مقالة منهجية

عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية للإنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية الجهاز التنفسي القياسات

12.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53217

⸱

نوفمبر 13, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Department of Human Nutrition, Foods, and Exercise, Virginia Tech, 2The Metabolic Phenotyping Core, Virginia Tech, 3Seahorse Bioscience

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم تعديلا لطريقة تم الإبلاغ عنها سابقا تسمح بعزل الميتوكوندريا عالية الجودة والنقية عن كميات أصغر من عضلات الهيكل العظمي للفأر. ينتج عن هذا الإجراء ميتوكوندريا شديدة الاقتران تتنفس بوظيفة عالية أثناء فحوصات ريسبيروميرك القائمة على الصفيحة الدقيقة.

الملخص

مختلة الميتوكوندريا العضلات والهيكل العظمي تلعب دورا في عملية التمثيل الغذائي تغير لاحظ مع الشيخوخة والبدانة ومرض السكري من النوع الثاني. المقايسات respirometric الميتوكوندريا من التحضيرات الميتوكوندريا المعزولة تسمح لتقييم وظيفة الميتوكوندريا، وكذلك تحديد آلية (ق) للعمل الأدوية والبروتينات التي تعدل الأيض. وغالبا ما تتطلب إجراءات العزلة الحالية كميات كبيرة من الأنسجة لانتاج الميتوكوندريا عالية الجودة اللازمة لفحوصات respirometric. الطرق الواردة في هذه الوثيقة تصف كيف عالية الجودة الميتوكوندريا المنقى (~ 450 ميكروغرام) يمكن عزله عن كميات ضئيلة (~ 75-100 ملغ) من الماوس العضلات والهيكل العظمي للاستخدام في قياسات الجهاز التنفسي إنتاجية عالية. توصلنا إلى أن طريقة عزلتنا ينتج 92.5 ± 2.0٪ الميتوكوندريا سليمة من خلال قياس النشاط سينسيز سترات طيفيا. بالإضافة إلى ذلك، أدى تحليل لطخة غربية في الميتوكوندريا المعزولة في التعبير خافت من cytosoالبروتين يسانس، GAPDH، والتعبير القوي للبروتين الميتوكوندريا، COXIV. عدم وجود الفرقة GAPDH بارزة في الميتوكوندريا المعزولة يدل على التلوث القليل من مصادر غير الميتوكوندريا أثناء إجراء العزل. الأهم من ذلك، وقياس معدل استهلاك O 2 مع لوحة الصغيرة القائمة على التكنولوجيا وتحديد نسبة السيطرة التنفسية (RCR) لفحوصات respirometric المترابطة معارض البالغ الاقتران (RCR؛ <6 لجميع المقايسات) والميتوكوندريا وظيفية. في الختام، إضافة خطوة تنميق منفصلة وسمحت تخفيض كبير بالمواتير سرعة تجانس طريقة عنها سابقا عزلة جودة عالية والميتوكوندريا تنقيته من كميات صغيرة من الماوس العضلات والهيكل العظمي الذي ينتج في الميتوكوندريا بالإضافة جدا أن نتيجة التنفس مع وظيفة عالية خلال صفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometirc.

المقدمة

تتمثل الوظيفة الأساسية للميتوكوندريا في إنتاج ATP من الفسفرة المؤكسدة. ومع ذلك ، فإن الميتوكوندريا لها العديد من الوظائف الخلوية المهمة الأخرى بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر: إنتاج وإزالة السموم من أنواع الأكسجين التفاعلية ، وتنظيم الكالسيوم السيتوبلازمي والميتوكوندريا ، والاتجار بالعضيات ، والتوازن الأيوني ، والتورط في موت الخلايا المبرمج1،2. لذلك ، ليس من المستغرب أن تلعب الميتوكوندريا المختلة دورا في العديد من أمراض الأمراض ، مثل الشيخوخة والأمراض التنكسية العصبية وأمراض القلب والأوعية الدموية والسرطان والسمنة والسكري3،4. الأهم من ذلك ، أن الميتوكوندريا العضلية الهيكلية تشارك على وجه التحديد في العديد من هذه الأمراض3-5.

تسمح فحوصات تنفس الميتوكوندريا

باستخدام الميتوكوندريا المعزولة بتقييم سلسلة نقل الإلكترون ووظيفة الفسفرة المؤكسدة ، وتحديد آلية (آليات) عمل الأدوية والبروتينات التي تعدل عملية التمثيل الغذائي. توجد إجراءات عزل الميتوكوندريا لأنواع متعددة من الأنسجة والخلايا لمجموعة متنوعة من الأنواع6،7. ومع ذلك ، غالبا ما تتطلب هذه الإجراءات كميات كبيرة من الأنسجة / الخلايا للحصول على إنتاجية عالية الجودة من الميتوكوندريا اللازمة لفحوصات قياس التنفس الكلاسيكية.

تسمح فحوصات respirometirc القائمة على الصفيحة الدقيقة

بقياسات إنتاجية عالية باستخدام كميات قليلة من الميتوكوندريا المعزولة ، وغالبا ما تكون عدة ميكروغرام فقط لكل بئر8. لذلك ، نقدم تعديلا للطرق المنشورة سابقا7 للسماح بعزل الميتوكوندريا عالية الجودة من كميات أصغر من عضلات الهيكل العظمي للفأر لاستخدامها في فحوصات ريسبيروميرك القائمة على الصفيحة الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير طرق لتحديد جودة تحضير عزل الميتوكوندريا وسلامة أغشية الميتوكوندريا. بالنظر إلى أن الميتوكوندريا العضلية الهيكلية متورطة في العديد من الحالات المرضية ، فإن قياس استهلاك O2 في الدراسات المدفوعة ميكانيكيا أصبح أكثر انتشارا في البحوث الطبية الحيوية9،10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت الدراسات على الحيوانات في إطار البروتوكول التي وافق عليها رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في معهد البوليتكنيك فرجينيا وجامعة ولاية.

1. إعداد (الوقت: ~ 45 دقيقة)

  1. مخازن تجميد ذوبان الجليد من 0.25٪ التربسين، عزل عازلة للالميتوكوندريا (IBM) 1 وIBM2 في حمام مائي 37 ° C.
  2. شطف الأواني الزجاجية وأدوات تشريح في الايثانول 70٪ تليها مياه عالية النقاء.
  3. إعداد 0.05٪ محلول التربسين من 0.25٪ التربسين الأسهم عن طريق تمييع 1 جزء التربسين في 4 أجزاء IBM1.
  4. مزيج البروتيني والفوسفاتيز المانع كوكتيل مع العازلة تحلل الخلية (1: 100 نسبة) في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع غطاء المسمار.
  5. قسامة 5 مل (5 مل / الماوس) من 0.05٪ التربسين في أنبوب من البلاستيك 15 مل.
  6. تعيين بالمواتير الخالط الأنسجة إلى 80 دورة في الدقيقة.

2. عزل العضلات والهيكل العظمي الميتوكوندريا (الوقت: ~ 90 دقيقة)

  1. الموت ببطء الماوس عن طريق CO 2 استنشاق، تليها خلع عنق الرحم.
  2. إزالة العضلات الحمراء من عضلات الفخذ والساق العضلات، والذي يتضمن النعلية (75-100 ملغ ~ الكل) كما هو موضح في الخطوات التالية:
    1. قشر الجلد نحو الماوس.
    2. إزالة لوحة الدهون أكثر من نقطة الأصل الرباعية الرؤوس. قطع العضلة رباعية الرؤوس التي يتم تركيبها على الرضفة مع مقص يميل غرامة.
      ملاحظة: يتم التعرف على عضلات الفخذ التي كتبها الوضعية التشريحية على الجزء الأمامي من الفخذ القريبة.
    3. قص ببطء صفاق بين العظام وعضلات الفخذ، مع تجنب الشريان الفخذي، لتحرير عضلات الفخذ من العظم. قطع الوتر مع مقص يميل غرامة عند نقطة الأصل على عظم الفخذ لتحرير عضلة الفخذ ووضع عضلة الفخذ في برنامج تلفزيوني برود.
    4. إزالة الأنسجة الدهنية واضحة على عضلات الفخذ مع مقص. الوجه عضلات الفخذ بحيث تكون جزء من العضلات التي كانت تغمر عظم الفخذ يواجه شص. فتح عضلة الفخذ مع ملقط في حركة تأجيج. إزالة اثنين من مرئية أجزاء العضلات الحمراء من كل شحمة الأذن مع مقص يميل الجميلة ومكان في دورق يحتوي على 5 مل من برود IBM1.
      ملاحظة: العضلة الرباعية الرؤوس تظهر كما فصين مع شريط من العضلات الحمراء بالقرب من الحافة الجانبية من كل شحمة الأذن.
    5. قطع الجلد المغطي في وتر العرقوب مع غرامة يميل مقص وقشر الجلد نحو الماوس. قطع وتر العرقوب المكشوفة وقشر العضلات نحو جسم الفأر.
    6. قطع وتر في اللقم الجانبية وسطي من عظم الفخذ مع مقص يميل غرامة لتحرير الساق ووضع الساق تعلق على الأوتار في PBS المبردة.
    7. الوجه الساق مرارا وتقشر عضلة النعلية ووضع في دورق يحتوي على 5 مل من برود IBM1. مروحة فتح الساق. إزالة الأجزاء الثلاثة البصرية الحمراء العضلات (قطعتين الحمراء الجانبية وسطي واحد السطحية) مع غرامة يميل مقصالصورة ونقلها إلى دورق يحتوي على 5 مل من برود IBM1.
  3. إزالة ~ 75-100 ملغ أخرى من العضلات الحمراء من الساق الأخرى من الفأرة (كما هو موضح في الخطوة 2.2) ووضع في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع البروتيني والفوسفاتيز المانع كوكتيل وعازلة تحلل الخلية (50 ملي تريس، HCL، 1 ملي EDTA، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم، 0.5٪ deoxycholate الصوديوم، 1٪ البولي أوكسي إتيلين (9) nonylphenylether، تشعبت وعلى الفور فلاش-تجميد هذه العينة الثانية في النيتروجين السائل لاستخدامها لاحقا في غرب النشاف (راجع الخطوة 6.1).
  4. وضع سطح البلاستيك شقة قبل المبردة على الجليد في دلو كبير. صب قطرة من IBM1 على سطح البلاستيك واستخدام الملقط لوضع كل من العضلات الحمراء مقطوع (الخطوة 2.2.4 و2.2.7) في IBM1 الحبرية. تخطر على الأنسجة العضلية لمدة 2 دقيقة واحدة باستخدام 3 شفرات الحلاقة حافة بواسطة شفرات الحلاقة تتغير كل 40 ثانية.
  5. نقل الأنسجة المفروم إلى دورق جديد مع 5 مل من IBM1 جديدة عن طريق الضغط على سطح البلاستيك أكثر من عشرةالبريد كوب وتجريف العضلات في الكأس بشفرة حلاقة. خذ هذا الحل واستنزاف من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرون وضعت على 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  6. وصمة عار الأنسجة مع ممسحة مهمة حساسة ومن ثم نقلها إلى 5 مل من محلول التربسين 0.05٪. استخدام ملاقط لإزالة الأنسجة من المساحات المهمة.
  7. احتضان الأنسجة العضلية على الجليد لمدة 30 دقيقة في 0.05٪ محلول التربسين.
  8. تدور أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على خليط التربسين / العضلات في 200 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
  9. صب طاف التربسين في حاوية النفايات و resuspend بيليه مع 3 مل من الجليد IBM1 البرد. نقل الأنسجة إلى 45 مل أنبوب زجاجي الخالط. شطف أنبوب مخروطي 15 مل مع 1.5 مل IBM1 آخر لجمع أي عينة المتبقية وهذا إضافة إلى أنبوب زجاجي الخالط.
  10. وضع أنبوب زجاجي الخالط الى شغل في منتصف الطريق كوب أو حاوية بلاستيكية مع الثلج حتى ينتقل الخالط الزجاج الحد الأدنى داخل الكأس.
  11. تجانس الخليط الأنسجة / IMB1 مع مدقة PTFE تعلق على بالمواتير الأنسجة الخالط مع 10 تمريرات في 80 دورة في الدقيقة. عقد أسفل كل تمريرة ل~ 2 ثانية.
  12. نقل جناسة الأنسجة لأنبوب 15 مل مخروطي الشكل الجديد وشطف أنبوب زجاجي الخالط مع 6.5 مل من IBM1. صب IBM1 إلى 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على جناسة الأنسجة.
  13. تدور أنبوب مخروطي 15 مل في 700 غ لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. صب بلطف طاف في كوب قوة عالية أنبوب الطرد المركزي وتجاهل بيليه.
  14. تدور طاف من الخطوة السابقة في 8000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  15. إزالة طاف IBM1 وإعادة تعليق بيليه بإضافة ببطء 500 ميكرولتر من IBM2. قطع نهاية طرف ماصة والتجانس بلطف بيليه في IBM2 مع الخلط والتقليب الاقتراحات. إضافة 4.5 مل أخرى من IBM2 إلى الخليط بعد تعليق بيليه بالكامل.
    ملاحظة: تجنب الإفراط في سحن حين كسر قطعة بيليه أكبر لرله قد يؤدي إلى تلف أغشية الميتوكوندريا.
  16. تدور IBM2 / الأنسجة جناسة في 8000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن تكرار هذه الخطوة في نظيفة قوة عالية أنبوب الطرد المركزي لأدق تقدير البروتين الميتوكوندريا معزولة في الخطوة 4 منذ المتبقي BSA قد تسهم في محتوى البروتين الكلي.
  17. إزالة طاف وبلطف، ولكن تماما اعادة تعليق بيليه بإضافة اثنين 25 الزيادات ميكرولتر من IBM2 مع طرف ماصة مع وجهة نظرها قطع. يحرك بلطف وتخلط بيليه بعد كل إضافة 25 ميكرولتر من IBM2. ضع هذا المخزون الميتوكوندريا على الجليد.

3. تجانس النسيج كله المحللة (الوقت: ~ 45 دقيقة، ويمكن أن يتم ذلك خلال الخطوة 7)

  1. إزالة العضلات من أن وضعت في النيتروجين السائل من الخطوة 2.3 واحتضان في درجة حرارة الغرفة حتى إذابة تماما.
  2. تخطر على الأنسجة ل~ 30 ثانية على الجليد مع مقص يميل غرامة.
  3. إضافة إلى اثنين من المجارف 100 ميكرولتر من Zircoأكسيد nium الخرز لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع غطاء المسمار من الخطوة 3.2 الذي يحتوي على الأنسجة المفروم. تجانس الأنسجة في الخالط الأنسجة طاحونة حبة باستخدام 2-3 5 دورات دقيقة في إعداد سرعة 4-6 (الإعداد المتوسط).
  4. تدور خليط من الخطوة 3.3 في 12000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف باستخدام 1000 ميكرولتر ماصة بعد زيادة ونقصان ونقل في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. تجاهل بيليه ووضع طاف على الجليد.

4. البروتين تحديد (الوقت: ~ 30 دقيقة)

  1. تحديد تركيز البروتين في الأنسجة المحللة كله (الخطوة 3.4) والأسهم الميتوكوندريا (الخطوة 2.17) باستخدام BCA عدة فحص البروتين وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.

5. الميتوكوندريا غشاء النزاهة. سينسيز سيترات (CS) آخر (الوقت: ~ 15 دقيقة)

  1. جعل اثنين منفصلة 1: 20 التخفيفات من الأوراق المالية الميتوكوندريا في المياه عالية النقاء. إضافة0.1٪ من تريتون 100-X لعينة واحدة ويصوتن ذلك على إعداد منخفض (765 واط، سعة 2). ترك التخفيف الآخرين على الجليد. العودة العينة إلى الجليد بعد صوتنة.
  2. إجراء فحص سينسيز سترات مع كل من غير sonicated وsonicated التخفيفات الميتوكوندريا باستخدام الفحص الطيفي كما هو موضح سابقا 11،12.
  3. تحديد النسبة المئوية للأغشية الميتوكوندريا سليمة باستخدام المعادلات التالية:
    (غير sonicated النشاط CS ÷ Sonicated النشاط CS) * 100


100- N (في المئة حققت من فوق)

6. الميتوكوندريا الجودة العزلة. الغربية التنشيف (الوقت: وفقا لبروتوكول مختبر)

  1. أداء النشاف الغربي على المحللة النسيج كله والميتوكوندريا معزولة كما هو موضح سابقا (12).
    ملاحظة: استخدام الأجسام المضادة الأولية لGAPDH (1: 1000 تخفيف في 5٪ BSA / TBS-T) وCOXIV (1: 1000 تخفيف في 5٪ الخالي من الدسمالحليب / TBS-T)، يليه مكافحة الماعز، والأرانب الأجسام المضادة الثانوية، على التوالي (1: 10000).

7. Respirometric الفحص تشغيل (الوقت: ~ 90 دقيقة)

  1. أداء المقايسات respirometric المطلوب باستخدام صفيحة ميكروسكوبية أساس O 2 تكنولوجيا قياس الاستهلاك كما هو موضح سابقا (انظر المادة مصاحب وروجرز وآخرون 8).
  2. تحديد نسبة السيطرة التنفسية (RCR) بتقسيم الدولة 3 في الدولة 4O (RCR) أو تقسيم 3U الدولة من قبل دولة 4O. استخدام أي منتصف (متوسط) نقطة أو أعلى (الدولة 3) وأدنى معدلات (4O الدولة) من آثار نقطة إلى نقطة عند تحديد RCR.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يخدم النشاط سينسيز سترات كمقياس للسلامة الغشاء منذ سينسيز سترات يقع في غشاء الميتوكوندريا الداخلية، وبالتالي يجب أن لا تكون موجودة في تعليق الميتوكوندريا مع الأغشية سليمة الشكل 1 يمثل النشاط سينسيز سيترات في عينات غير sonicated الميتوكوندريا مقارنة مع sonicated عينات من نفس العزلة. Sonicating نتائج الميتوكوندريا في زيادة ذات دلالة إحصائية في النشاط سينسيز سترات (P <0.01). الأهم من ذلك، كانت 92.5 ± 2.0٪ من الميتوكوندريا سليمة بعد العزلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الطرق الواردة في هذه الوثيقة تقدم وصفا مفصلا لإجراء العزلة الميتوكوندريا من كميات ضئيلة (~ 75-100 ملغ) من الماوس العضلات والهيكل العظمي. هذا الإجراء العزلة هي قادرة على تسفر عن أداء عالية، الميتوكوندريا النقي (~ 450 ميكروغرام) كما يتضح من O 2 معدلات الاستهلاك، والقيم RCR، أقصى النشاط سينسيز سترات وتعبير البروتين من immunoblotting. الأهم من ذلك، الميتوكوندريا المعزولة من هذا الإجراء يمكن أن تستخدم لفحوصات respirometirc متعددة مع صفيحة ميكروسكوبية أساس O 2 تكنو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

جورج روجرز هو موظف في Seahorse Bioscience الذي ينتج الأداة التي تم تعديل هذا البروتوكول من أجلها.

شكر وتقدير

دعم معهد Fralin Life Science Research و The Metabolic Phenotyping Core في Virginia Tech هذا العمل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بشكل أساسي الدهونسيجما ألدريتشA6003N / A
خالية من الأحماض - BSA
تريس / حمض الهيدروكلوريكPromegaH5123N / A
KCLسيجما ألدريتشP9541N / A
تريس قاعدةPromegaH5135N / A
EDTAسيجما ألدريتشE6511N / A
EGTAسيجما ألدريتشE4378N / A
السكروزسيجما ألدريتشS7903N / A
D-MannitolSigma Aldrich63559N / A
Trypsin-EDTA (0.25٪) ، الفينول الأحمرالحراري العلمي25200-056N / A
كلوريد الصوديوم
بلورات بيضاء أو مسحوق بلوري
& ge ؛ 99.0		فيشر ScientificBP3581N / A
كبريتات دوديسيل الصوديومSigma AldrichL3771 غير متاح
ديوكسي كولات الصوديومسيجما ألدريتشD6750 غير متاح
بولي أوكسي إيثيلين (12) نونيلفينيل الأثير ، متفرعةسيجما ألدريتش238651N / A
شفرات حلاقة أحادية الحافةفيشر Scientific12-640N / A
Falcon- 100 uM مصافي خلايا النايلونفيشر Scientific352360N / A
وقف البروتياز & كوكتيل مثبط الفوسفاتThermo Scientific1861284N / A
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل مع غطاء لولبيThermo Scientific3474N / A
حبات أكسيد الزركونيومفيشر ScientificC9012112N / A
الجسم المضاد GAPDH (1D4)سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-59540N / A
إشارات خلية الأجسام المضادة ل COXIV4844sأي بروتين غشاء داخلي للميتوكوندريا يكفي
حمار بيروكسيداز مترافق ، مضاد للأرانب IgG (H + L)جاكسون ImmunoResearh711-035-152N / A
بيروكسيداز مترافق ماعز ، مضاد للفأر IgG (H + L)Jackson ImmunoResearh115-001-003N / A
Triton-X100Sigma AldrichX100N / A
Pierce BCA Protein Assay Kit   ;Thermo Scientific23225N / A
حمض البيروفيك ، 98٪Sigma Aldrich107360يخزن في 4 درجات ؛ C ، درجة الحموضة إلى 7.4 مع KOH قبل استخدامها في الفحص
حمض السكسينيكSigma AldrichS9512يحفظ في درجة حرارة الغرفة ، درجة الحموضة إلى 7.4 مع KOH قبل استخدامه في الفحص
L (-) حمض الماليك ، BioXtra ، & ge ؛ 95٪Sigma AldrichM6413يحفظ في درجة حرارة الغرفة ، إلى 7.4 مع KOH قبل استخدامه في الفحص
L-Glutamic acidSigma AldrichG1251يحفظ في درجة حرارة الغرفة ، إلى 7.4 مع KOH قبل استخدامه في الفحص التنفسي ، إلى 7.4 مع KOH قبل استخدامه في الفحص
Palmitoyl L-carnitine chlorideSigma AldrichP1645يحفظ عند -20 درجة مئوية
Oligomycin A ، & ge 95٪ (HPLC)Sigma Aldrich75351Store at -20 & deg ؛ C
Carbonyl cyanide 4- (ثلاثي فلوروميثوكسي)Sigma AldrichC2920يخزن في 2-8 درجة ؛ ج
فينيل هيدرازون
& جي ؛ 98٪ (TLC) ، مسحوق [FCCP]
Antimycin A من streptomyces sp.متجر Sigma AldrichA8674عند -20 درجة ؛ C
الأدينوزين 5 & prime ;-ثنائي الفوسفات أحادي البوتاسيوم الملح المجفف [ADP]Sigma AldrichA5285يحفظ في -20 & درجة ؛ C ، إلى 7.4 مع KOH قبل استخدامه في الفحص
RotenoneSigma AldrichR8875يحفظ في درجة حرارة الغرفة
٪ التنفسي التنفسي التنفسي التنفسي التنفسي

المراجع

  1. Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
  2. Nicholls, D. G., Ferguson, S. Bioenergetics. , Academic Press. (2013).
  3. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, 1145-1159 (2012).
  4. Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).
  5. Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).
  6. Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).
  7. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).
  8. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6, e21746(2011).
  9. Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).
  10. Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).
  11. Hulver, M. W., et al. Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans. Cell Metab. 2, 251-261 (2005).
  12. Frisard, M. I., et al. Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).
  13. Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).
  14. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. JoVE. , (2011).
  15. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).
  16. Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).
  17. Asmann, Y. W., et al. Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia. Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).
  18. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة