أخذ عينات الدم المتكررة ضروري ومهم في البحوث على. لقد طورنا طريقة جديدة وغير مميتة وموثوقة لجمع الدم المتكرر من أسماك الزرد البالغة ، وطبقنا هذه الطريقة على دراسة الكيمياء الحيوية للدم ، بما في ذلك استقلاب الجلوكوز.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
كرر جمع الدم لاختبارات الدم في اسماك الزرد الكبار
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
جمع الدم المتكررة هي واحدة من التقنيات الأكثر شيوعا التي أجريت على حيوانات المختبر. ومع ذلك، لم يثبت بروتوكول غير قاتلة لجمع الدم من الزرد. الطرق السابقة لجمع الدم من الزرد هي القاتلة، مثل شق الجانبي، وقطع الرأس والذيل الاجتثاث. وهكذا وضعنا رواية "المتكررة" طريقة جمع الدم، والحاضر هنا بروتوكول مفصلة توضح هذا الإجراء. هذا الأسلوب هو الغازية الحد الأدنى والنتائج في معدل وفيات منخفضة جدا (2.3٪) لالزرد، وبالتالي تمكين المتكررة اخذ عينات من الدم من نفس الفرد. الحد الأقصى لحجم اخذ عينات من الدم يعتمد على وزن جسم السمكة. يجب أن يكون حجم لأخذ عينات الدم المتكرر على فترات ≤0.4٪ من وزن الجسم كل أسبوع أو ≤1٪ كل 2 أسابيع، والتي تم تقييمها من قبل القياسات الهيموغلوبين في الدم. بالإضافة إلى ذلك، الهيموجلوبين، وصوم الجلوكوز في الدم، الدهون الثلاثية البلازما (TG) وإجمالي جتم قياس مستويات holesterol في الزرد الكبار من الذكور والإناث. علينا أيضا أن تطبق هذه الطريقة للتحقيق في ديسريغولاتيون ايض الجلوكوز في النظام الغذائي الناجم عن السمنة. هذه الطريقة سوف جمع الدم تسمح العديد من التطبيقات، بما في ذلك الجلوكوز واستقلاب الشحوم والدراسات الدموية، الأمر الذي سيزيد من استخدام الزرد كنموذج المرض كائن البشري.
المقدمة
الزرد تكتسب شعبية متزايدة باعتبارها نموذجا قيما من الأمراض التي تصيب الإنسان بسبب أعضائهم وعلم الوراثة مماثلة لتلك التي من البشر 1،2. في مجال علم الأحياء التطوري، وقد أثبتت العديد من الدراسات أن الزرد وتظهر البشري علامة التشابه في تكون الدم 3، الارقاء 4،5، وتكون النقويات 6. وتستخدم الزرد الكبار أيضا لدراسة المناعية 7، 8 الاعصاب والأمراض المرتبطة بالسمنة 9 لأن هذا النموذج الحي سهم مسارات مشتركة مع تلك تعطلت في الأمراض التي تصيب الإنسان. للسمنة والأمراض المرتبطة بالسمنة (السكري، تشحم الكبد غير الكحولي والتهاب الكبد الدهني وتصلب الشرايين)، وقد تم التحقيق الزرد السكر في الدم ومستويات الدهون تماما في العديد من النماذج المعدلة وراثيا السمنة والنظام الغذائي الناجم عن 10-13.
سوف تتكرر أخذ عينات دم من الحيوانات الفردية تقليل استخدام الحيواني وديسمبرrease الخلافات interindividual. ومع ذلك، وجمع عينة متكررة من الصعب من الناحية الفنية في الحيوانات الصغيرة مثل الزرد بسبب حجمها الصغير نسبيا في الدم وعدم وجود السفن الوصول إليها بسهولة. وقد وضعت عدة طرق لجمع الدم لمرة واحدة من الزرد، على الرغم من أن هذه الطرق لها سلبياتها الخاصة، بما في ذلك الفتك، تلف الأنسجة المرتبطة وحجم الدم محدودة. على سبيل المثال، 1-5 الدم ميكرولتر يمكن حصاده من شق الوحشي من حوالي 0.3 سم في الطول في المنطقة من الشريان الأبهر الظهري 5. قطع الرأس مع مقص من خلال قطع حزام الصدر يمكن جمع 5-10 ميكرولتر الدم 10. مريحة طريقة أخرى أخذ عينات الدم هو ذيل الاجتثاث 14. ثقب في القلب هو طريقة بديلة محتملة واحدة لجمع الدم المتكررة من نفس السمك، ولكن كمية صغيرة جدا الحصول على (ما يقرب من 50 NL) مع هذا الإجراء يحد من عدد من التحليلات التي يمكن أن تكون ادائهاميد 11. وفقا لذلك، هناك حاجة إلى بروتوكول جديد لتمكين المتكررة اخذ عينات من الدم غير المميتة، والتي ستكون تقدما بالغ الأهمية اللازمة لهذا الكائن أن يكون كائن النموذج القياسي لأمراض الإنسان. أن هذه التقنية تسمح لاختبار استجابة الدوائية، اكتشاف المؤشرات الحيوية الجزيئية للتشخيص وتحديد التشخيص، ورصد مختلف الأمراض، مثل أمراض التمثيل الغذائي والأمراض التنكسية وعدة أنواع من الأورام الخبيثة.
لذا طورنا طريقة مينيملي للحصول على الدم من الزرد متسلسل 15. نحن هنا لشرح الإجراء بصريا وتوفير بروتوكول مفصلة لهذه التقنية. باستخدام هذه الطريقة، تم تقييم القيمة العادية على أساس معايير مختلفة، بما في ذلك الهيموغلوبين، وصوم الجلوكوز في الدم، ونسبة الدهون في الدم من الزرد البالغين الأصحاء. بالإضافة إلى ذلك، نحن أيضا تقييم ما إذا كانت هذه الطريقة مناسبة للدراسات التي تتطلب عينات التسلسلية التي كتبها monitoring التغيرات الزمانية في مستويات السكر في الدم أثناء التجارب فرط.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من لجنة أخلاقيات جامعة مي، وتم إجراء فقا لالياباني تنظيم الرفق بالحيوان "قانون رعاية وإدارة الحيوانات" (وزارة البيئة في اليابان) والامتثال للمبادئ التوجيهية الدولية.
1. إعداد إبرة
ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب تحت التخدير، وقدمت كل الجهود للحد من المعاناة. للقتل الرحيم، ومغمورة الأسماك في حمام الماء المثلج (5 أجزاء الجليد / 1 جزء ماء في ≤4 درجة مئوية) ل≥20 دقيقة.
- إعداد الإبر الزجاج microcapillary عن طريق سحب الزجاج 1.0 ملم-الخارجي قطرها الشعرية مع مجتذب إبرة (الشكل 1A).
- قطع نصائح من الإبر بشكل غير مباشر باستخدام مقص غرامة (الشكل 1B). يجب أن يكون قطر الحافة المثالي حوالي 100-200 ميكرون (الشكل 1C). إذا كان diamete طرفص ضيقة جدا، وسوف الدم لا يدخل الإبرة.
- حل الهيبارين في المياه المالحة إلى تركيز 5 ملغ / مل.
- وضع إبرة قبل القطع في نهاية الأنفية من تجميع أنبوب الشافطة وعقد لسان حال في الفم، أو ربط الإبرة إلى موزع لمبة. تزج رأس إبرة في حل الهيبارين، ويعالج بالهيبارين إبرة عن طريق الشفط والنفخ من خلال حل (1D الشكل و1E).
ملاحظة: تم استخدام أنبوب التجميع الشافطة لالزرد الحيوانات المنوية الحفظ بالتبريد 16. أنبوب المطاط طويلة يمكن أن يوقف أي دم تحلق في الفم. ويمكن تحديد مرشح في منتصف الطريق من الأنبوب تجنب المخاطر. - تخزين الإبر heparinized في طبق بتري 10 سم والهواء الجاف لا يقل عن 1 ساعة. يمكن إعداد عدد كبير من الإبر مقدما.
2. التخدير
- تحضير محلول مخدر في حالة من البلاستيك الصغيرة عن طريق خلط 200 مل من الماء السمك مع 100 ميكرولتر من 2 فينوكسييثانول (2-PE). التركيز النهائي من التخدير هو 500 جزء في المليون.
الحذر! 2-PE له تأثير سريع. - إزالة العدد المطلوب من السمك (AB سلالة) من نظام التداول.
- استخدام شبكة لنقل الأسماك في التخدير ل1-2 دقيقة (الشكل 1F). مراقبة الأسماك تسبح تدريجيا، وانتشار الزعانف الصدرية أفقيا، لهاث، ويكون الغطاء الخيشومي الحركات السريعة في حدود 1 دقيقة.
- كما يذهب الوقت على، ومراقبة الأسماك تقع في الجزء السفلي من هذه القضية، وأخيرا وقف السباحة. والطائرة من التخدير الجراحي تصل عند توقف الأسماك إلى اللحظات والحركات الغطاء الخيشومي بطيئة. عند هذه النقطة، الأسماك على استعداد لجمع الدم.
- باستخدام مقشدة رفع الأسماك تخدير من 2-PE ووضعه برفق على منشفة ورقية مبللة مع التخدير (الشكل 1G). تغطية رأس السمكة مع ورقة الأنسجة الرخوة غارقة أيضا مع حل 2-PE لمنع جفاف العين واستخدام المناديل الورقية الناعمة الجافة أخرى لبلطفتجف من على سطح الجسم.
3. جمع الدم
- وضع إبرة heparinized في نهاية الأنفية للجمعية أنبوب الشافطة (أو موزع لمبة) وعقد نهاية الناطقة باسم التجمع أنبوب الشافطة في الفم.
- فهم في نهاية الأنفية والإبرة معا، وإزالة موازين التدخل بعناية مع طرف الإبرة. ادخال الإبرة في 30 - 45 درجة زاوية في موقع جمع الدم. تجنب ثقب الجهاز الهضمي (الشكل 1H). في حالة استخدام لمبة موزع، اضغط على لمبة مع الإبهام والإصبع الوسطى، ومنع ثقب في طرف لمبة مع الإصبع الأول، ثم أدخل الإبرة كما هو موضح أعلاه.
ملاحظة: هذا الموقع لجمع الدم على طول محور الجسم والخلفية إلى فتحة الشرج في المنطقة من الشريان الأبهر الظهري. الشريان الأبهر الظهري (DA) والوريد الخلفي الكاردينال (PCV) ليست سوى بطني في العمود الفقري (الشكل 2). - تبدأ في مصالناطقة بلسان نهاية الأنبوب التجمع الطموح عندما يشعر الإبرة لمس العمود الفقري. إذا لم يرتفع في الدم، ونقل معلومات سرية إبرة بمهارة باليد لتشجيع تدفق الدم. لاحظ أنه بمجرد الدم يرتفع إلى الإبرة، والتوقف فورا عن الهز برفق وتمتص (الشكل 1I). في حالة استخدام لمبة موزع، والإفراج عن الضغط من لمبة لنضح الدم.
- نلاحظ ان الدم ترتفع ببطء في الإبرة بطريقة نابض دون شفط، والتي من المرجح بسبب ضغط الدم الشرياني. وبالتالي، فإنه ليس من الضروري أن تمتص إذا كانت إبرة تخترق الشريان بشكل صحيح.
- وقف الشفط بعد أن يتم جمع حجم مناسب من الدم. إزالة الإبرة من الأسماك والضغط على الموقع ثقب باستخدام المناديل الورقية الناعمة لوقف أي نزيف. مراقبة وقف النزيف بعد حوالي 10-20 ثانية من ضغط الإصبع (الشكل 1J).
- بعد توقف النزيف، ونقل على الفور الأسماك مرة أخرى إلى شركة كليوالمياه الدافئة (~ 28 ° C) دبابة. مساعدة الأسماك للتعافي من قبل يحوم بلطف المياه نحو الخياشيم حتى يبدأ في السباحة.
ملاحظة: حافظ على ما يصل الى 5 الأسماك postsampling في خزان 2 L وربط خزان لنظام التداول إلى الأوكسجين الأسماك. إضافة المضادات الحيوية إلى أسماك المياه ليست ضرورية. الحفاظ على الأسماك مع السكن العادي والتغذية. - طرد الدم من الإبرة إلى منطقة نظيفة من قطعة من parafilm (الشكل 1K).
- قياس السكر في الدم باستخدام أي غلوكمتر يده التجاري (الشكل 1L).
ملاحظة: يستخدم غلوكمتر الجلوكوز-فلافين نازعة الأدينين ثنائي النوكليوتيد القطب ويتطلب حجم عينة من 0.6 ميكرولتر.- إدراج شريط الاختبار تماما في متر وتلمس مباشرة قطرة دم. مراقبة سحب الدم إلى شريط الاختبار تلقائيا والحصول على نسبة الجلوكوز في الدم نتيجة 5 ثانية على منطقة العرض. سجل النتيجة وتجاهل شريط الاختبار. إستخدمجديد شريط الاختبار لكل قياس.
- (خطوة اختيارية) أخذ كميات دقيقة من الدم قبل pipetting لونقل الدم إلى أنبوب microcentrifuge لإجراء المزيد من التحليلات (خضاب الدم، الدهون الثلاثية (TG) والكوليسترول الكلي، وما إلى ذلك). إذا لزم الأمر، وتمييع الدم كله من الأسماك واحد بمحلول ملحي. الطرد المركزي عينات الدم لمدة 3 دقائق في 680 x ج في RT وحصاد البلازما. نقل البلازما في أنبوب جديد. في هذه المرحلة، وانها مستعدة لاستخدامها في التحليلات الكيميائية الحيوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يؤدي هذا الأسلوب جمع الدم الإصابة الحد الأدنى لالزرد (أ <1 مم ثقب؛ الشكل 1J) وينتج معدل وفيات منخفض جدا من 2.3٪. درسنا الحد الأقصى لحجم الدم التي يمكن جمعها من سمكة واحدة وتقييم العلاقة لوزن الجسم (الشكل 3). وجدنا أن حجم الدم الأقصى التي تم جمعها مرتبطة خطيا مع وزن الجسم (R = 0.813). وكان أكبر حجم الدم التي تم جمعها من الأسماك الفردية (وزن الجسم = 1.071 ز) 25 ميكرولتر، وكان أصغر حجم 1.3 ميكرولتر من سمكة وزنها 0.115 غرام. هذا يشير إلى أن الحد ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نقدم هنا بروتوكول مفصلة للحصول على متسلسل الدم من الزرد الكبار. هذه الطريقة واضحة ومباشرة لتنفيذ ونستخدمها في المختبر على أساس يومي. ويستند هذا الأسلوب جمع الدم على إدخال إبرة الشعرية الزجاج في ظهري الشريان الأورطي الزرد ل. خلال هذا الإجراء، فمن الأهمية بمكان أن نكون حذرين حتى لا يجتذ العمود الفقري لأنه هو المعيار للبحث عن الشريان الأبهر الظهري. والحد من إصابة العمود الفقري تحسين معدل البقاء على قيد الحياة. على الرغم من أن هذه التقنية بسيطة وسهلة لسيده، وهناك أفضل الممارسات التي ي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل بواسطة JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 and 25590073. ونود أن نشكر السيدة يوي نامي على الرسم التوضيحي المرسوم يدويا، والسيد كوشي كاتاوكا والسيدة سايوري إيتشيكاوا على المساعدة في صيانة أسماك الزرد.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الشعيرات الدموية الزجاجية ذات القطر الخارجي | Narishige | GD-1 | 1.0 مم. |
| مجتذب إبرة | Narishige | PC-10 | لإنتاج الإبر |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | لتجميع |
| أنبوب الشفاط | بالهيبارين Drummond | 2-040-000 | لجمع الدم |
| موزع لمبة | Drummond | 1-000-9000 | لجمع الدم |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | لتخدير الأسماك |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | - | لقياس الهيموجلوبين |
| شرائح DRI-CHEM | Fujifilm | Hb-WII | لقياس الهيموجلوبين |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | - | لقياس الجلوكوز |
| Wako L-type TG | Wako Pure Chemical | Industries 464-44201 | ل TG قياس |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | لقياس الكوليسترول الكلي |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | لطرد الدم |
المراجع
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 239-249 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br J Haematol. 107 (4), 731-738 (1999).
- Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult. Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).
- Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Exp Hematol. 42 (8), 697-706 (2014).
- Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations. Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Dis Mod Mech. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10 (21), (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), e36474(2012).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish. Zebrafish. 10 (3), 425-432 (2013).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).
- Thorson, T. B. The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).
- Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri). Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
- Nahas, K., Provost, J. -P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats. Lab Anim. 34 (4), 362-371 (2000).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. DevDyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Andersson, O., et al. Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo. Cell Metab. 15 (6), 885-894 (2012).
- Hiramitsu, M., et al. Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis. Sci Rep-UK. 4, 3708(2014).
- Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model. J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).
- Schlegel, A. Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology. Cell Mol Life Sci. 69 (23), 3953-3961 (2012).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Thomas, C. D., et al. Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans. Am J Clin Nutr. 55 (5), 934-942 (1992).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
