Method Article

مقارنة الانجذاب من البروتينات ملزم GTPase باستخدام فحوصات المنافسة

DOI:

10.3791/53254

⸱

October 8th, 2015

 , 
1School of Biochemistry, University of Bristol, 2Department of Biomedical Science, University of Sheffield

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقارن هذا البروتوكول الصلات النسبية للشركاء الملزمين لعائلة Rho-family GTPases، بما في ذلك Rac1. في الجسم الحي ، تتنافس البروتينات المرتبطة ب Rac1 على واجهة ربط واحدة ، يتم إملاء شكلها بواسطة نيوكليوتيدات مرتبطة. النيوكليوتيدات مهمة ويصعب التحكم فيها تجريبيا ، بسبب ارتفاع معدل التحلل المائي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، نوضح طريقة لمقارنة المنافسة بين البروتينات المرتبطة ب GTPase. مثل هذا النهج مهم لتحديد قدرات ربط GTPases لسببين: حقيقة أن جميع التفاعلات تنطوي على نفس وجه GTPases تعني أنه يجب النظر في أحداث الربط في سياق المنافسين ، وحقيقة أنه يجب أيضا التحكم في النيوكليوتيدات المرتبطة تعني أن الأساليب التقليدية مثل الترسيب المناعي غير مناسبة للكيمياء الحيوية GTPase. يعتمد الاختبار على استخدام البروتينات المنقاة. يتم استخدام Rac1 المنقى الثابت على الخرز كبروتين طعم ، ويمكن تحميله بالناتج المحلي الإجمالي ، وهو نسخة غير قابلة للتحلل المائي من GTP أو خالية من النوكليوتيدات التركية ، بحيث يمكن التحكم في مرحلة الإشارات المراد التحقيق فيها. يتم تنقية البروتينات الملزمة التي سيتم فحصها من خلايا الثدييات ، للسماح بالطي الصحيح ، عن طريق علامة GFP. يعد استخدام نفس العلامة على كلا البروتينين أمرا مهما لأنه لا يسمح فقط بالتنقية والشطف السريع ، ولكنه يسمح أيضا باكتشاف كلا المنافسين بنفس الجسم المضاد أثناء الشطف. هذا يعني أنه يمكن تحديد الكميات النسبية للبروتينين المرتبطين بدقة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تنظيم الهيكل الخلوي للأكتين الذي يحدد شكل خلايا الثدييات وقطبيتها وخصائصها المهاجرة بواسطة عائلة Rho من GTPases الصغيرة. تشتمل GTPases من عائلة Rho على RhoA الذي يحفز تقلص الهيكل الخلوي ، و Rac1 الذي يحفز تفرع الأكتين ونتوء الغشاء ، و Cdc42 الذي له تأثيرات مماثلة على بلمرة الأكتين ل Rac1 ويسبب تكوين filopodia 1،2. يتم تحديد نشاط إشارات GTPase عن طريق ربط النيوكليوتيدات ، والذي يتحكم في تقلص واسترخاء حلقات المفتاح I و II التي تتوسط تفاعلات البروتين والبروتين مع كل من المنظمين والمؤثرين. تعمل GTPases المرتبطة بالجوانوزين 5'-ثلاثي الفوسفات (GTP) على تنشيط المؤثرات النهائية ، في حين أن الشكل المرتبط ب Guanosine 5'-diphosphate (GDP) غير نشط. في الخلية ، تسمح دورات التحلل المائي GTP وتبادل النيوكليوتيدات بالدوران السريع لإشارات GTPase الضرورية لديناميكيات الهيكل الخلوي. يتم تنظيم دوران النيوكليوتيدات من خلال ثلاث آليات. تعمل عوامل تبادل نوكليوتيدات الجوانين (GEFs) على استقرار GTPase الخالي من النوكليوتيدات ، مما يحفز تبادل الناتج المحلي الإجمالي ل GTP ، وبالتالي تحفيز نشاط إشارات GTPase 3،4. تحفز البروتينات المنشطة ل GTPase (GAPs) التحلل المائي ل GTP إلى الناتج المحلي الإجمالي ، وبالتالي تثبيط نشاط إشارات GTPase 5. تحجب جزيئات العزل مثل منظم تكثيف الكروماتين 2 (RCC2) ومثبطات تفكك نوكليوتيدات الجوانين (GDIs) حلقات التبديل وفي حالة GDIs تزيل GTPase من الغشاء عن طريق التفاعل مع ذيل prenyl 6،7. تتفاعل كل فئة من الفئات الثلاث من الجزيئات التنظيمية مع حلقات التبديل ، كما تفعل المؤثرات النهائية وبعض منظمات الاتجار مثل coronin-1C 7. الغرض من هذا البروتوكول هو قياس المنافسة على موقع ربط المحول I / II بين المنظمين المفترضين وجزيئات الإشارات النهائية. وتجدر الإشارة إلى أن فحوصات المنافسة تختبر الارتباط بموقع ربط مشترك ، بحيث لا يكون هذا البروتوكول مناسبا لاختبار التفاعلات مع المواقع الأخرى ، مثل ربط GDIs بذيل prenyl.

< p class = 'jove_content'> إن دقة اختلافات التشكل بين الأشكال النشطة وغير النشطة ، جنبا إلى جنب مع الطبيعة المتقابلة للنيوكليوتيدات المرتبطة ، جعلت دراسة أحداث ربط GTPase أمرا صعبا. يعني دور النيوكليوتيدات المرتبطة أن فحوصات الربط التقليدية مثل الترسيب المناعي أو رنين البلازمون السطحي ليست مناسبة تماما للتحقيق ، حيث لا يمكن التحكم في النيوكليوتيدات. وتتفاقم هذه العقبة بسبب التداخل في مواقع الربط لمرفقات البيئة العالمية، وGAPs، والمؤثرات، وجزيئات العزل، وجزيئات الاتجاهر، مما يجعل من الصعب تفسير بيانات الربط لتفاعل واحد في سياق المنافسة التي ستحدث في الخلية. يتعرض الترسيب المناعي ، على وجه الخصوص ، للخطر بسبب المنافسة بين الشركاء الملزمين ، لأنه في ظل ظروف خلوية معينة ، قد يتم تحديد شريك ملزم على حساب جميع الآخرين ، بينما في ظل ظروف أخرى ، قد يهيمن شريك آخر. تعد الطبيعة الديناميكية لإشارات GTPase ضرورية لوظيفة GTPase ويجب أخذها في الاعتبار عند تحليل العلاقات بين تفاعلات الربط للمنظمات المختلفة. في الواقع ، وصفنا مؤخرا مسارا يعتمد بشكل كبير على الالتزام التنافسي. حددنا coronin-1C على أنه جزيء تهريب يرتبط بحلقات التبديل الخاصة ب GDP-Rac1 7. وفي المناطق التي يقل فيها نشاط مرفق البيئة العالمية، سيهيمن الاتجار، مما يؤدي إلى إزالة Rac1 من تلك المناطق. ومع ذلك ، عندما يتم تسليم Rac1 إلى مناطق الخلية التي يكون فيها نشاط GEF مرتفعا ، فإن GEF سيتفوق على coronin-1C ، وبالتالي تنشيط Rac1 ومنع إزالة Rac1 بوساطة coronin-1C من تلك المنطقة. يذهب النموذج إلى أبعد من ذلك ، لأن عمل مرفق البيئة العالمية يتبادل الناتج المحلي الإجمالي مقابل GTP ، مما يحول التوازن إلى أبعد من Coronin-1C. وبالتالي ، يمكن تفسير نشاط Rac1 بالكامل من حيث المنافسة والتقارب النسبي.

في هذا البروتوكول ، نصف طريقة لمقارنة الصلات النسبية لشركاء الربط المختلفين ل GTPases الصغيرة ، باستخدام Rac1 كمثال. باستخدام نهج البروتين المنقى ، من الممكن تجميع سلسلة من أحداث الإشارات عن طريق المقارنة الحكيمة الزوجية ، في تجربة حيث يمكن التحكم في النيوكليوتيدات المرتبطة عن كثب.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تنقية الموسومة GST GTPase

  1. الثقافة وE. كولاي سلالة مثل BL21 تحولت مع pGEX-RAC1 O / N عند 37 درجة مئوية، والهز في 220 دورة في الدقيقة، في 500 مل من وسائل الإعلام autoinduction (25 ملي نا 2 هبو 4 و 25 ملي KH 2 PO 4، 50 ملي NH 4 الكلورين، 5 مم نا 2 SO 4، 2 ملي MgSO 4، 2 مم CaCl 2، 0.5٪ الجلسرين، 0.05٪ الجلوكوز، اللاكتوز 0.2٪، 5 ز تريبتون، 2.5 غرام خلاصة الخميرة، و 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين).
  2. البكتيريا الحصاد بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 10000 x ج، 4 ° C.
  3. بيليه resuspend الجرثومي في 20 مل كاشف استخراج البروتين، 1X مثبط البروتياز واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT مع انقلاب.
  4. توضيح المحللة بواسطة الطرد المركزي في 40000 x ج لمدة 30 دقيقة.
  5. إضافة 2 مل الجلوتاثيون حبات مغناطيسية، وغسلها مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS: 10 ملي نا 2 هبو 4، 1.8 مم KH 2 PO 4، 137 ملي كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل).
  6. احتضان لمدة 2 ساعة، والاختلاط التي كتبها قلب في 4 درجات مئوية.
  7. تغسل حبات محملة البروتين أربع مرات مع 10 مل PBS، وذلك باستخدام الجسيمات فارز المغناطيسي لترسيب حبات في كل خطوة.
  8. و resuspend حبات في 2 مل PBS وتخزين البروتين تحميلها في -80 درجة مئوية في 100 مكل لحين الحاجة إليها.

2. التعبير عن البروتينات ملزم GTPase

  1. قبل يوم من التجربة، transfect البلازميدات ترميز البروتينات الفلورية الخضراء (GFP) -tagged نسخ من كل بروتين ملزمة GTPase إلى منفصلة 75 سم 2 قارورة من HEK293T على النحو التالي. للتأكد من صحة النوكليوتيدات تحميل، transfect GFP الموسومة TrioD1 إلى الثالثة 75 سم 2 قارورة من HEK293T.
    1. تمييع polyethylamine إلى 1 مغ / مل في 100 ميكرولتر العقيمة 150 ملي كلوريد الصوديوم.
    2. إضافة 27 ميكرولتر المخفف polyethylamine إلى 223 ميكرولتر تقليص وسائل الاعلام المصل.
    3. إضافة DNA البلازميد 12 ميكروغرام إلى 250 ميكرولتر تقليص وسائل الاعلام المصل.
    4. احتضان كل أنبوب لمدة 2 دقيقة في RT.
    5. الجمع بين polyethylamine وDNA تختلط في أنبوب واحد ودوامة لمدة 2 دقيقة.
    6. احتضان لمدة 15-20 دقيقة في RT.
    7. استبدال وسائط النمو (التعديل النسر وسائل الإعلام Dulbecco و، 10٪ مصل بقري جنيني، 2 مم L-الجلوتامين، لا المضادات الحيوية) على 90٪ متكدسة HEK293T مع 5 مل وسائط النمو الطازجة.
    8. إضافة مزيج polyethylamine / DNA مجتمعة إلى القارورة واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.

3. تنقية البروتينات ملزم GTPase

  1. شطف قوارير من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في برنامج تلفزيوني واستنزاف قارورة لمدة 5 دقائق، الشفط سائل حر.
  2. كشط الخلايا في 500 ميكرولتر العازلة تحلل (50 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك (pH7.8)، 1٪ Nonidet P-40، 1X مثبط البروتياز) في microfuge أنبوب.
  3. الخلايا ليز عن طريق خلط التي كتبها قلب في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. خلال تحلل، وغسل قطعتين من 40 ميكرولتر الخرز GFP-فخ ثلاث مرات مع العازلة تحلل العذبة، والخرز المترسبة في 2700 x ج لمدة 2 دقيقة بين يغسل.
  5. توضيح لست] بواسطة الطرد المركزي في 21000 x ج لمدة 10 دقيقة.
  6. نقل أوضح المحللة من كل من البروتينات منافس لفصل غسلها الخرز GFP فخ والسماح البروتينات GFP الانصهار لربط لمدة 2 ساعة، والاختلاط التي كتبها قلب في 4 درجات مئوية. إبقاء المحللة من خلايا GFP-TrioD1 على الجليد.
  7. غسل تحميل حبات GFP-فخ مرتين في 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.8)، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 0.7٪ (ث / ت) Nonidet P-40، ومرتين في 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2 ، المترسبة الخرز في 2700 x ج لمدة 2 دقيقة بين يغسل.
  8. أزل البروتينات GFP الانصهار بإضافة 40 ميكرولتر 0.2 M جليكاين (الرقم الهيدروجيني 2.5) وpipetting صعودا وهبوطا لمدة 30 ثانية. على الفور الخرز الرواسب في 21000 x ج لمدة 60 ثانية ونقل السائل إلى أنبوب microfuge جديدة تحتوي على 4 ميكرولتر 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 10.4). القيام بذلك بسرعة للحد من الأضرار التي لحقت البروتين النقي.
  9. تحليل 1 ميكرولتر من كل من البروتين النقي لطخة الغربية والتحقيق مع الأجسام المضادة لمكافحة GFP لإنشاء العائد النسبي باستخدام بلوت الكمينظام جي وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. بدلا من ذلك، تحديد تركيزات البروتين bicinchoninic حمض (BCA) فحص ولكن هذا يدخل الأخطاء إذا البروتينات لا تتفاعل مع مقايسة بطريقة متطابقة أو هناك البروتينات الملوثة.
  10. التعادل تركيز البروتين المولي من خلال إضافة 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2.

4. النكليوتيد تحميل GTPase

  1. ذوبان الجليد قسامة واحدة من GST-RAC1 حبات مغناطيسية، الذي أعد في الخطوة 1.
  2. خذ 90 ميكرولتر من الخرز GST-RAC1 ويغسل ثلاث مرات مع 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 25 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي DTT، 4 ملي EDTA، وذلك باستخدام الجسيمات فارز المغناطيسي لترسيب حبات في كل خطوة.
  3. العازلة نضح من الخرز وإضافة 100 ميكرولتر 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 25 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي DTT، 4 ملي EDTA.
  4. وفقا لما إذا الناتج المحلي الإجمالي، GTP أو لا النوكليوتيدات تحميل مطلوب للتجربة المنافسة، إضافة 12 ميكرولتر 100 ملي الناتج المحلي الإجمالي، و 12 ميكرولتر 10 ملي غوanosine 5 '- [γ-ثيو] ثلاثي الفوسفات (GTPγS) أو أي النوكليوتيدات إلى 60 ميكرولتر الخرز GST-RAC1.
  5. لعناصر النوكليوتيدات التحميل، وتقسيم حبات المتبقية إلى ثلاث قسامات 10 ميكرولتر وإضافة 2 ميكرولتر 100 ملي الناتج المحلي الإجمالي، 2 ميكرولتر 10 ملي GTPγS أو لا النوكليوتيدات إلى كل أنبوب.
  6. احتضان يمزج حبة لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية مع الإثارة.
  7. استقرار RAC1 محددة النوكليوتيدات طريق إضافة 1 M MgCl 2: 3 ميكرولتر إلى المزيج التجريبي (الخطوة 4.4)، و 0.5 ميكرولتر إلى كل من يمزج السيطرة (الخطوة 4.5).

5. مسابقة ملزمة.

  1. اقامة 6 أنابيب microfuge، كل منها يحتوي على:
    200 ميكرولتر 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2
    10 ميكرولتر التجريبية الخرز RAC1 محملة النوكليوتيدات (من الخطوة 4.7)
    5 ميكرولتر البروتين RAC1 ملزم A (بروتين ملزمة ثابت)
  2. لكل أنبوب، إضافة 0، 1، 2.5، 5، 10 أو 20 ميكرولتر ملزم RAC1 البروتين B (بروتين ملزمة متغير). تفترض هذه الكميات لpproximately قد تحتاج إلى تعديل تركيزات الأسهم متساوية من البروتينات ملزمة ثابتة ومتغيرة و.
    1. ضبط كميات من البروتينات ملزمة A و B إذا كانت هناك اختلافات كبيرة في الانتماءات الملزمة من اثنين من البروتينات، وهذا ينبغي أن تحدد تجريبيا من خلال تكرار التجارب. يشكلون إجمالي حجم الخليط ملزم إلى 235 ميكرولتر بإضافة 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2.
  3. إنشاء أنبوب microfuge تحتوي على:
    200 ميكرولتر 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2
    10 ميكرولتر التجريبية الخرز RAC1 محملة النوكليوتيدات (من الخطوة 4.7)
    10 ميكرولتر من البروتين RAC1 ملزم A (بروتين ملزمة ثابت)
  4. إعداد الناتج المحلي الإجمالي، GTPγS ولا أنابيب السيطرة النوكليوتيدات:
    200 ميكرولتر 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2
    10 المراقبة ميكرولتر الخرز RAC1 تحميل في الخطوة 4.5 مع الناتج المحلي الإجمالي، GTPγS أو لا النوكليوتيدات واستقرت في الخطوة 4.7.
    180 ميكرولتر HEK293T GFP-TrioD1 المحللة، أعد كما في الخطوة 3.6
    4 ميكرولتر 1 M MgCl 2
  5. احتضان الخليط لمدة 2 ساعة، والاختلاط التي كتبها قلب في 4 درجات مئوية.
  6. تغسل حبات ثلاث مرات مع 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2.
  7. أزل ملزمة البروتينات في 20 ميكرولتر الحد من عينة العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7)، 5٪ SDS، 20٪ الجلسرين، 0.02 ملغ / مل برموفينول الأزرق، 5٪ β المركابتويثانول).

6. تحليل المنافسة

  1. حل 10 ميكرولتر من بروتين ملزمة (الخطوة 5.6) بواسطة سلفات الصوديوم دوديسيل بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (SDS-PAGE) وصمة عار الغربية.
  2. احتضان الغشاء في 4 درجات CO / N في مكافحة GFP الضد المخفف 1/1000 في عرقلة العازلة المخفف ل1x أخرى في برنامج تلفزيوني، 0.1٪ توين 20 للكشف عن كل من البروتينات ملزم GTPase المعلمة.
  3. يغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة مع PBS، 0.1٪ توين-20.
  4. احتضان الغشاء لمدة 30 دقيقة في RT في DyLight 800 مترافق المضادة للأرنب ثانيةالأجسام المضادة ondary، المخفف 1/10000 في عرقلة العازلة المخفف ل1x أخرى في برنامج تلفزيوني، 0.1٪ توين-20.
  5. يغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة مع PBS، 0.1٪ توين-20.
  6. مسح الغشاء باستخدام نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء، وذلك باستخدام برنامج لقياس شدة الموجات وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
  7. مؤامرة كثافة عصابة من كل من البروتين ضد حجم المنافس متغير (البروتين B).
  8. تقسيم حجم منافس متغير عند النقطة التي تتقاطع خطوط من حجم منافس ثابت (البروتين A، 5 ميكرولتر) لتحديد نسبة منافس الذي يتحقق التوازن.
  9. للتأكد من صحة الوضع النووى والتحميل، والأغشية التحقيق لتنشيط P21 كيناز 1 (PAK1) (وهو المستجيب) وGFP-TrioD1 (أ GEF)، كما هو موضح في الخطوات 6،1-6،6.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تصميم هذا البروتوكول لحساب الانتماءات النسبية للشركاء ملزمة لRAC1، دون الحاجة لمعرفة تركيز دقيق من المنافسين (الشكل 1). تحديد تركيز البروتين يدخل الأخطاء وعند النظر المنافسة بين الجزيئات في مسار الإشارات ليست هناك حاجة. ومع ذلك، فمن المهم أن نعرف أن المنافسين لهما نفس التركيز المولي في الحلول الأسهم للسماح نسب بسيطة يتم حسابها عند إضافة وحدات التخزين المختلفة للفحص. 40 ميكرولتر من الخرز GFP-فخ لديها قدرة ملزمة من ~ 300 بمول لذلك متموجة 75 سم 2 قوارير للتعبير عن درجة عالية من الخلايا سوف تشبع الخرز، وكانت النتيجة أن الاستعدادات لاثنين من البروتينات ملزمة مختلفة ستكون مشابهة قبل التعديل (الشكل 2A). إذا كان أحد البروتينات عن سيئة، ويمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق تنقية أن البروتين من قارورة أكثر من واحد من الخلايا.

ق ق = "jove_content"> الربط من معظم المؤثرات GTPase والمنظمين يعتمد على النوكليوتيدات التحميل من GTPase الطعم، لذلك من المهم لاختبار ما إذا كان يتم تحميل بنجاح. يمكن التحقق من التحميل من قبل عجل البروتينات ملزمة يعرف من الخلية لست]. البروتينات المستجيب، مثل PAK1 ربط لGTP-RAC1 ويمكن عجلت بسهولة من لست] واكتشفت قبل الغرب النشاف 8 (الشكل 2B). GEFs ربط تفضيلي لالنوكليوتيدات خالية من GTPase لتحقيق الاستقرار في الحالة الانتقالية. كما GEFs هي وفرة منخفضة، عادة غير نشط وكثيرا صمة عار على نحو رديء، فمن الأفضل أن بإفراط لمرفق البيئة العالمية أو جزء مرفق البيئة العالمية لاختبار خالية من النوكليوتيدات GTPase. ونحن كثيرا ما تستخدم لأول تناظر DBL من الثلاثي، معبرا عنه كنسبة الانصهار GFP (GFP-TrioD1 9) (الشكل 2B) ولكن سيعمل أي مرفق البيئة العالمية. البروتينات التي تربط لGTPase محملة الناتج المحلي الإجمالي هي أكثر ندرة. نحن ذكرت مؤخرا RCC2 واحدة هذا البروتين 7، أو الناتج المحلي الإجمالي التحميل يمكن التحقق من صحة كمجرد بيندينانوغرام للا GEF ولا المستجيب.

وخرج من هذه التجربة أن يكون لطخة غربية يصور اثنين من الشركاء الموسومة GFP ملزم منضمة إلى GTPase. باستخدام الأجسام المضادة واحد للكشف عن كل من البروتينات، وتركيزات التي كميات مماثلة من كل من المنافسين ربط يمكن تحديد وبالتالي الاستدلال على الانتماءات النسبية. في هذا المثال المنافسة بين المجال المروحة من البروتين الاتجار RAC1، ويتجلى coronin-1C (RAC1 ملزم البروتين A)، والبروتين RAC1-عزل، RCC2 (RAC1 ملزم البروتين B)، (الشكل 3A). باستخدام حجم ثابت من المروحة coronin-1C (5 ميكرولتر)، وإضافة كميات متزايدة من RCC2، يمكننا أن نرى من GFP صمة عار أن يتم التوصل إلى التوازن في 1،25 حتي 2،5 ميكرولتر من RCC2 (النجمة)، مما يدل على أن RCC2 لديها أقوى تقارب لRAC1 من coronin-1C. عن طريق قياس كثافة العصابات باستخدام النشاف الغربي الكمي، والتآمر متوسط ​​القيم لكل منافسهص، يمكن حساب نقطة التوازن بدقة من خلال تحديد الكميات التي تتقاطع المنحنيات (الشكل 3B).

واحدة من العقبات الممكنة لمقايسة المنافسة الناجح هو إذا كان الشركاء ملزم ربط بعضها البعض وكذلك ملزمة لRAC1. في الشكل 3A + B نظهر المنافسة بين RCC2 والمجال المروحة من coronin-1C، بدلا من كامل طول coronin-1C. والسبب في استخدام coronin اقتطاع هو أن coronin-1C أيضا يربط RCC2 من خلال المجال الذيل. عند معاير كامل طول coronin-1C ضد RCC2، ملزمة لكل من البروتينات يتم الكشف، وذلك بسبب تشكيل الثلاثي المعقد، بدلا من المنافسة (الشكل 3C). إذا منافسة يحدث، ملزمة للبروتين واحد سيزيد في حين ينخفض ​​أخرى، وسوف مجموعه ملزمة GFP الانصهار تظل ثابتة. في الحالات التي يشكل مجمع الثلاثي فمن الضروري لاقتطاع واحد من البروتين ملزم GTPase بحيث competitors لم يعد التفاعل.

figure-results-1
الشكل 1. سير العمل. تمثيل تخطيطي لسير العمل لتحديد تقارب من البروتينات ملزم GTPase باستخدام فحوصات المنافسة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. التحقق من تنقية البروتينات. (A) تنقية RAC1 البروتينات التي حللها لطخة غربية ملزمة، التحقيق مع مكافحة GFP لتحديد العائد النسبي من اثنين من البروتينات الموسومة GFP. هذا النوع من معادلة أثناء التجربة يسمح للتركيز البروتينات اثنين إلى تعديل بحيث أنها تطابق في التجربة ملزمة. (B) GDوقد حضنت P، GTPγS وعدم تحميل النوكليوتيدات GST-RAC1 مع المحللة من HEK293T معربا عن GFP-TrioD1 والبروتينات الكشف عنها بواسطة بالتآمر لPAK1 الذاتية أو overexpressed GFP-TrioD1 ملزمة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3. تحليل لطخة غربية من البروتين النسبي ملزمة. مخرجات مثال من المقايسات ملزمة المنافسة. تحميلها الناتج المحلي الإجمالي (A) كانت مختلطة RAC1 مع 5 ميكرولتر GFP-coronin-1C المروحة نطاق وزيادة حجم GFP-RCC2 ومعاير فيها بواسطة النشاف الغربي البروتينات ملزمة لGFP، وتجنب القضايا مع الكشف عن الفرق من اثنين من البروتينات وإشارة GFP تقارير النسبة المولية بين اثنين من البروتينات الانصهار. العلامات النجمية تشير إلى نسب المنافسة على eitheتم قياس الجانب ص من نقطة التوازن. (B) شدة الفرقة من المربوطة البروتينات GFP الانصهار من ثلاث تجارب مستقلة قبل الغرب النشاف الكمي، وذلك باستخدام الأجسام المضادة والمتوسطات الثانوية fluorophore مترافق تآمرت لحساب كمية RCC2 اللازمة للوصول إلى التوازن. (C ) الناتج مثال من التجربة حيث ربط البروتينات RAC1 ملزم لبعضها البعض وتشكل مجمع الثلاثي، بدلا من التنافس. ومعاير كانت مختلطة RAC1 مع 5 ميكرولتر GFP-RCC2 وزيادة حجم-GFP coronin-1C كامل طول محملة الناتج المحلي الإجمالي فيها والزيادة في المربوطة GFP-coronin-1C دون فقدان ملزمة GFP-RCC2 يشير تشكيل معقد ثلاثي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة لمقارنة الصلات النسبية لأزواج البروتينات الصغيرة المرتبطة ب GTPase. تتمثل الخطوات الرئيسية في تحضير البروتينات المنقاة المرتبطة ب GTPase وتحميل النيوكليوتيدات ل GTPase. يسمح استخدام البروتينات المرتبطة ب GTPase بنفس علامة GFP بتحديد التركيزات التي ترتبط بها كميات مماثلة من كل منافس بدقة. يسمح استخدام GTPase المؤتلف المحمل بالنيوكليوتيدات باستجواب خصائص الربط ل GTPase في ظل ظروف نشاط محددة. هذه الخطوة هي أيضا الأكثر حساسية حيث أن النيوكليوتيدات ستتحلل وتفصل عن GTPase إذا لم يتم الحفاظ على ظروف المغنيسيوم بدقة.

في الخلية ، فإن العدد الكبير من البروتينات المرتبطة ب GTPase جنبا إلى جنب مع دوران النيوكليوتيدات السريع يجعل من الصعب تفسير هذه المسارات. تسمح بساطة هذه الطريقة في مقارنة أزواج البروتينات الملزمة فقط واستخدام ظروف تحميل النيوكليوتيدات التي يتم التحكم فيها بعناية بتوضيح مسارات الإشارات. ومع ذلك ، فإن أكبر قوة للبروتوكول هي أيضا أكبر نقطة ضعف لأنها تبسيط للحالة في الجسم الحي . يمكن استخدام فحوصات المنافسة لبناء فرضية قوية ، ولكن يجب بعد ذلك اختبارها في الخلايا عن طريق تجارب ضربة قاضية.

هناك ثلاث ميزات يجب مراعاتها عند اختيار البروتينات المرتبطة ب GTPase التي تحمل علامة GFP لاستخدامها في التجربة. أولا ، يجب أن تعبر بروتينات الاندماج جيدا في خلايا الثدييات ، مثل HEK293T ، حيث تتطلب فحوصات المنافسة كمية معقولة من البروتين. ثانيا ، يجب أن يكون من الممكن تنقية البروتين المؤتلف دون تدهور كبير ، وعندما لا يكون ذلك ممكنا ، يجب النظر في استنساخ جزء مرتبط ب GTPase. ثالثا ، يجب أن يتم حل البروتينين المرتبطين ب GTPase من بعضهما البعض على SDS-PAGE للسماح بالتحليل في القسم 6.

هناك عدد من المحاذير المحتملة للتجربة التي يجب أخذها في الاعتبار ، وربما معالجتها:

تمسخ محتمل للبروتينات النقية المرتبطة ب GTPase أثناء خطوة الشطف الحمضي أو عائق فراغي بواسطة علامة GFP. في أيدينا ، لم تكن هذه مشكلة ، ولكن يجب اختبارها. يمكن اختبار البروتينات المنقاة في فحوصات وظيفية 10. وتوجد الآن مجموعات تجارية لاختبار نشاط مرفق البيئة العالمية أو الفجوات دون الحاجة إلى نيوكليوتيدات تحمل علامات بالنظائر. تحمي البروتينات العازلة بطبيعتها GTPases من نشاط مرفق البيئة العالمية أو GAP ، لذلك يمكن استخدامها كمثبطات تنافسية في فحوصات مرفق البيئة العالمية التجارية أو GAP ، كما فعلنا في منشورنا الأخير 7. الميزة ذات الصلة للبروتينات التي تنقل GTPase هي القدرة على ربط GTPase ، ويمكن اختبار ذلك بسهولة في اختبار المنسدل. هناك طريقة بديلة لاختبار سلامة البروتين التي تنطبق على جميع بروتينات الربط وهي معايرة البروتين المملوء من حبات مصيدة GFP مع الجلايسين مع نفس البروتين الذي تمت إزالته من حبات مصيدة GFP عن طريق الانقسام الأنزمي. سيتم تحليل التجربة عن طريق فحص كل من البروتين المشقوق والمشقوق بعلامة GFP مع جسم مضاد ضد البروتين نفسه. إذا لم يتضرر البروتين عن طريق الشطف ، فيجب تحقيق التوازن بنسبة 1: 1. سيشير هذا النهج أيضا إلى ما إذا كان وجود علامة GFP نفسها يضر بخصائص الربط للبروتين المرشح ، على الرغم من أن هذا يتطلب إنتاج بنية ذات موقع انقسام إنزيمي بين العلامة والبروتين الربط. سواء تم اختراق البروتين بواسطة العلامة أو خطوة الشطف ، يمكن معالجة المشكلة عن طريق تعديل البروتوكول لاستخدام طريقة تنقية بديلة. بدلا من GFP ، يمكن وضع علامة على بروتينات الربط الخاصة به وتنقيتها باستخدام Ni-NTA وتحليلها باستخدام جسم مضاد ضد علامة His. الميزة المهمة هي أن كلا البروتينين الملزمين يجب أن يشتركان في علامة مشتركة على الرغم من أنه ، إذا لزم الأمر ، يمكن إضافة علامتين إلى البروتين ، واحدة للتنقية والأخرى للكشف.

تم تصميم البروتوكول للتحقيق في المنافسة بين التفاعلات مع مجالات المحول I / II. على الرغم من أن غالبية تفاعلات GTPase يتم التوسط فيها بواسطة هذا الشكل ، إلا أن هناك بعض الاستثناءات ، وأبرزها تفاعلات GDIs التي ترتبط بذيل prenyl ، بالإضافة إلى حجب مجالات التبديل. من حيث المبدأ ، يمكن تكييف البروتوكول لاستخدام GTPase المنقى من خلايا الثدييات ، بحيث يتم إبطال GTPase مسبقا ، ومع ذلك ، فإن وجود مواقع ربط متعددة أو تأثيرات خيفية يعقد تفسير البيانات الملزمة للمنافسة. من المشاكل الأخرى المرتبطة بمثل هذا التعديل أن GDIs تتنقى بشكل مشترك مع GTPase من خلايا الثدييات ، مما يضر بنقاء البروتينات المعزولة للخطر والطبيعة الكارهة للماء لمجموعات prenyl تعني أن GTPases مسبقة الصنع مرتبطة إما ب GDI أو غشاء الدهون ويجب مراعاة هذه العوامل في التجربة.

كمية GST-Rac1 المستخدمة في الفحص. يجب أن يكون بروتين ربط GTPase الثابت بتركيز أكبر من Rac1 ، أو عند إضافة المنافس ، سوف يرتبط ببساطة ب Rac1 الحر. سيكون من الواضح على الفور ما إذا كان هذا قد حدث كارتباط للمنافس ، دون فقدان البروتين الثابت ، سيتم اكتشافه بنفس الطريقة التي يتم اكتشافها عندما يرتبط البروتينان المتنافسان ببعضهما البعض كما هو موضح في الشكل 3 ب. كعنصر تحكم إضافي (الخطوة 5.3) ، يجب تضمين تفاعل ملزم يحتوي على ضعف كمية بروتين الارتباط الثابت ولا يوجد بروتين ربط متغير (الخطوة 5.3). إذا كان Rac1 في تجربة المعايرة بالتحليل الحجمي مشبعا ، فلن يكون لمضاعفة كمية بروتين الارتباط الثابت أي تأثير على الإخراج. يجب أن تكون الأحجام المقترحة في البروتوكول مناسبة ، ولكن يمكن تقليل كمية Rac1 بسهولة. إذا لوحظ ربط المنافس دون فقدان شريك الربط الثابت ، فيجب محاولة تقليل كمية Rac1 قبل محاولة رسم خريطة لمواقع الربط لتجنب تكوين المركب الثلاثي.

تفاعل غير محدد للبروتينات المرتبطة ب GTPase مع ضريبة السلع والخدمات أو الخرزة ، وكذلك على وجه التحديد مع Rac1. ستتجلى هذه المشكلة من خلال الارتباط المتبقي لبروتين الارتباط الثابت ب GTPase ، حتى عندما يصل البروتين المتغير المرتبط ب GTPase إلى هضبة بتركيز عال. سيتم المساعدة في تحديد هذه المشكلة من خلال إجراء تجارب متبادلة حيث يتم تبديل البروتينات الثابتة والمتغيرة المرتبطة ب GTPase. ستعمل التجارب المتبادلة أيضا على تحسين دقة تقدير نقطة التوازن بشكل كبير ، لذلك يجب تضمينها دائما. في حالات الارتباط غير المحدد ، لا يزال من الممكن حساب التركيزات النسبية التي يتم عندها تحقيق التوازن من خلال مقارنة شدة النطاق بين الحد الأقصى والحد الأدنى لكل بروتين ، أو عن طريق قياس مدى الارتباط غير المحدد باستخدام حبات ضريبة السلع والخدمات كطعم ، بدلا من GST-Rac1.

يجب استخدام المقايسات المنسدلة باستخدام ظروف تحميل النيوكليوتيدات المختلفة لاستكمال مقايسة المنافسة الموصوفة في هذا البروتوكول. يعد تحديد تفضيل النوكليوتيدات للشركاء أمرا مهما لفهم أحداث المنافسة وفهم مسار الإشارات الذي يشارك فيه البروتين المرتبط ب GTPase. في الشكل 2 ب ، نقوم بتحليل ارتباط البروتينات مع التفضيل الثابت ل GTPase المحمل ب GTP أو الخالي من النوكليوتيدات كوسيلة للتحقق من صحة تحميل النيوكليوتيدات. ومع ذلك ، فمن المنطقي التحقيق في تأثير تحميل النيوكليوتيدات على كل من المنافسين أيضا. إذا أظهر المنافسون الافتراضيون تفضيلات مختلفة ، فستقدم المنافسة مساهمة أقل في مسار الإشارات ، وفي الواقع من المحتمل أن يكون دوران النيوكليوتيدات هو الآلية التي توجه تبادل البروتينات الملزمة.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل منحة Wellcome Trust 088419 لبندول التنمية المتعددة النطاقات.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BugbusterNovagen70584-3
مثبط البروتياز الكاملRoche05 056 489 001
حبات الجلوتاثيون المغناطيسيةبيرس88821
بولي إيثيل لينيمين ، متفرعة ، متوسط Mw< / sub> ~ 25,000Sigma Aldrich408727-100ML
OPIMEMLife Technologies31985-047
Dulbecco's Modified Eagle MediaSigma AldrichD5796
Fetal Bovine SerumLife Technologies10270-1-6
L-GlutamineLifeTechnologies 25030-024
GFP-Trap_AChromotecgta-20
GDPSigma AldrichG7127غير مستقر للغاية. Aliquot وتخزينها في -80 فور إعادة التركيب
GTP & gamma ؛ SSigma AldrichG8634غير مستقر للغاية. Aliquot وتخزينها عند -80 فور إعادة التركيب
Blocking BufferSigma AldrichB6429
Tween-20Sigma AldrichP9416
الأجسام المضادة ل GFPالألوان الحية632592الاستخدام عند 1/1000 تخفيف
DyLight 800 الماعز المترافق المضاد للأرانب الجسم المضاد الثانويفيشر Scientific10733944
المضاد ل PAK1استخدام إشارات الخلية2602Sعند تخفيف 1/1000
نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء Odyssey SALi-cor9260-11PC

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. and Rac take center stage. Cell. 116 (2), 167-179 (2004).">Burridge, K., Rho Wennerberg, K. and Rac take center stage. Cell. 116 (2), 167-179 (2004).
  2. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).">Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
  3. GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (2), 167-180 (2005).">Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (2), 167-180 (2005).
  4. structure of Rac1 in complex with the guanine nucleotide exchange region of Tiam1. Nature. 408 (6813), 682-688 (2000).">Worthylake, D. K., Rossman, K. L., Crystal Sondek, J. structure of Rac1 in complex with the guanine nucleotide exchange region of Tiam1. Nature. 408 (6813), 682-688 (2000).
  5. GTPase activating proteins: structural and functional insights 18 years after discovery. Cell Mol Life Sci. 62 (24), 3014-3038 (2005).">Scheffzek, K., Ahmadian, M. R. GTPase activating proteins: structural and functional insights 18 years after discovery. Cell Mol Life Sci. 62 (24), 3014-3038 (2005).
  6. Integrins regulate GTP-Rac localized effector interactions through dissociation of Rho-GDI. Nat Cell Biol. 4 (3), 232-239 (2002).">Del Pozo,, A, M., et al. Integrins regulate GTP-Rac localized effector interactions through dissociation of Rho-GDI. Nat Cell Biol. 4 (3), 232-239 (2002).
  7. Coronin-1C and RCC2 guide mesenchymal migration by trafficking Rac1 and controlling GEF exposure. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4292-4307 (2014).">Williamson, R. C., et al. Coronin-1C and RCC2 guide mesenchymal migration by trafficking Rac1 and controlling GEF exposure. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4292-4307 (2014).
  8. Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK. Embo J. 19 (9), 2008-2014 (2000).">Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK. Embo J. 19 (9), 2008-2014 (2000).
  9. The N-terminal DH-PH domain of Trio induces cell spreading and migration by regulating lamellipodia dynamics in a Rac1-dependent fashion. PLoS. 7 (1), e29912(2012).">Van Rijssel, J., Hoogenboezem, M., Wester, L., Hordijk, P. L., Van Buul, J. D. The N-terminal DH-PH domain of Trio induces cell spreading and migration by regulating lamellipodia dynamics in a Rac1-dependent fashion. PLoS. 7 (1), e29912(2012).
  10. Measurement of intrinsic nucleotide exchange and GTP hydrolysis rates. Methods Enzymol. 256, 67-76 (1995).">Self, A. J., Hall, A. Measurement of intrinsic nucleotide exchange and GTP hydrolysis rates. Methods Enzymol. 256, 67-76 (1995).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

GTPase binding ProteinsCompetition AssaysRac1 PurificationNucleotide LoadingGFP Tag DetectionWestern Blot AnalysisBinding Affinity ComparisonGTPase Signaling StatesProtein Purification MethodsQuantitative Western Blotting

Related Articles