تعد ثقافة القطرات المستقيمة خارج الجسم الحي بديلا للتقنيات التجريبية الحالية في المختبر وفي الجسم الحي. هذا البروتوكول سهل التنفيذ ويتطلب كميات أقل من الكاشف ، مع السماح بالقدرة على التلاعب بالأوعية الدموية الجنينية ودراستها ، وتشكل التشكل ، وتكوين الأعضاء.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التحقيق توالد في الرحم هي عملية صعبة من الناحية التقنية في الثدييات المشيمية نظرا لعدم إمكانية الوصول إلى الكواشف إلى الأجنة التي تتطور داخل الرحم. يوفر خارج الحي تستقيم طريقة الثقافة قطرة وضعت حديثا بديلا جذابا لالدراسات التي أجريت في الرحم. تقدم الثقافة فيفو السابقين قطرة القدرة على دراسة ومعالجة التفاعلات الخلوية ومسارات الإشارات المختلفة من خلال استخدام مختلف الحجب ومركبات تفعيل. بالإضافة إلى ذلك، فإن آثار مختلف الكواشف الدوائية على تطوير أجهزة معينة يمكن دراستها من دون آثار جانبية غير مرغوب فيها من إيصال الدواء النظامية في الرحم. بالمقارنة مع غيرها من نظم المختبر، وثقافة قطرة يسمح ليس فقط من أجل القدرة على دراسة ثلاثي الأبعاد التشكل وخلية خلية التفاعلات، التي لا يمكن استنساخها في خطوط خلايا الثدييات، ولكن يتطلب أيضا أقل بكثير صeagents من الآخر خارج الحي والبروتوكولات المختبر. توضح هذه الورقة السليم الماوس الجنين تشريح الجهاز وتقنيات زراعة قطرة تستقيم، تليها كله المناعي الجهاز لإثبات فعالية هذه الطريقة. فيفو السابقين قطرة طريقة ثقافة يسمح بتشكيل بنية الجهاز قابلة للمقارنة إلى ما لوحظ في الجسم الحي، ويمكن استخدامها لدراسة عمليات خلاف ذلك يصعب الدراسة بسبب الفتك الجنينية في النماذج في الجسم الحي. كنظام تطبيق النموذج، سيتم استخدام مثبط جزيء صغير للتحقيق في دور الأوعية الدموية في التشكل الخصية. هذا خارج الحي قطرة طريقة ثقافة غير قابلة للتوسيع إلى أجهزة الجسم الجنين أخرى، مثل الرئة وربما غيرها، على الرغم من أن كل جهاز يجب أن يكون على نطاق واسع درس لتحديد أي تعديلات الجهاز محددة لبروتوكول. ويوفر هذا النظام الثقافة الجهاز المرونة في التجريب مع أجهزة الجنين، والنتائج obtaineد باستخدام هذه التقنية ستساعد الباحثين اكتساب نظرة ثاقبة نمو الجنين.
المقدمة
تجديد جهاز في الجسم الحي في البشر محدود للغاية؛ لذلك، هندسة الأنسجة، وتطوير الأنسجة والأعضاء من الخلايا الفردية التي تبرعت بها مجموعة، أصبح علاجا جذابا المحتملين لاستبدال الجهاز. ومع ذلك، لهذه الاستراتيجية العلاجية لتكون ناجحة، والعوامل والتفاعلات الخلوية العاملة في التشكل من الجهاز يجب دراستها بدقة وفهمها جيدا. نظرا لعدم القدرة على دراسة تطوير أجهزة معينة مع الأساليب التقليدية، تحولت الباحثون إلى الجنين كله بديل أو الثقافات الجهاز كله. Kalaskar وآخرون. 1 أظهرت أن ثقافة مرحلة التطور الجنيني كلها خارج الحي تعطي نتائج مماثلة (في 58٪ من الأجنة مثقف) لفي التنمية الرحم، مما يشي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وكانت جميع الفئران المستخدمة في هذه الدراسات CD-1 الفئران التي تم الحصول عليها من مختبرات نهر تشارلز. كما تم إجراء تجارب زراعة السابقة على السلالات الأخرى، مثل C57BL / 6J (لا تظهر البيانات)، ولكن يمكن استخدام أي سلالة. وكانت الإناث البالغات الحوامل حوالي 2-3 أشهر من العمر والموت الرحيم كانت عبر CO 2 الاستنشاق تليها خلع عنق الرحم وبضع الصدر الثنائي قبل إزالة الجنين. تم إيواء الفئران فقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة، وتمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي مركز سينسيناتي للأطفال الطبية مستشفى.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الثقافة فيفو السابقين قطرة واحدة تسمح للتلاعب الأجهزة كلها، مثل الغدد التناسلية، لدراسة التفاعلات الخلوية وديناميكية الشكل 1 يوضح في خطوة حكيمة الأزياء كيفية تحضير ثقافة E11.5 الغدد التناسلية الحبرية. وتشمل الخطوات الأولى في البروتوكول ثقافة إزالة الأولية للرحم التي تحتوي على الجنين من الماوس الأم (1A الشكل و1B). بعد إزالة الرحم من الأم، وقطع جدار الرحم وتتحرر الأجنة من الكيس المحي في برنامج تلفزيوني لمزيد من تشريح (الشكل 1C-E).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
توضح هذه الدراسة المجراة سابقا كله الجهاز طريقة قطرة يحتوي على العديد من التطبيقات المحتملة لدراسة التطور الجنيني. هذه التقنية يمكن استخدامها لأجهزة متعددة، ويسمح الباحث لمعالجة المسائل الحيوية التي يصعب دراسة استخدام في الجسم الحي النهج بسبب عدم إمكانية الوصول إلى الأجنة والفتك الجنينية المحتملة. هذه الطريقة ثقافة له فوائد إضافية على الآخر في المختبر النهج مثل خطوط الخلايا الثديية: الأجهزة كلها يمكن استخدامها، وبالتالي الحفاظ على التفاعلات بين .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم المؤلفين من قبل: منحة أبحاث CancerFree KIDS ، وجائزة March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar (# 5-FY14-32) ، وجائزة منحة أمين المركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال (CCHMC) ؛ جائزة CCHMC للابتكار البحثي والتمويل التجريبي ؛ وصناديق تطوير CCHMC. يقر المؤلفون أيضا بمختبر كابيل للتحسين الأولي لهذه التقنية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| نظارات الغطاء: مربعات (22 مم × 22 مم ، رقم 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear طلاء أظافر ، غير مرئي | سالي هانسن | ||
| 8 شرائط 0.2 مل أنابيب PCR وأنابيب PCR قبعات مسطحة منفصلة | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1،000L ، P200L ، P20L ، P10L ، P2L | Gilson | FA10006M ، FA10005M ، FA10003M ، FA10002M ، FA10001M | |
| Dumont # 5 ملقط | FST | 91150-20 | |
| مقص دقيق | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 مل أنابيب الطرد المركزي | الدقيقة Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 مل أنابيب الطرد المركزي | الدقيقة Denville | C2176 | |
| 10 & mu ؛ ل نصائح حاجز الدقة SHARP | Denville | P1096FR | |
| 20 & mu ؛ ل نصائح حاجز الدقة SHARP | Denville | P1121 | |
| 200 & mu ؛ ل نصائح حاجز الدقة SHARP | Denville | P1122 | |
| 1,000 & mu ؛ ل SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 مل حقنة مع 27 إبر | قياس BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 مل | حقنة BD | 305559 | |
| 0.2 & مرشح حقنة M PES | VWR | 28145-501 | |
| الصف 3 ورق ترشيح نوعي من الدرجة القياسية ، دائرة ، 185 مم | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35 مم طبق ثقافة الخلية سهل الإمساك بنمط | Falcon / Corning | 353801 | |
| أطباق بتري ، معقمة (100 مم × 15 مم) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2< / sub> حاضنة | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| خزانة السلامة الحيوية | Nuare | NU-425-400 | |
| أجهزة الطرد المركزي الصغيرة | فيشر ساينتفيك | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer متغير XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler مع لوحة تحكم | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 مجهر مجهر مجسم | نيكون | SMZ445 | |
| خزانة إضاءة متعددة الصور مع برنامج AlphaEase | توقف شركة | Alpha Innotech Corporation | |
| الإيثانول فيشر المطلق 200 دليل | BP2818-500 | ||
| تريتون X-100 | فيشر | BP151-100 | |
| فوسفات الصوديوم (ثنائي القاعدة MW 142) Na2< / sub>HPO4< / sub> | Fisher | S374-1 | |
| فوسفات البوتاسيوم (أحادي القاعدة MW 136) KH2< / sub>PO4< / sub> | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) فيشر | S671-3 | ||
| كلوريد البوتاسيوم (KCl) | سيجما ألدريتش | P3911-1KG | |
| كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2< / sub>) | Sigma | M2393-100g | |
| كلوريد الكالسيوم (CaCl 2< / sub>) | Sigma | C5670-100g | |
| تقنيات الحياة المائية الخالية من نوكلياز Ambion | AM9938 | ||
| XY PCR التمهيدي | IDT | N / A | |
| حمض الخليك الجليدي | فيشر | A38-500 | |
| حمض رباعي الأسيتيك الإيثيلين ديامين (EDTA) فيشر | BP2482-1 | ||
| 1٪ محلول بروميد الإيثيديوم | فيشر | BP1302-10 | |
| GeneMate GeneMate Agarose | E-3120-500 | ||
| هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) سيجما | ألدريتش | 367176-2.5KG | |
| مجموعة Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP ، حلول 100 ملي مولار | Thermo Scientific | R0182 | |
| اختيار الحمض النووي Taq polymerase مع 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| كلوريد الهيدروجين ( حمض الهيدروكلوريك فيشر | A144212 | ||
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، مسحوق ، كسر V ، عزل الصدمات الحرارية | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ؛ | Life Technologies | 11965-092 | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، مصل ثلاثي 100 نانومتر مفلتر | فيشر | 03-600-511 | تعطيل الحرارة قبل استخدام |
| البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) | Life Technologies | 15140-122 | استخدم عند 1: 100 |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، Hybri-max ، معقم مفلتر | Sigma | D2650 | |
| VEGFR مثبط التيروزين كيناز II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| الأرنب المضاد للجسم المضاد للسوكس 9 | Millipore | AB5535 | الاستخدام عند التخفيف: 1: 4,000 |
| الفئران المضادة للفأر PECAM1 (CD31) الجسم المضاد | BD Pharmingen | 553370 | الاستخدام عند التخفيف: 1:250 |
| الأرنب المشقوق Caspase-3 (Asp175) إشارات خلايا الأجسام المضادة | 9661S | عند التخفيف: 1: 250 | |
| الفئران E-cadherin / CDH1 الجسم المضاد (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | الاستخدام عند التخفيف: 1: 500 |
| Hoechst 3342 ، ثلاثي هيدروكلوريد ، ثلاثي هيدرات | إنفيتروجين (مجسات جزيئية) | H1399 | استخدم عند 2 ميكروغرام / مل |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H + L) Jackson | Immunoresearch | 712-165-153 | الاستخدام عند التخفيف: 1: 500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H + L) Jackson | Immunoresearch | 712-605-153 | استخدم في التخفيف: 1: 500 |
| الحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، Alexa Fluor 555 المترافق | Life Technologies | A31572 | الاستخدام عند التخفيف: 1: 500 |
| الحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، Alexa Fluor 488 Conjugate | Life Technologies | A21206 | الاستخدام عند التخفيف: 1: 500 |
| الحمار المضاد للفئران IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، Alexa Fluor 488 المترافق | Life Technologies | A21208 | استخدم عند التخفيف: 1: 500 |
| مضاد ثانوي مضاد للأرانب IgG (H + L) ، Alexa Fluor 647 مترافق | Life Technologies | A31573 | الاستخدام عند التخفيف: 1: 500 |
المراجع
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803(2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
