى 0.25٪ في PBS الرقم الهيدروجيني 7.4.
    ملاحظة: التثبيت يعتمد على نوع من الأجسام المضادة الأولية المستخدمة.

2. تشريح

ملاحظة: ليس مطلوبا من ظروف معقمة، ما لم يتم استخدام السفن لأغراض زراعة الخلايا.

  1. إعداد كوب 150 مل مع 20 مل من B1. الحفاظ على الجليد، وتغطي مع parafilm لتجنب تلوث الهواء.
  2. عميق تخدير الماوس تحت غطاء محرك السيارة مع منشفة ورقية صغيرة غارقة في 1 مل من الأيزوفلورين النقي الذي يضاف الباحثس القفص. يتم التحقق منها التخدير بسبب عدم وجود رد فعل لقرصة أخمص قدميه. قتل الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
    ملاحظة: يتم إنجاز هذه الخطوات في الامتثال للوائح الوطنية والمؤسسية.
  3. اختياري: إجراء نضح داخل القلب مع 20 مل من برنامج تلفزيوني 1x إلى القضاء على محتوى الدم 24.
  4. القسم الجلد مع مشرط من الرقبة إلى الأنف وتسحبه بعيدا. إزالة الشعر عن تلويث مع PBS 1X.
  5. لفتح الجمجمة، أدخل لأول مرة مقص الأمامية إلى البصلة الشمية، وفتح المقص لتمزق في الجمجمة في جزأين.
  6. إزالة بعناية الدماغ باستخدام ملعقة الدماغ. تشريح خارج الضفيرة المشيمية من البطينات الجانبية لأنها تلوث الأوعية الدموية إعداد 38.
    ملاحظة: اختياري: سوف يحتوي على الإعداد النهائي متني والسحايا السفن. إن لم يكن المطلوب، السحايا يمكن خلع باتباع الإجراء التي وصفها 38.
  7. TRansfer الدماغ في دورق يحتوي على حل B1 على الجليد. ما يصل إلى 8 أدمغة يمكن معالجتها معا.

3. الدماغ الأنسجة التجانس

  1. باستخدام اثنين من المشارط، يدويا وبقوة للفوز على الدماغ في حل B1 الحصول بعد ذلك قطع صغيرة من حوالي 2 مم.
  2. التجانس إعداد مع Dounce الخالط المؤتمتة، وأداء 20 السكتات الدماغية في 400 دورة في الدقيقة. تأكد من أن أنبوب زجاجي يتم الاحتفاظ في الجليد وأن الجزء العلوي من douncer في حل عندما تتحرك صعودا وهبوطا، وذلك لمنع تشكيل جيوب الهواء. إذا كنت على استعداد عدة عينات، وغسل douncer مع الماء المؤين بين كل التجانس.

4. السفينة تنقية

  1. نقل جناسة في أنبوب من البلاستيك 50 مل، والشروع في الطرد المركزي في 2000 ز لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. وهناك واجهة بيضاء كبيرة (ومعظمهم من المايلين) تتشكل على الجزء العلوي من بيليه السفينة (أحمر إذا تم إجراء أي نضح).
  2. تجاهل طاف. بيليه السفينة واجهة بيضاء ستظل المرفقة معا. إضافة 20 مل من محلول B2 المثلج ويهز الأنبوب يدويا وبقوة لمدة 1 دقيقة.
  3. انتقل إلى الطرد المركزي الثاني في 4400 ز لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. فإن المايلين الآن تشكل طبقة بيضاء كثيفة على سطح طاف.
  4. فصل بعناية طبقة المايلين من جدران أنبوب من خلال عقد أنبوب وتناوب على السماح طاف لتمرير على طول الجدران ببطء. تجاهل المايلين مع طاف. بيليه الذي يحتوي على السفن لا تزال تعلق في الجزء السفلي من الأنبوب.
  5. وصمة عار على الجدار الداخلي للأنبوب مع ورقة ماصة ملفوفة حول البلاستيك 5 مل ماصة وإزالة جميع السوائل المتبقية، وتجنب لمس بيليه السفينة. الحفاظ على أنبوب رأسا على عقب على ورقة ماصة لاستنزاف أي السائل المتبقي.
  6. تعليق بيليه في 1 مل من محلول B3 المثلج قبل pipetting صعودا وهبوطا مع نصائح الاسعار المنخفضة للملزم، keepiنانوغرام أنبوب على الجليد، ثم يضاف 5 مل من محلول آخر B3. تأكد من أن السفن تنتشر بقدر الإمكان ولا تشكل الحصى.

5. الترشيح

  1. إعداد كوب على الجليد مع 30 مل من محلول B3 الجليد الباردة. تغطية مع parafilm لتجنب تلوث الهواء.
  2. وضع مرشح 20 ميكرون شبكة على حامل المرشح تعديل على الجزء العلوي من قارورة بيكر وتتوازن من خلال تطبيق 10 مل من محلول B3 الجليد الباردة.
  3. صب إعداد السفينة على مرشح وشطف السفن مع 40 مل من محلول B3 الجليد الباردة.
  4. استرداد تصفية باستخدام ملقط نظيفة وتزج فورا في دورق يحتوي الحل B3. فصل الأوعية من مرشح عن طريق هز بلطف.
  5. صب محتويات الكأس في 50 مل أنبوب من البلاستيك وأجهزة الطرد المركزي في 2000 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  6. ملاحظة: بدلا من ذلك، تعليق الأوعية الدماغ من الخطوة 4.6 يمكن أن تتم تصفيته على 100 مرشح ميكرون شبكة.في هذه الحالة، يتم الاحتفاظ السفن الكبيرة تفضيلي على مرشح في حين أن التدفق من خلال يتضمن microvessels (الشعيرات الدموية في المقام الأول)، والتي ثم يصفى على فلتر 20 ميكرون شبكة على النحو الوارد أعلاه.
  7. resuspend الكرية من microvessels في 1 مل من محلول B3 المثلج وتحويلها من قبل pipetting قبل ان تتحول الى 1.5 مل إيبندورف أنبوب. الطرد المركزي في 2000 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.

6. التثبيت، ومنع Permeabilization

  1. سفن نقل من قبل pipetting إلى 0.2 مل أنابيب PCR يحتوي PBS باستخدام 1.0 مل منخفضة طرف ملزم. يجب الحرص على عدم لمس السفن لأنها قد تنضم إلى الجزء الخارجي من الحافة. تنفيذ كافة الخطوات التالية تحت المجهر مجهر.
  2. لكل من التغييرات متوسطة التالية، وترك الأنابيب على الجليد حتى وصلت سفن القاع، وماصة للخروج معظم السوائل باستخدام طويلة والشيء هلام تحميل نصائح الماصة.
  3. إزالة أكثر من برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولتر من محلول تثبيتي.تعليق السفن عن طريق هز بلطف واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT.
  4. ماصة من الحل تثبيتي، واستبدالها مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X (غسل الأولى)، واحتضان لمدة 5 دقائق على RT وكرر هذه الخطوة 3 مرات. في كل مرة، تحقق من أن السفن قد غرقت بشكل صحيح إلى الجزء السفلي من الأنابيب وماصة من برنامج تلفزيوني 1X، ضمان عدم لمس السفن.
  5. بعد غسل الماضي، استبدال برنامج تلفزيوني 1X من قبل permeabilization / حل الحجب واحتضان 1 ساعة عند RT، إعادة التعليق على السفن عن طريق هز بلطف من وقت لآخر.

7. المناعية

  1. استبدال permeabilization / عرقلة الحل مع مزيج من الأجسام المضادة الأولية (انظر المراجع من الأجسام المضادة المستخدمة هنا والتخفيفات في مواد الجدول قالب) المخفف في permeabilization / حل حظر، واحتضان عند 4 درجات CO / N.
  2. بعد 3 يغسل في برنامج تلفزيوني في RT، واحتضان السفن مع مزيج من الأجسام المضادة الثانوية المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعةفي RT.
  3. ملاحظة: نحن نوصي بشدة أداء تلطيخ النووي مع هويشت (1: 2000) أو دابي (1: 2000) لتمييز السفن من الممكن تلويث الشعر أو الغبار تحت المجهر.
  4. بعد 3 يغسل في برنامج تلفزيوني، resuspend والسفن في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.

8. تركيب ومراقبة

  1. إعداد طرف مع الزجاج الشعرية siliconized و: قطع رأس P200 ماصة باستخدام مشرط وضبط الشعرية في الداخل. حجم تقريبي من شعري 40 ميكرولتر.
  2. نقل السفن على شريحة زجاجية باستخدام الزجاج الشعرية siliconized و، وإزالة بعناية السائل مع قطعة من ورق ماص.
  3. تطبيق قطرة واحدة من تصاعد المتوسطة على السفن وعقد ساترة في 45º السماح للإسقاط لتنتشر على طول حافة الانزلاق. ترك قبالة ساترة والسماح المتوسطة تنتشر ببطء. السماح لها الجافة O / N في RT مع الحماية من الضوء. ويمكن ملاحظة السفن تحت fluorescالأنف والحنجرة المجهر متحد البؤر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هنا، نحن تصف بروتوكول يسمح للعزلة الميكانيكية للسفن الدماغ 14 الشكل 1 يلخص الخطوات الرئيسية لهذه التقنية. عمارة السفن الدماغ معقدة وتتضمن عدة أنواع الخلايا، أي الخلايا البطانية مختومة من قبل منعطفات ضيقة ومحاطة pericytes، وخلايا العضلات الملساء، والعمليات القدم نجمية 9. وهكذا، بعد عزل الأوعية الدماغية، ونحن تهدف لتوصيف هيكل السفن تنقيتها من المناعية كما هو موضح في الجزء الثاني من بروتوكول لدينا. أجرين AGRIN، وهو مكون من الصفيحة القاع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

حاجز الدم في الدماغ وينظم مرور المواد الفسيولوجية داخل وخارج الجهاز العصبي المركزي، ويحمي ضد المواد الضارة المحتملة الحالية في الدم. وتشارك في العديد من الأمراض CNS، بما في ذلك أمراض الاعصاب 2 وأورام الدماغ 28. نفاذية منخفضة للغاية من BBB أيضا يعيق مرور العوامل العلاجية استهداف الخلايا العصبية وتطوير أساليب تعتزم افتتاح عكسية على BBB مع عدم وجود عواقب وخيمة للدماغ هو حقل نشط جدا في البحوث 3. وقد بذلت الكثير من الجهود لتطوير نماذج قيمة وتقنيات السما...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل Labex MemoLife والتي ARSEP (مؤسسة صب L'مساعد à لا بحوث سور لا يتصلب أون لويحات)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طاحونة مناديل مقاس Cتوماس علمي3431E25
طرد مركزي 5415  Eppendorf
5810 REppendorf5811000320
مجهر مجهر مجسمة معياري عاليLeicaMZ6
المضغوط نصائح Leica LED1000 LeicaLED1000
عالية الجودة (P1000)حامل مرشح Sorenson BioScience14200T
Swinnex 47 مم PP 8 / PkMilliporeSX0004700< / a>
قرص مرشح صافي من النايلون Hydrophilic 20 & micro ؛ م 47 مم 100 / PkMilliporeNY2004700< / a >
قرص مرشح صافي من النايلون ماء 100 & مايكرو ؛ م 47 مم 100 / PkMilliporeNY1H04700< / a >
الجدار القياسي أنبوب البورسليكاتأداة SutterB150-86-7.5
المجهرالحرارية العلمية1014356290F
زلات الغطاء ، سمك 1P10143263NR1علمي حراري
0.2 مل أنابيب رقيقة الجدران وغطاء مقببThermo ScientificAB-0266
  ؛ PARAFILM M (حجم لفة 4 بوصات ؛ مرات ؛ 125 قدما)SigmaP7793-1EA
HBSS ، بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيوم ، لا يحتوي على فينولأحمر تقنية الحياة 14175-129< / a>
HEPES (1M)تقنية الحياة15630056
ديكستران من Leuconostoc spp. السيد ~ 70،000سيجما31390
ألبومين مصل الأبقارSigmaA2153
10x PBSEuromedexET330
16٪ فورمالديهايد (ث / حجم) ، خالي من الميثانول   ؛Thermo Scientific28908
Triton < sup > < / sup> X-100SigmaX100
bisBenzimide H 33342 ثلاثي هيدروكلوريد (Hoechst)Sigma14533
تصاعد متوسط Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Isolectin GS-IB4 من Griffonia simplicifolia ، Alexa Fluor 488 Contringate ؛ التخفيف 1/100Life technologyI21411
Agrin (أرنب) ; التخفيف 1/400مقدمة من الدكتور ماركوس A Ruegg
Anti ZO-1 (الماوس ، استنساخ 1A12)تقنية الحياة33-9100التخفيف 1: 500
مكافحة العضلات الملساء أكتين (الماوس ، استنساخ 1A4)SigmaA2547  ؛ التخفيف 1: 500
مكافحة GFAP (الماوس ، استنساخ GA5)SigmaG3893  ؛ التخفيف 1: 500
مكافحة AQP4 (أرنب)سيجماA5971  ؛ التخفيف 1:500
Anti Cx43 (الماوس, استنساخ  2)BD Biosciences610061  التخفيف 1: 500
مضاد Olig2 (أرنب)MilliporeAB9610  ؛ التخفيف 1: 200
Anti NF-M (الفأر)مقدم من الدكتور بيت إم ريدرر ، جامعة لوزان ، سويسرا.  التخفيف 1:10
Anti Iba1 (أرنب)واكو019-19741  التخفيف 1: 400
Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) تقنية الأجسام المضادةA11029  ؛ التخفيف 1: 2,000
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، Alexa Fluor 488 مترافقتقنية الحياةA11034  ؛ التخفيف 1: 2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H + L) تقنية الأجسام المضادةA21424  ؛ التخفيف 1: 2,000
الماعز المضادة للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، Alexa Fluor 555 مترافقتقنية الحياةA21429& nbsp ؛ التخفيف 1: 2,000
جهاز جهاز الطرد المركزي R الأداء يوفر نظام شرائح

المراجع

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  3. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
  4. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  5. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
  8. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
  9. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  10. Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
  11. Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
  12. Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).
  13. Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
  14. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  15. Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745(1991).
  16. Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
  17. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741(2010).
  19. Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  20. Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9(2015).
  21. Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
  22. Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
  23. Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
  24. Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
  25. Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
  26. Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
  27. Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).
  28. Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418(2014).
  29. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  30. Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544(1978).
  31. Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
  32. Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
  33. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  34. Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
  35. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
  36. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  37. Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
  38. Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  39. Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
  40. Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
  41. Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
  42. Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
  43. Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تنقية ماوس سفن الدماغ
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.