Method Article

العزلة الفيروسية النسخ المتماثل حجرة التخصيب النووي الكسور الفرعية من اتش المصابة الخلايا الطبيعية الإنسان

DOI:

10.3791/53296

⸱

November 12th, 2015

 , 
1Centro de Investigación en Dinámica Celular, Instituto de Investigación en Ciencias Básicas y Aplicadas, Universidad Autónoma del Estado de Morelos, 2Instituto de Biotecnologìa, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم استراتيجية جديدة لعزل مقصورات التكاثر الفيروسي (RC) عن الخلايا البشرية المصابة بالفيروس الغدي (Ad). يمثل هذا النهج نظاما خاليا من الخلايا يمكن أن يساعد في توضيح الآليات الجزيئية التي تنظم تكرار الجينوم الفيروسي والتعبير عنه بالإضافة إلى تنظيم التفاعلات الفيروسية والمضيف التي تم إنشاؤها في RC.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثناء إصابة الخلايا البشرية بالفيروس الغدي (Ad) ، يتم إعادة تنظيم نواة الخلية المضيفة بشكل كبير ، مما يؤدي إلى تكوين بيئات مكروية نووية من خلال تجنيد البروتينات الفيروسية والخلوية في المواقع التي يشغلها الجينوم الفيروسي. يمكن اعتبار هذه المواقع ، التي تسمى مقصورات النسخ المتماثل (RC) ، مجالات نووية ناتجة عن الفيروس حيث يكون الجينوم الفيروسي موضعيا ويتم تجنيد البروتينات الفيروسية والخلوية التي تشارك في النسخ المتماثل والنسخ والمعالجة اللاحقة للنسخ. علاوة على ذلك ، يتم أيضا اختيار البروتينات الخلوية المشاركة في الاستجابة المضادة للفيروسات ، مثل البروتينات المثبطة للورم ، ومكونات استجابة تلف الحمض النووي (DDR) وعوامل الاستجابة المناعية الفطرية في RC. وعلى الرغم من أن المنسقين المقيمين يبدو أنهم يلعبون دورا حاسما في تعزيز دورة التكرار الفعالة والإنتاجية، لم يتم إجراء تحليل مفصل لتكوينها والأنشطة المرتبطة بها. لتسهيل دراسة RC الفيروسي الغدي وربما تلك الموجودة من فيروسات الحمض النووي الأخرى التي تتكاثر في نواة الخلية ، قمنا بتكييف إجراء بسيط يعتمد على تدرجات السرعة لعزل Ad RC وأنشأنا نظاما خاليا من الخلايا قادرا على إجراء دراسات مورفولوجية ووظيفية وتركيبية لهذه الهياكل دون النووية التي يسببها الفيروس ، وكذلك لدراسة تأثيرها على تفاعلات الخلية المضيفة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغدية تحتوي على جينوم الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل أن يعيد في نواة الخلية المصابة. عندما يدخل الحمض النووي الفيروسي النواة، فإنه يموضع المجاور للهيئات النووية PML 1. بعد الفيروسي التعبير الجيني المبكر، وإعادة تنظيم الهيكل النووية بشكل كبير، الأمر الذي أدى تشكيل microenvironments الفيروسية، ووصف المقصورات تكاثر الفيروس (RC) 2. منذ اتش (الإعلان) RC من المواقع حيث تكرار الجينوم الفيروسي والتعبير عن الجينات الفيروسية أواخر تأخذ مكان، لأنها توفر بيئة ملائمة لتوظيف جميع العوامل الفيروسية والخلوية اللازمة التي تشارك في هذه العمليات. ومن المثير للاهتمام، ومجموعة متنوعة من البروتينات الخلوية المسؤولة عن ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HFF خلية الثقافة والإعلان العدوى

  1. نشر فيروس Ad5 WT في الطبقات الوحيدة من HEK-293 الخلايا وعيار وحدات تشكيل الفلورسنت (FFU) على خلايا HFF كما هو موضح سابقا 8.
  2. تنمو الخلايا الليفية القلفة الإنسان (HFF) في 10 مل من DMEM / 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) في الثقافة العقيمة 100 ملم أطباق في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب. تحديد عدد الخلايا باستخدام غرفة نويباور عن طريق عد الخلايا في أربع مجموعات 16 مربعا. يتم الحصول على عدد الخلايا لكل مل عن طريق حساب متوسط ​​عدد الخلايا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منذ مقصورات تكاثر الفيروس (RC) هي هياكل الفيروسية التي يسببها النووية الدقيقة تتكون من البروتينات والأحماض النووية، على غرار المجالات النووية الأخرى، فإنها تبين أن تكون قابلة للعزل من قبل تدرجات السرعة على أساس الخصائص الكيميائية الحيوية. ويوضح الخطوات الحاسمة في البروتوكول تجزئة في الشكل 1. في كل خطوة تحتاج العينات التي سيتم رصدها من قبل مشرق المجهري الميدان لضمان سلامة الكسور شبه الخلوية المختلفة. على سبيل المثال، عندما تورم الخلايا، وفترة حضانة في المنطقة العاز.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل توضيح الآليات الجزيئية التي تحكم تنظيم الأنشطة الخلوية عن طريق العدوى الفيروسية ، سيكون فهم التكوين والأنشطة المرتبطة ب RC مفيدا. لذلك ، لإجراء تحليل مفصل ل RC ، أنشأنا نظاما خاليا من الخلايا يستفيد من الحجم والتركيب الكيميائي الحيوي لهذه الهياكل التي يسببها الفيروس ، لعزل الكسور دون النووية المخصبة ب RC باستخدام إجراء بسيط يعتمد على تدرجات السرعة مع وسائد السكروز. الخطوات الحاسمة للإجراء التي تتطلب التوحيد القياسي اعتمادا على نوع الخلية المستخدمة هي: أنا) توحيد الأوقات المستخدمة لتورم الخلايا لتجنب تعطيل النوى. ث.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بمنح من CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) و Promep-SEP ل R.A.G. ؛ حصل P.H. على منحة دراسية من CONACyT (447442).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMGibco12100-046دافئ في 37 & ordm; حمام مائي C قبل الاستخدام
مصل الأبقار الجنينيGibco12484-028
السكروز ، Ultra PureResearch Organics0928Sقم بإعداد محلول مخزون 2.55 متر وتخزينه في 4 & ordm ؛ C
Dounce الخالطKontess Glass Company884900-0000
برانسون 1800 حمام بالموجات فوق الصوتيةبرانسونZ769533  SIGMAقم بتشغيله قبل 15 دقيقة من الاستخدام.
المضاد الثانوي للماعز المضاد للفأر IgG1 ، Alexa Fluor 488 ConjugateLife TechnologiesA-21121استخدم عند تخفيف 1: 2,000 في PBS
Silane-Prep SlidesSigmaS4651-72EAافتح في خزانة تدفق رقائقي
SuperSignal West Pico Chemiluminescent SubstratePierce ThermoScientific34080
الجسم

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doucas, V., et al. Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure. Genes & Dev. 10, 196-207 (1996).
  2. Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J. Virol. 88, 1404-142....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Viral Replication CompartmentsAdenovirus infected CellsSub nuclear Fraction IsolationVelocity Gradient CentrifugationCell free SystemNuclear Lysate PreparationImmunofluorescence AnalysisE2A DNA Binding ProteinViral DNA EnrichmentHost cell Interactions

Related Articles