يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس معدلات المبيدات الأيض في Dicot الأعشاب مع الفحص رفعه ليف

11.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53236

⸱

سبتمبر 7, 2015

 ,  , 
1Department of Crop Sciences, University of Illinois

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه المخطوطة كيف يمكن قياس معدلات التمثيل الغذائي لمبيدات الأعشاب بشكل فعال باستخدام الأوراق المستقطوعة من عشب ثنائي الفلقة ، وبالتالي تقليل التباين وإزالة أي آثار مربكة محتملة لامتصاص مبيدات الأعشاب أو نقلها التي يتم ملاحظتها عادة في فحوصات النبات بالكامل.

الملخص

< p class = 'jove_content'>من أجل عزل وتحديد معدلات التمثيل الغذائي لمبيدات الأعشاب بدقة في عشب ثنائي الفلقة الإلزامي ، القنب المائي (Amaranthus tuberculatus) ، قمنا بتطوير اختبار الأوراق المستأصل جنبا إلى جنب مع استراتيجية الاستنساخ الخضري لتطبيع امتصاص مبيدات الأعشاب وإزالة الإزاحة كعوامل مساهمة في مجموعات القنب المائي المقاومة لمبيدات الأعشاب (R) والحساسة (S). عادة ما تتضمن تحليلات الحركة الحيوية لمبيدات الآفات العضوية في النباتات تحديد الامتصاص والنقل (التسليم إلى الموقع المستهدف) ومصير التمثيل الغذائي والتفاعلات مع الموقع المستهدف. يعد استقلاب مبيدات الأعشاب معلمة مهمة للقياس في الحشائش المقاومة لمبيدات الأعشاب والمحاصيل التي تتحمل مبيدات الأعشاب ، وعادة ما يتم تحقيقه من خلال اختبارات النبات بالكامل باستخدام مبيدات الأعشاب ذات العلامات الإشعاعية. ومع ذلك ، فإن إحدى الصعوبات في تفسير معلمات الحركة الحيوية المشتقة من طرق النبات بأكمله هي أن النقل غالبا ما يتأثر بمعدلات التمثيل الغذائي لمبيدات الأعشاب ، نظرا لأن المستقلبات القطبية عادة لا تكون متحركة داخل النبات بعد تفاعلات إزالة السموم من مبيدات الأعشاب. تشمل مزايا البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة التحديد القابل للتكرار والدقيق والسريع لمعدلات تحلل مبيدات الأعشاب في مجموعات R و S ، وانخفاض كبير في كمية مبيدات الأعشاب المصنفة بالإشعاع المستهلكة ، وانخفاض كبير في المواد النباتية ذات العلامات الإشعاعية التي تتطلب مزيدا من المناولة والتخلص ، والقدرة على إجراء تجارب مبيدات الأعشاب ذات العلامات الإشعاعية في المختبر أو غرفة النمو بدلا من الدفيئة. مع استمرار تطور مقاومة مبيدات الأعشاب وانتشارها في مجموعات الحشائش ثنائية الفلقة في جميع أنحاء العالم ، فإن طريقة فحص الأوراق المستأصلة التي تم تطويرها ووصفها هنا ستوفر تقنية لا تقدر بثمن للتحقيق في المقاومة غير المستهدفة القائمة على الموقع بسبب المعدلات المعززة لعملية التمثيل الغذائي لمبيدات الأعشاب وإزالة السموم.

المقدمة

مقاومة مبيدات الأعشاب في الأعشاب الضارة يشكل تهديدا خطيرا للإنتاج العالمي من المواد الغذائية والألياف 1،2. حاليا، الآلاف من السكان مقاومة وbiotypes من أكثر من مائة أنواع الأعشاب في جميع أنحاء العالم وقد تم توثيق ودراسة 3. آلية الكبرى التي تمنح مقاومة مبيدات الأعشاب في النباتات هي تغيير مبيدات الأعشاب الجينات والبروتينات الموقع المستهدف، بما في ذلك الطفرات الوراثية التي تؤثر على حركية ملزمة مبيدات الأعشاب البروتين أو التضخيم من الجينات الموقع المستهدف 2. إزالة السموم الأيضية عبر الأنشطة مرتفعة من أكسيجيناز أحادية السيتوكروم P450 (P450) أو الجلوتاثيون S -transferase (GST) الإنزيمات هو آلية أخرى الذي يمنح مقاومة مبيدات الأعشاب في الأعشاب الضارة، والذي يختلف بعدة طرق من الآليات القائمة على الموقع المستهدف-2. المقاومة القائم على التمثيل الغذائي لها تداعيات كبيرة على ما إذا كانت تكاليف اللياقة البدنية النبات (ويعرف أيضا باسم عقوبات اللياقة البدنية) قد تنجم عن mechanis مبيدات الأعشاب المقاومةم، وكذلك بشأن احتمال وجود آلية إزالة السموم واحدة للتشاور المقاومة العابرة أو متعددة مبيدات الأعشاب في السكان الاعشاب 1،2،4. عموما، يمكن تقسيم عملية التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب في النباتات إلى ثلاث مراحل متميزة 5. وتشمل المرحلة الأولى تحويل مبيدات الأعشاب أو تفعيل مثل الهيدروكسيل P450 بوساطة من الحلقات العطرية أو مجموعات الألكيل، أو N - أو ردود فعل dealkylation O-، مما يؤدي إلى زيادة الاستقطاب ومبيدات الأعشاب الجزئي إزالة السموم 5،6. أدخلت حديثا المجموعات الوظيفية في المرحلة الأولى يمكن أن توفر مواقع الربط لاقتران إلى انخفاض الجلوتاثيون التي كتبها GSTs أو إلى جلوكوز عن طريق glycosyltransferases UDP التي تعتمد في المرحلة الثانية 5،7. على سبيل المثال، والأيض الأولي الرئيسي للprimisulfuron-الميثيل في الذرة هو هيدروكسي primisulfuron ميثيل 8، والتي يمكن استقلاب أيضا على هيدروكسي primisulfuron-جلوكوسيدي (المرحلة الثانية) ومن ثم نقلها إلى فجوة للتخزين طويل الأجل أو زيادة الأيض المؤيدcessing 5،6 (المرحلة الثالثة).

Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) هي التي يصعب السيطرة عليها، dicot الأنواع السنوية الاعشاب التي تعيق إنتاج الذرة (ذرة شامية) وفول الصويا (جليكاين ماكس)، والقطن (الكرسف أزغب) في الولايات المتحدة. ومما يسهل على درجة عالية من التنوع الجيني للwaterhemp التي لها البيولوجيا ثنائي الجنس والمسافات الطويلة تلقيح الرياح، ومحطة waterhemp أنثى واحدة يمكن أن تنتج ما يصل إلى مليون البذور 9. هذه البذور صغيرة وتنتشر بسهولة، والتي تمنح بشكل طبيعي waterhemp مع آلية تشتت فعالة. Waterhemp يعرض إنبات مستمرة طوال موسم النمو 9، وبذوره قادرة على الإنبات بعد عدة سنوات من السكون. Waterhemp هو نبات C 4 التي تمتلك معدل نمو أعلى من معظم الأعشاب ذات الأوراق العريضة في النظم الزراعية الصالحة للزراعة 10. بالإضافة إلى ذلك، العديد من السكان waterhemp مقاومة لفام متعددةilies مبيدات الأعشاب 3.

عدد سكانها waterhemp (المعين MCR) عن ولاية إلينوي مقاوم لل4-هيدروكسي-فينيل بيروفات دي أكسيجيناز (HPPD) -inhibiting مبيدات الأعشاب 11، مثل mesotrione، فضلا عن الأترازين وسينسيز acetolactate (ALS) -inhibiting مبيدات الأعشاب، بما في ذلك primisulfuron ميثيل ، نظرا لعدم استهداف الموقع الآليات القائمة 12،13. عدد السكان مختلفة من waterhemp المعينة ACR 14، وهو primisulfuron مقاومة للالميثيل (بسبب طفرة في جين ALS)، ولكن حساسية لmesotrione مقاومة للالأترازين، ويبلغ عدد سكانها waterhemp المعينة WCS 14 التي تعتبر حساسة لprimisulfuron ميثيل، استخدمت mesotrione، والأترازين بالمقارنة مع MCR في بحث سابق لدينا 12 والتجارب الحالية (ملخصة في الجدول 1). لم الدراسات الأولية لم يكشف تغييرات في مستويات التسلسل الجيني HPPD أو التعبير، أو انخفاض امتصاص mesotrione، في MCRالسكان بالمقارنة مع السكان الحساسة mesotrione 12. ومع ذلك، دراسات التمثيل الغذائي مع النباتات الكاملة أظهروا مستويات أقل بكثير من mesotrione الأم مبيدات الأعشاب في MCR مقارنة مع ACR وWCS، التي ترتبط مع ردود المظهري السابقة لmesotrione 11،12.

Waterhemp السكان الاختصار النمط الظاهري لMesotrione آلية Mesotrione المقاومة النمط الظاهري لPrimisulfuron آلية Primisulfuron المقاومة
ماكلين مقاطعة مقاومة لل MCR مقاوم التمثيل الغذائي* مقاوم التمثيل الغذائي
آدامز مقاطعة مقاومة لل ACR Sensitإيف - مقاوم طفرة في الموقع المستهدف في ALS 14
مقاطعة وين-حساس WCS حساس - حساس -

* آليات المقاومة غير المستهدفة الموقع، بخلاف تعزيز عملية التمثيل الغذائي، ويمكن أيضا أن تمنح المقاومة mesotrione في عدد السكان MCR 12.

الجدول 1: وصف السكان waterhemp عن ولاية إلينوي المستخدمة في هذه الدراسة.

بالإضافة إلى تحديد معدلات الأيض مبيدات الأعشاب في الشتلات waterhemp سليمة، تم وضع المنهج التجريبي مختلفة ويعملون في بحثنا السابق للتحقيق في عملية التمثيل الغذائي باستخدام waterhemp رفعه ورقة فحص 12 فضلا عن مختلف مثبطات P450 (على سبيل المثال، tetcyclacis والملاثيون). وقد تم تكييف هذه الطريقة على وجه التحديد لwaterhemp من PREVIالتحقيق الأوس الأيض-primisulfuron الميثيل في الذرة رفعه يترك 15، منذ لم يتم إبلاغ ورقة فحص المستأصل لإجراء البحوث الأيض مبيدات الأعشاب في مصنع dicot. تم الحشرات الملاثيون organophophosate كثيرا ما تستخدم في الجسم الحي في المختبر البحوث مبيدات الأعشاب الأيض تشير إلى تورط P450 16. على سبيل المثال، والتسامح، والتمثيل الغذائي السريع لmesotrione في الذرة ومن المقرر أن P450 المحفزة الهيدروكسيل الحلبة، والتي تم التحقق عندما الملاثيون زيادة الحساسية الذرة إلى mesotrione 17. وبالمثل، تحول دون الملاثيون التمثيل الغذائي للALS المانع primisulfuron-الميثيل في الذرة رفعه يترك 15. والميزة الرئيسية لهذه التقنية ورقة رفعه هو أن البيانات التي تم إنشاؤها مستقلة عن أنماط النبات كامل النبات، عاملا هاما في الاعتبار عند تقييم التمثيل الغذائي للالنظامية ومبيدات الأعشاب مبيد في النباتات. ونتيجة لذلك، وهذا الأسلوب يسمح الكمي ويحلل التمثيل الغذائي النوعي للتركيز على ورقة واحدة تعالج 12.

استراتيجية استنساخ الخضري، في تركيبة مع بروتوكول رقة المستأصل، استخدمت سابقا في waterhemp لإجراء دراسات عملية التمثيل الغذائي 12. ونظرا لطبيعة التهجين من waterhemp (منفصلة للذكور والإناث النباتات)، ودرجة كبيرة من التنوع الجيني داخل الأنواع Amaranthus ثنائي الجنس 9، يضمن هذا البروتوكول الذي تم تحليل الشتلات waterhemp وراثيا متطابقة ضمن التجارب وقتا بالطبع. توضح هذه المقالة الأداة المساعدة للأسلوب ورقة رفعه لقياس معدلات التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب في الأعشاب الضارة dicot (waterhemp). تم تحديد كمية المبيدات الأم تبقى في كل نقطة زمنية (الشكل 1) من غير الخطية أقل التحليل الساحات الانحدار، وكان مناسبا مع منحنى الدرجة الأولى بسيطة لتقدير الوقت ل50٪ من مبيدات الأعشاب استيعابها لتتحلل ( DT 50). ممثليتم عرض الاستشرابية من عكس المرحلة العالية الاداء اللوني السائل (RP-HPLC) للALS-المقاومة والسكان waterhemp -sensitive، التي تشير إلى اختفاء مبيدات الأعشاب الأم وتشكيل يصاحب ذلك من المستقلب القطبي (الصورة) خلال دراسة وقتا بالطبع (الشكل 2). محور مقالنا هو وصف وإثبات فائدة من ورقة فحص المستأصل في تركيبة مع طريقة الاستنساخ النباتي لتحديد معدلات دقيقة وقابلة للتكرار في استقلاب مبيدات الأعشاب في محطات dicot، وذلك باستخدام بشكل موحد وصفت حلقة (URL- 14 C) مبيدات الأعشاب في ثلاثة السكان waterhemp التي تختلف في ردود كامل مصنع لHPPD- ومبيدات الأعشاب تثبيط ALS (الجدول 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. المواد النباتية شروط النمو، والخضري الاستنساخ

ملاحظة: تم التحقيق ثلاثة السكان waterhemp في هذا البحث: MCR (من مقاطعة ماكلين، IL)، ACR (من مقاطعة آدمز، IL)، وجمعية حماية الحياة البرية (من مقاطعة وين، IL) (الجدول 1).

  1. جمع وتعليق بذور waterhemp في 0.1 ز L -1 أجار: المحلول المائي في 4 درجة مئوية لمدة 30 يوما على الأقل لتعزيز الإنبات. ملاحظة: بعض السكان waterhemp هي نائمة، ولكن هذه الخطوة تساعد على التغلب على السكون وجعل البذور تنبت بشكل موحد.
  2. تنبت بذور كل السكان waterhemp (كما في الجدول رقم 1) في 12 × 12 سم الصواني التي تحتوي على وسيلة بوتينغ في الاحتباس الحراري.
    1. الحفاظ على الظروف المسببة للاحتباس الحراري في 28/22 ° C درجات الحرارة اليوم / ليلة خلال الفترة الضوئية 16/8 الساعة 12.
    2. تكملة الضوء الطبيعي في الاحتباس الحراري مع الضوء من مصابيح هالوجين الزئبق لتوفير الحد الأدنى من 500 ميكرومول م -2 تدفق ثانية -1 الفوتون على مستوى مظلة النبات.
  3. ظهرت زرع الشتلات عندما تكون 2 سم إلى 80 سم 3 الأواني في الاحتباس الحراري.
  4. شتلات الزرع إلى 950 سم 3 الأواني التي تحتوي على 3: خليط 1 من مزيج بوتينغ: 1: 1 التربة: الخث: الرمال عندما الشتلات هي 4 سم. إضافة 5 غرام من حبيبات الأسمدة بطيئة الافراج على كل وعاء وتخلط مع هذا الخليط التربة.
  5. قطع وإزالة تبادل لاطلاق النار النسيج الإنشائي القمي الذي يحتوي على أصغر الأوراق ثلاثة من 7 سم النباتات طويل القامة للقضاء على هيمنة قمي.
    ملاحظة: هذه الخطوة يضمن أن كل محطة سوف تنمو ما يكفي من يطلق النار على 3 سم إبطي لاستنساخ.
  6. المكوس خمسة براعم الإبطية (3 سم في الطول) عندما الشتلات هي حوالي 14 سم من كل السكان waterhemp (كما في الجدول رقم 1). إزالة غالبية الأوراق على هذه البراعم الإبطية لتقليل فقدان الماء على مزيد من التعامل معها، ولكن الإبقاء على أصغر اثنين من يترك للسماح للمزيد من النمو على زرع.
    ملاحظة: التعامل مع بعناية ومحاولة عدم الاضرار يطلق النار عند إزالة الأوراق. تسمية كل محطة مع حصة.
  7. زرع إبطي يطلق النار في 80 سم 3 قدور (الشتلات واحدة في وعاء) في بوتينغ المتوسطة، وهو نفس الوسيلة المستخدمة للإنبات. يجب أن تكون مشبعة بوتينغ المتوسطة في البداية حتى شكل جذور في غرفة النمو، ثم الحفاظ على رطوبة ثابتة ومكان الأواني في غرفة النمو لمدة 7 أيام لإقامة الجذور.
    ملاحظة: النباتات هي حساسة جدا في هذه المرحلة، وينبغي ألا أكدت.
    1. الحفاظ على ظروف غرفة نمو في 28/22 ° C درجات الحرارة اليوم / ليلة خلال الفترة الضوئية 16/8 الساعة 12.
    2. مزيج من هاج والفلورية المصابيح يمكن استخدامها لتوفير الضوء في غرفة النمو وأن يحقق ما لا يقل عن 550 ميكرومول م -2 ثانية -1 تدفق الفوتون في مصنع مستوى المظلة 12.
  8. زراعة مرة أخرى إلى 950 سم 3 قدور (الشتلات واحدة في وعاء) جontaining 3: خليط 1 من مزيج بوتينغ: 1: 1 التربة: الخث: الرمال (تشمل أيضا 5 ز بطيئة الافراج عن حبيبات الأسمدة) عند محطات المستنسخة هي 4 سم، ثم نقل مرة أخرى إلى المسببة للاحتباس الحراري.
  9. استنساخ النباتات مرة ثانية باستخدام نفس الأسلوب هو موضح أعلاه (أي، كرر الخطوات 1،5-1،8، ومن ثم الانتقال إلى الخطوة 2.1). لدراسة وقتا بالطبع النموذجية، وتوليد الحيوانات المستنسخة من لا يقل عن ستة محطات مستقلة عن بعضها السكان waterhemp وتسجيلها على شكل خطوط MCR 1-6 و1-6 وACR WCS 1-6.
    1. إنشاء ستة على الأقل "الأم" خطوط نسيلي متميزة من أجل تكرار التجربة وكاف تمثل التنوع الوراثي داخل كل السكان waterhemp.
    2. اعتمادا على عدد النقاط الزمنية سيتم تحليلها، وتوليد ما يكفي من الحيوانات المستنسخة فرعية من كل "الأم" خط نسيلي لإجراء دراسة وقتا بالطبع.

2. إجراء دراسة الأيض مع رفعه Waterhemأوراق ص

  1. استئصال الثالثة وأصغر الأوراق (2-3 سم في الطول، وتشمل 0.5 سم من سويقات المرفقة) عندما النباتات waterhemp المستنسخة هي 10-12 سم لعملية التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب وDT 50 تحليلها.
  2. أعناق قطع ورقة من كل مصنع waterhemp مرة ثانية (ضمان 0،3 سم من سويقات تبقى) تحت سطح الماء، ووضع هذه القطع ينتهي إلى 1.5 مل قارورة بلاستيكية (ورقة واحدة في قارورة) 15.
    ملاحظة: القطع مرة ثانية تحت الماء يمنع فقاعات الهواء من تشكيل ويسد الأوعية الخشب.
    1. أولا، تزج جزئيا أوراق رفعه مع قطع سويقات العازلة في مرحلة ما قبل الحضانة (200 ميكرولتر) من 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 6) لمدة 1 ساعة.
    2. ثانيا، نقل كل ورقة إلى 1.5 جديد مل قارورة تحتوي على وجود مخزن مؤقت الحضانة (200 ميكرولتر) من 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 6)، بالإضافة إلى 150 ميكرومتر [URL- 14 C] مبيدات الأعشاب، واحتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ل السماح لامتصاص مبيدات الأعشاب إلى الأوراق.
      ملاحظة: كل 14 C-mesotrione و 14 C-primisulfuron-الميثيل في دراساتنا في أنشطة محددة من حوالي 20 ميلي كوري ملمول -1. كل من نشر وامتصاص من خلال مجرى الخشب النتح تساهم في كمية المبيدات تناولها لكل ورقة.
      ملاحظة: تأثير مثبطات الأيض على عملية التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب يمكن تحديدها عن طريق تعديل الخطوات 2.2.1 و2.2.2 أعلاه. إضافة 100 ميكرومتر المانع إلى المخزن المؤقت مرحلة ما قبل الحضانة والسماح احتضان لمدة 2 ساعة، ثم نقل إلى عازلة الحضانة مع مبيدات الأعشاب، ومرة ​​أخرى إضافة 100 ميكرومتر المانع. على سبيل المثال، الملاثيون وtetcyclacis تمنع بعض الأنشطة السيتوكروم P450 في النباتات 15-17.
    3. غسل جزء مغمورة من أوراق رفعه مع الماء منزوع الأيونات ونقل أوراق رفعه إلى ربع قوة Murashige وسكوغ (MS) أملاح الحل (500 ميكرولتر) ل0 ساعة، 5 ساعة، 11 ساعة، 23 ساعة، أو 35 ساعة، على التوالي، في غرفة النمو لدراسة التمثيل الغذائي وقتا بالطبع.
  3. الحصاد عن طريق إزالة إجازةالصورة من حل الحضانة في نقطة زمنية مناسبة ويدويا طحن كل الأنسجة ورقة في النيتروجين السائل باستخدام أنبوب البولي بروبلين (15 مل)، والزجاج مدقة.
  4. استخراج مبيدات الأعشاب رديولبلد وعناصره من كل ورقة مع 7 مل من 90٪ الأسيتون مع الخالط الأنسجة مختبر في نفس أنبوب البولي بروبلين على النحو الوارد أعلاه. شطف الخالط الأنسجة مع 7 مل إضافية من 90٪ الأسيتون، ومواصلة التجانس حتى يتم حطمت الأنسجة تماما (عادة حوالي 2 دقيقة). ملاحظة: 90٪ الأسيتون يمكن أن تستخدم لاستخراج معظم الأعشاب من الأنسجة النباتية. ومع ذلك، إذا كان هذا الأسلوب غير قادر على استخراج أكثر من 90٪ من المركبات رديولبلد استيعابها، ثم 90٪ الميثانول أو 90٪ الأسيتونتريل يمكن أن تكون بديلا مثل المذيبات الاستخراج.
  5. تسمية 90٪ مقتطفات الأسيتون (14 مل الكل) وتخزينها في -4 درجة مئوية لمدة 16 ساعة للسماح لاستخراج إضافية تحدث.
    ملاحظة: بعد هذه استخراج أوراق المعالجة، ومقدار راد المستخلصioactivity عادة لا يقل عن 98٪ من المركبات رديولبلد تستوعبها ورقة المعالجة. النشاط الإشعاعي غير القابل للاستخراج (بقايا ملزمة) في أوراق رفعه متوسط ​​0.3٪ فقط في كل نقطة زمنية في دراستنا السابقة 12، ولكن يمكن أن تختلف هذه الكمية وفقا لمبيدات الأعشاب المستخدمة ونقطة زمنية فحصها.
  6. يتم الحصول على عينات الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة والتركيز supernatants عند 40 درجة مئوية مع المبخر الدوار حتى الحجم النهائي من 0.5 مل. نقل هذا الحجم إلى أنبوب بلاستيكي 2.0 مل.
  7. إضافة الأسيتونتريل: الماء (1: 1، من حيث الحجم) لضبط الحجم النهائي من المستخلصات النباتية إلى 1.25 مل وإعادة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة لإزالة أي الجسيمات.
  8. قياس مجموع النشاط الإشعاعي في قسامة أخذت من كل عينة (DPM ميكرولتر -1) من خلال التلألؤ السائل الطيفي (LSS) 12 وتطبيع كميات من [14 C المسمى] مركبات حقن لتحليل HPLC (على سبيل المثال، 10،000 جميع DPM / عينة / المدى) حتى ص محاور، سوف تكون موحدة بين عينات عندما الرسوم البيانية النتائج.

3. تحليل HPLC من مبيدات الأعشاب التمثيل الغذائي في أوراق رفعه

ملاحظة: حل مجموع النشاط الإشعاعي استخراجها إلى مبيدات الأعشاب ومبيدات الأعشاب الأم الأيض باستخدام الظروف RP-HPLC التالية 12.

  1. أداء RP-HPLC مع C 18 عمود (4.6 × 250 ملم، 5 ميكرون حجم الجسيمات لHPLC التحليلي) بمعدل تدفق 1 مل دقيقة -1 بالنسبة لمعظم الأعشاب غير القطبية.
    ملاحظة: يمكن أيضا أعمدة C 4 أو C 12 RP-HPLC أن تستخدم لتحسين فصل مبيدات الأعشاب الأم من عناصره. مرشح ما قبل العمود و / أو عمود الحرس يمكن أيضا أن تستخدم لحماية وإطالة عمر العمود RP.
    1. استخدام الطور المتحرك التالية لRP-HPLC: شاطف A، حمض الفورميك 0.1٪ (ت / ت) في الماء، وشاطف B 100٪ HPLC الصف الأسيتونتريل.
      ملاحظة: يمكن أيضا HPLC الصف الميثانول أن تستخدم شركةuent B لحل مركبات أكثر القطبية والأيض، ولكن كن على علم بأن قد تتغير أيضا الاحتفاظ مرات.
      ملاحظة: الملف الشخصي شطف استخدامها لحل mesotrione أو primisulfuron ميثيل من نواتج الأيض القطبية في بحثنا 12 غير: الخطوة 1، A: B (4: 1، V / V) لA: B (3: 2، ت / ت ) في الانحدار الخطي (12 دقيقة). الخطوة 2، A: B (3: 2، ت / ت) لA: B (3: 7، ت / ت) في الانحدار الخطي (5 دقائق)؛ الخطوة 3، A: B (3: 7، ت / ت) لA: B (1: 9، ت / ت) في الانحدار الخطي لمدة 2 دقيقة (التي تضم ما مجموعه 19 دقيقة).
      ملاحظة: قد تحتاج التدرجات والخطوات isocratic إلى تعديل بناء على الخصائص الفيزيائية للمواد الأم من أجل تحسين دقة.
    2. اتبع الخطوات الانحدار الخطي أعلاه مع A: B (1: 9، ت / ت) لA: B (4: 1، V / V) في الانحدار الخطي (3 دقائق) وA: B (4: 1، V / V) خطوة isocratic (لمدة 2 دقيقة على الأقل) لإعادة توازن العمود RP-من قبل حقن مستخلص المقبل 12.
  2. كشف وتصور المركبات رديولبلد مع تدفق Scintillation محلل. تسجيل كمية من مبيدات الأعشاب الأم المتبقية في كل عينة كنسبة مئوية من إجمالي النشاط الإشعاعي في كل عينة (الكشف عن وكميا من التلألؤ محلل تدفق وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) لتحديد معدلات الأيض مبيدات الأعشاب في كل السكان waterhemp أثناء الوقت.

4. الإجراءات الإحصائية

  1. ترتيب العلاجات في تصميم عشوائية تماما (أو ترتيب آخر مناسب للتحليل الإحصائي).
  2. أداء تجربتين مستقلة مع كل معاملة، تتألف من ثلاثة مكررات البيولوجية لكل تجربة. وتشمل التجارب المستقلتين ستة مكررات البيولوجية في المجموع. إذا كان تأثير التجربة هو غير هام (α = 0.05)، والجمع بين وتحليل البيانات من كل تجربة مستقلة. إذا كان تأثير التجربة هو كبير، ثم تحليل كل تجربة على حدة.
    ملاحظة: تضمين أول ثلاث مكررات البيولوجية طن التجربة 1 ومكررات البيولوجية الثلاثة المقبلة في تجربة 2. كل تكرار البيولوجي يمثل "الأم" متميزة خط نسيلي المستمدة من كل السكان (MCR 1-6 و1-6 ACR، وWCS 1-6) بحيث يكون لكل زمنيا تحليل بالطبع يستخدم النباتات وراثيا متطابقة. وتشمل التجارب المستقلتين ستة مكررات البيولوجية في المجموع، والذي يسمح للتمثيل كاف من التباين الوراثي والاصرار لمتوسط ​​DT 50 لكل السكان waterhemp.
  3. تحليل البيانات مع غير الخطية تحليل الأقل الساحات الانحدار ويصلح لهم مع منحنى الدرجة الأولى بسيطة لتقدير DT 50 ق. توضح المعادلة أدناه نموذج:
    figure-protocol-1
  4. حيث في هذا النموذج ذ يمثل النسبة المئوية للمبيدات الأعشاب الأم المتبقية في الزمن t، μ ط هو DT 50 لكلwaterhemp السكان ط، والمعلمة C 0 هو المبلغ المقدر من الأم مبيدات الأعشاب الحاضر في تي = 0 12.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم الكشف عن اختلافات كبيرة في معدلات الأيض mesotrione بين إما WCS أو ACR وMCR (الشكل 1). في كل نقطة زمنية، قد MCR استقلاب mesotrione بسرعة أكبر من اثنين من السكان الحساسة mesotrione، WCS وACR، الذي يرتبط مع الردود السابقة المظهرية كامل النبات 11. عن طريق الاستنساخ ما يكفي من النباتات من محطة الوالدين واحد من كل مجموعة من السكان، والتمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب التحليلات وقتا بالطبع موحدة وقابلة للتكرار بسبب عدم وجود التباين الوراثي داخل كل دورة زمنية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

طريقة رفعه ورقة الموصوفة هنا تم استخدامها سابقا في البحث الأيض primisulfuron في الذرة يترك 15، ولكن تظهر نتائجنا أن هذا البروتوكول هو أيضا فعالة ودقيقة، وقابلة للتكرار لقياس التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب في أنواع الأعشاب dicot 12. والميزة الرئيسية لهذه التقنية ورقة رفعه مقارنة مع الدراسات كامل النبات هي أن ورقة رفعه مستقلة عن أنماط النبات كامل النبات مبيد ومبيدات الأعشاب النظامية أو الاختلافات في امتصاص مبيدات الأعشاب بين النباتات أو السكان. وبالإضافة إلى ذل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر ويندي تشانغ وأوستن توم وجاكي جاني وإيرين ليملي وبريتاني جاني للمساعدة في نمو النبات واستخراجه ، والدكتور أناتولي ليجين للمساعدة في التحليلات الكروماتوغرافية ، و Syngenta Crop Protection على التمويل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AgarSigma-AldrichA1296للبذور قبل الإنبات
تأصيص متوسطSun Gro Horticulture49040233لنمو النبات
NutricoteAgrivert   ؛TOTAL BLEND 13-13-13 T100سماد بطيء الإطلاق
غرفة النمو E15Controlled Environments Limited20207زراعة النبات
قاعدة تريسفيشر ScientificBP152-500العازلة للأوراق المقطوعة
حمض الهيدروكلوريك (المركزة)A144500فيشر العلميضبط درجة الحموضة لأملاح
Murashige و Skoog (MS)  Sigma-AldrichM0404حضانة الأوراق المقطوعة
أوراق الميثانولفيشر ScientificA452-4بعد الحضانة
AcetoneSigma-Aldrich179124المستخلصات النباتية
الأسيتونيتريل (درجة HPLC) ماكرونفاين كيماوياتMKH07610HPLC المرحلة المتنقلة
حمض الفورميك   ؛MK259205 تحليلي Mallinckrodtتحمض المرحلة المتنقلة ، جهاز
الطرد المركزي الصغير، Eppendorf5417R1.5 أو 2.0 مل ، أنابيب
الطرد المركزي (التحكم في درجة الحرارة)، أنابيب Eppendorf5810R15 أو 50 مل ،
أنبوب الطرد المركزي من مادة البولي بروبيلين، Corning Inc.43079015 مل ،
مبخر دوارB & Uuml ؛ عينات مصنع التركيزR200
قياس طيف التلألؤ السائل (LSS)Packard Instruments104470قياس 14< / sup>C
الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداءPerkin ElmerN2910401حل مستقلبات مبيدات
الأعشاب محلل تلألؤ التدفق LabLogic1103303لتحليل HPLC ل عمود 14< / sup>C
Hypersil Gold C18 column Thermo-Scientific03-050-522 المرحلة العكسية
كوكتيل Ultima-Flo MPerkin Elmer6013579لمحلل التدفق التلألؤ
كوكتيل الوميض (ScintiVerse BD)فيشر ScientificSX18ل LSS ؛
الخالط المختبريKinematicaCH-6010 & nbsp ؛تجانس عينات الأوراق
يغسل معقم CHI نظام القابل للتحلل

المراجع

  1. Yu, Q., Powles, S. Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production. Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).
  2. Powles, S. B., Yu, Q. Evolution in action: plants resistant to herbicides. Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).
  3. Heap, I., et al. Global perspective of herbicide-resistant weeds. Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).
  4. Délye, C., et al. Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration. Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).
  5. Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants. Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).
  6. Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression. Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).
  7. Siminszky, B. Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism. Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).
  8. Fonné-Pfister, R., et al. Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize. Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).
  9. Steckel, L. E. The dioecious Amaranthus spp.: here to stay. Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).
  10. Horak, M. J., Loughin, T. M. Growth analysis of four Amaranthus species. Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).
  11. Hausman, N. E., et al. Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States. Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).
  12. Ma, R., et al. Distinct detoxification mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp. Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).
  13. Guo, J., et al. Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus). Weed Science. in press, (2015).
  14. Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action. Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).
  15. Kreuz, K., Fonné-Pfister, R. Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism. Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).
  16. Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R. Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. Ortiz de Montellano, P. R. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. 247-322 (2005).
  17. Hawkes, T. R., et al. Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn. Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference – Weeds. 2, 563-568 (2001).
  18. Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations. Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).
  19. Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population. Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).
  20. Iwakami, S., et al. Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon. Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

مجتمعات عشب الماءمبيد أعشاب مُوسوم إشعاعياًتحليل كروماتوغرافيا السائل عالية الأداء بالطور المعكوسالكيمياء الحيوية النباتيةتحليل الخطوط النسليةاستخلاص المستقلباتدراسة المسار الزمنيقيم DT 50
قياس معدلات المبيدات الأيض في Dicot الأعشاب مع الفحص رفعه ليف
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.