تقييم خصائص المناعية للالوسيطة الإنسان الخلايا الجذعية (اللجان الدائمة)

الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) هي الأسلاف الجسدية التي يمكن أن تفرق في الأنساب أرومية متوسطة مجاور للمحور من العظام والغضاريف والأنسجة الدهنية ^و1-4، وكذلك لبضع الأنساب extramesodermal ^5. عزله للمرة الأولى من نخاع العظام الكبار، والآن تم العثور على هذه الأسلاف multilineage في العديد من الأنسجة ^6-8، وبشكل غير متوقع، تبين أن لها خصائص المناعية القوية التي تظهر قابلية عالية للالتطبيق السريري ^12/09. وبنشاط يجري التحقيق آليات مفصلة المشاركة في الآثار المناعية للتطبيق الفعلي على الكيانات المرض محددة. واحدة من أكثر الطرق مباشرة لتقييم المناعة هو من خلال تقييم لقمع المستجيب الكريات البيض انتشار ^13. معظم الكريات البيض المستجيب مثل الخلايا الليمفاوية T وحيدات تتكاثر غير عادي عندما حفز أو تفعيلها. وظيفة المناعية يمكن تقييمها عندما قمعويشهد انتشار الأسلحة النووية.

تقليديا، وقد تم تقييم انتشار المستجيب الكريات البيض من خلال الكشف عن ^[3 H] ثيميدين إدراجها في الحمض النووي. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب له عيوب كبيرة بسبب المخاوف من الإشعاع والتخلص منها بعد استخدامها، وكذلك المعدات المعقدة اللازمة. في حين أن هناك فحوصات غير المشعة لتقييم تكاثر الخلايا، واستر carboxyfluorescein succinimidyl (CFSE) مقايسة له مزايا أخرى مثل السماح لتحديد السكان الخلوي محددة، وهو أمر مفيد خاصة في التجارب الثقافة المشتركة التي تشمل أنواع خلايا متعددة. CFSE هو صبغة الفلورسنت الخلوية التي يمكن تقييمها من خلال تحليل تدفق cytometric. كما تنقسم الخلايا، وانخفضت شدة هذه التسمية الخلوية نسبيا. وهذا يتيح ليس فقط تحديد تكاثر الخلايا بشكل عام ولكنه يسمح أيضا لتقييم لعدد من الانقسامات الخلوية يصل إلى 8 الانقسامات قبل أن يصبح مضان الصعب ديتإلخ ضد إشارة الخلفية. وعلاوة على ذلك، فإن استقرار CFSE الفلورسنت يسمح لفي الجسم الحي تتبع الخلايا المسمى مثل هذه أن الخلايا يمكن تصور ما يصل إلى عدة أشهر ^14.

ويمكن أيضا أن تختلف هذا الاختبار لتقييم أنواع معينة من الكريات البيض المستجيب أو وظيفة المناعية لفئات معينة من السكان للجنة السلامة البحرية التي يسببها الكريات البيض، مثل المناعية كما انترلوكين 10 (IL-10) إنتاج CD14 ⁺ حيدات ¹⁵ عن طريق أداء المغناطيسي حبة علامة السطح اختيار السكان خلية من الفائدة قبل أو بعد ثقافة مشتركة حسب الاقتضاء. يصف بروتوكول لدينا فحص أساسي لتقييم الآثار المناعية من اللجان الدائمة على الكريات البيض المستجيب (الرسم البياني في الشكل 1)، والاختلاف على هذا الاختبار الأساسي لتقييم MSC الناجم عن المناعة الكريات البيض على خيفي CD4 ⁺ المستجيب الخلايا اللمفية تي (الرسم البياني أظهرت في الشكل 4).

يجب الحصول على الموافقة المستنيرة للمريض كما وافق عليها مجلس المراجعة المؤسسية لاستخدام الخلايا البشرية.

1. الكثافة التدرج عزل الخلايا الطرفية الإنسان الدم وحيدات النوى (PBMCs)

1. إضافة 25 مل heparinized الدم كله في أنبوب 50 مل بواسطة ماصة 25 مل.
   1. تمييع الخلايا مع 25 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
2. إضافة 15 مل من Ficoll-Paque التدرج الكثافة في أنبوب جديد 50 مل، وبينما يميل الأنبوب، ببطء شديد وبدقة إضافة في 25 مل من تعليق خلية المخفف على التدرج كثافة حتى لا يكون هناك أي اختلاط الدم الكامل مع التدرج الكثافة، أي، أي اضطراب في واجهة التدرج الدم الكثافة.
3. الطرد المركزي تعليق من الخطوة 1.2 في 400 × ز لمدة 30 إلى 40 دقيقة في درجة الحرارة التي تسيطر يتأرجح دلو الدوار دون الفرامل عند 20 درجة مئوية.
   ملاحظة: يجب أن تكون ثلاث طبقات متميزة واضح بعد الطرد المركزي: عشره الطبقة العليا يجري البلازما. طبقة واضحة القاع يجري التدرج كثافة Ficoll-Paque. و، طبقة رقيقة الخلوية المتوسطة كونها PBMCs
4. نضح وتجاهل الطبقة العليا عن طريق الشفط مع ماصة باستور، مع الحرص على عدم تعكير صفو طبقة البيني للخلايا وحيدات النوى (أي الخلايا الليمفاوية، وحيدات، والصفائح الدموية).
5. جمع بعناية طبقة الخلايا وحيدة النواة هذا مع ماصة 10 مل إلى 50 مل جديد أنبوب الطرد المركزي.
6. ملء الأنبوب مع 20 مل من برنامج تلفزيوني، وتخلط جيدا، وأجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في 20 ° C. إزالة طاف تماما بعد الطرد المركزي.
7. resuspend الكرية خلية في 20 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 10-15 دقيقة في 20 ° C. إزالة طاف تماما بعد الطرد المركزي.
   ملاحظة: هذه الخطوة إزالة الصفائح الدموية-وهي غير مرغوب فيه داخل PBMCs. ويمكن تكرار هذه الخطوة لضمان إزالة كاملة من الصفائح الدموية.
8. إذا لم يكن هناك اختيار فئات معينة من السكان هيالمطلوب، بيليه الخلية resuspend في الكريات البيض المتوسط ​​كاملة (10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ L-الجلوتامين، و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين في المتوسط ​​RPMI-1640) للزراعة بعد إجراء عدد خلايا ^{16 إلى} تعليق 1 مل من المتوسطة في 10 ⁷ PBMCs قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

2. وضع العلامات المغناطيسي للسكان كريات بيضاء (انتقل إلى الخطوة 4 إذا لم اختيار فئات معينة من السكان غير مطلوب)

1. الطرد المركزي PBMC تعليق في 300 × ز لمدة 10 دقيقة، ونضح طاف تماما.
2. بيليه الخلية resuspend في 80 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في 10 ⁷ مجموع الخلايا.
3. إضافة 20 ميكرولتر من حبات مغناطيسية محددة (أي CD14 حبات مغناطيسية لعزل حيدات، CD4 حبات مغناطيسية لعزل الخلايا الليمفاوية T) في 10 ⁷ مجموع الخلايا.
4. تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في 2-8 درجة مئوية في الثلاجة.
5. إضافة 1-2 مل من برنامج تلفزيوني في 10 ^{7 خلايا} لغسل، وأجهزة الطرد المركزيفي 300 × ز لمدة 10 دقيقة.
6. نضح طاف تماما و resuspend ما يصل الى 10 ⁸ الخلايا في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.

3. اختيار المغناطيسي المجموعات السكانية الفرعية خلايا الدم البيضاء

ملاحظة: هي مجموعة متنوعة من فواصل حبة المغناطيسي والأعمدة المتوفرة لعزل السكان معين من كريات الدم البيضاء التي كتبها علامة سطح الخلية من عدد من الشركات المصنعة. العزلة يمكن أن يكون عن طريق الانتقاء إيجابية على أساس واحد أو عدد قليل من علامات إيجابية أو عن طريق الانتقاء السلبية بعد استنفاد السكان غير المرغوب فيها. ويرد أدناه A النهج العام لأداء اختيار الإيجابية باستخدام علامة واحدة (أي CD4 لاللمفاويات التائية المساعدة، أو CD14 للحيدات).

1. إعداد وفاصل المغناطيسي رئيس بما في ذلك العمود الفصل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
2. تطبيق الأنبوب الذي يحتوي على عينة من PBMCs المسمى. تقديم اثنين من 15 مل أنابيب الطرد المركزي لجمع وunlabel المسمى إيجابيالكسور الخلية الطبعه، بعد تعليمات الشركة الصانعة.
3. عد الزنزانة رقم ¹⁵ و resuspend الكريات البيض مختارة بشكل إيجابي (أي الخلايا الليمفاوية T ⁺ CD4 أو CD14 ⁺ الخلايا) في الكريات البيض المتوسط ​​كاملة، وذلك باستخدام 1 مل من المتوسط ​​في 10 ⁷ الخلايا.

4. CFSE تلطيخ الكريات البيض لتقييم انتشار

ملاحظة: تم CFSE تستخدم على نطاق واسع في التحقيقات المناعية، على حد سواء في والمجراة في الدراسات المختبرية. وقد تم تحسين بروتوكول لدينا للدراسة في المختبر من MSC / PBMC (أو الكريات البيض الأخرى) التفاعلات. في حين أن الخطوات العامة تشارك في إجراء CFSE في المختبر وضع العلامات متشابهة، قد تكون هناك اختلافات في جرعة محددة وتوقيت بروتوكول ^14. قد يكون هذا نتيجة لعدد من العوامل، أي نوع من الخلايا المحددة المستخدمة، أرقام الهواتف المحمولة المستخدمة والتي يمكن أن تؤثر على الأرجح شدة إشارة الفلورسنت CFSE.

الرقم 1 يدل على مخطط شامل للتجربة، ويوضح الشكل (2) ومظهر مختلف الظروف ثقافة الخلية كما تصور من قبل على النقيض من المرحلة مقلوب المجهر. اللجان الدائمة هي خلايا ملتصقة مع الأرومة الليفية، مورفولوجيا المغزل على شكل، في حين PBMCs وكريات الدم البيضاء هي الخلايا غير ملتصقة صغيرة مستديرة. هذان أنواع مختلفة من الخلايا شكليا يمكن رؤيتها بوضوح في الثقافة المشتركة. في نهاية الفحص، عندما يستنشق PBMCs (أو leuckotyes) لتدفق cytometric التحليلات، حتى لو تم تضمينها اللجان الدائمة ملتصقة عن غير قصد (أي بسبب سوء التعلق أو الخلع بواسطة طموح قوي)، ينبغي أن يكون هناك أي مشاكل مع تقييم سوف PBMC / الكريات البيض جزء منذ هذه الخلايا يكون المسمى مع CFSE. عندما لا يكون هناك انتشار الأسلحة النووية، وتعتبر نتائج الرسم البياني للخلايا CFSE المسمى كأحد ذروة إيجابية للغاية وحادة. ومع ذلك، عندما حدث التنشيط، وانتشار يكون واضحا كما تجلى بذ عدة قمم صغيرة مع خسارة والأيسر تحول للكثافة مضان (الشكل 3). عندما حدث قمع الانتشار، أي، مع ثقافة مشتركة من اللجان الدائمة، فإن قمم متعددة أصغر ينخفض ​​مع زيادة ما يصاحب ذلك من شدة الفلورسنت كما يتضح من خلال التحول من قمم للحق وزيادة في الحدة من اليمين . معظم الذروة التي تمثل الخلايا عدم تقسيم الشكل 4 يدل على المخطط العام للاختلاف واحد من هذه التجربة: تقييم قمع المستجيب من الكريات البيضاء المناعية MSC التي يسببها على تنشيط المستجيب الصنعية CD4 + T الخلايا. نتائج مثل الاختلاف على تجربة مشابهة لفحص الأصلي، مع معلومات إضافية من تعتمد على الجرعة قمع انتشار ينظر (الشكل 5).

الشكل 1. مخطط تدفق لتقييم الآثار المناعية للخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) على الكريات البيض المستجيب خيفي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. مورفولوجيا خلية من اللجان الدائمة، كريات الدم البيضاء، وشارك في ثقافة اثنين من السكان الخلية. على النقيض من المرحلة الصور المجهري للثقافة وحيدة الخلية من اللجان الدائمة أو الكريات البيض، وMSC-الكريات البيض الثقافة المشتركة. شريط النطاق، 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. MSC الآثار القمعية على تكاثر الكريات البيض. تدفق cytometric الرسم البياني للcarboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) انتشار الكريات البيض -labeled (A) مثقف وحدها unstimulated، (B) ثقافة مشتركة مع اللجان الدائمة، (C) مثقف مع مكافحة CD3 / CD28 microbead التحفيز (α-CD3 / CD28) وحدها، (D) ومع اللجان الدائمة. النسب هو مبين في رسوم بيانية تدل نسبة الكريات البيض المتكاثرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4. مخطط تدفق لتقييم MSC الناجم عن المناعة الكريات البيض على CD4 + خيفي المستجيب الخلايا اللمفية تي.تحميل / 53265 / 53265fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5. القمعية قدرة حيدات CD14 MSC-شارك في تربيتها على تكاثر الخلايا اللمفية CD4. مبعثر المؤامرة وتدفق cytometric الرسم البياني للقدرة القمعية من MSC-شارك في تربيتها CD14 + حيدات (M-CD14 +) على مكافحة CD3 / CD28 microbead -stimulated، CFSE المسمى CD4 + T المستجيب الخلايا الليمفاوية (S-CD4 +). وأظهرت نسبة المشاركة في ثقافة S-CD4 + إلى M-CD14 +. تم بوابات CD4 + T الليمفاوية (R1) وتقييم لشدة CFSE. النسب هو مبين في رسوم بيانية تدل نسبة تكاثر الخلايا CD4 + T. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من الهو الرقم.

ليس لدينا ما نكشف عنه.