Method Article

العزلة الفيروسية النسخ المتماثل حجرة التخصيب النووي الكسور الفرعية من اتش المصابة الخلايا الطبيعية الإنسان

DOI:

10.3791/53296

⸱

November 12th, 2015

 , 
1Centro de Investigación en Dinámica Celular, Instituto de Investigación en Ciencias Básicas y Aplicadas, Universidad Autónoma del Estado de Morelos, 2Instituto de Biotecnologìa, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم استراتيجية جديدة لعزل مقصورات التكاثر الفيروسي (RC) عن الخلايا البشرية المصابة بالفيروس الغدي (Ad). يمثل هذا النهج نظاما خاليا من الخلايا يمكن أن يساعد في توضيح الآليات الجزيئية التي تنظم تكرار الجينوم الفيروسي والتعبير عنه بالإضافة إلى تنظيم التفاعلات الفيروسية والمضيف التي تم إنشاؤها في RC.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثناء إصابة الخلايا البشرية بالفيروس الغدي (Ad) ، يتم إعادة تنظيم نواة الخلية المضيفة بشكل كبير ، مما يؤدي إلى تكوين بيئات مكروية نووية من خلال تجنيد البروتينات الفيروسية والخلوية في المواقع التي يشغلها الجينوم الفيروسي. يمكن اعتبار هذه المواقع ، التي تسمى مقصورات النسخ المتماثل (RC) ، مجالات نووية ناتجة عن الفيروس حيث يكون الجينوم الفيروسي موضعيا ويتم تجنيد البروتينات الفيروسية والخلوية التي تشارك في النسخ المتماثل والنسخ والمعالجة اللاحقة للنسخ. علاوة على ذلك ، يتم أيضا اختيار البروتينات الخلوية المشاركة في الاستجابة المضادة للفيروسات ، مثل البروتينات المثبطة للورم ، ومكونات استجابة تلف الحمض النووي (DDR) وعوامل الاستجابة المناعية الفطرية في RC. وعلى الرغم من أن المنسقين المقيمين يبدو أنهم يلعبون دورا حاسما في تعزيز دورة التكرار الفعالة والإنتاجية، لم يتم إجراء تحليل مفصل لتكوينها والأنشطة المرتبطة بها. لتسهيل دراسة RC الفيروسي الغدي وربما تلك الموجودة من فيروسات الحمض النووي الأخرى التي تتكاثر في نواة الخلية ، قمنا بتكييف إجراء بسيط يعتمد على تدرجات السرعة لعزل Ad RC وأنشأنا نظاما خاليا من الخلايا قادرا على إجراء دراسات مورفولوجية ووظيفية وتركيبية لهذه الهياكل دون النووية التي يسببها الفيروس ، وكذلك لدراسة تأثيرها على تفاعلات الخلية المضيفة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغدية تحتوي على جينوم الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل أن يعيد في نواة الخلية المصابة. عندما يدخل الحمض النووي الفيروسي النواة، فإنه يموضع المجاور للهيئات النووية PML 1. بعد الفيروسي التعبير الجيني المبكر، وإعادة تنظيم الهيكل النووية بشكل كبير، الأمر الذي أدى تشكيل microenvironments الفيروسية، ووصف المقصورات تكاثر الفيروس (RC) 2. منذ اتش (الإعلان) RC من المواقع حيث تكرار الجينوم الفيروسي والتعبير عن الجينات الفيروسية أواخر تأخذ مكان، لأنها توفر بيئة ملائمة لتوظيف جميع العوامل الفيروسية والخلوية اللازمة التي تشارك في هذه العمليات. ومن المثير للاهتمام، ومجموعة متنوعة من البروتينات الخلوية المسؤولة عن الاستجابة المضادة للفيروسات الخلوية، مثل استجابة الحمض النووي من التلف، والاستجابة المناعية الفطرية وقمع الورم هي تحييدهم لهذه المواقع الفيروسية 2. وبالتالي، يمكن اعتبار الإعلان RC المحاور التنظيمية التي تعزز تكاثر الفيروس الفعال في حين تنظم بالتزامن فياستجابة المضادة للفيروسات الخلوية، مشيرا إلى أن هذه الهياكل هي المفتاح لفهم الفيروس في استضافة التفاعلات الخلية. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية لتشكيل RC، وغير مفهومة تكوينها والأنشطة المرتبطة بها.

الفيروسة الغدانية RC، وكذلك RC من الفيروسات DNA الأخرى التي تحاكي في النواة لا ترتبط إلى الأغشية، وعلى النقيض من RC حشوية 3. وعلاوة على ذلك، من المرجح أن تكون مؤلفة بالكامل من البروتينات والأحماض النووية هذه الهياكل التي يسببها الفيروس. RC تشكلت في الخلايا المصابة بفيروسات RNA (عادة ما تسمى المصانع الفيروسية) تم عزلها، والاستفادة من توطين حشوية ومركزهم بغشاء، والتي سهلت الصرفية الخاصة بهم تفصيلا، وظيفية والكيمياء الحيوية توصيف 4.

على حد علمنا، الفيروسي RC النووي لم يتم عزلها، وربما يرجع ذلك إلى تعقيد الهندسة المعمارية النووية وغياب متر داخل النواةembranes التي من شأنها تسهيل عزلتهم. وقد اعتمدت الدراسة بدلا من ذلك على الفحص المجهري المناعي، FISH وانتقال المجهر الإلكتروني. ومع ذلك، على الرغم من التعقيدات الملازمة لعزل المنشآت النووية الدقيقة المجالات النووية الأخرى مثل نويات والهيئات كاجال تم عزلها قبل 5،6. منذ الأنوية وRC كلاهما يتألف من البروتينات والأحماض النووية، ويكون قطرها بين 0،5-5 ميكرون، ونحن افترضنا أن RC ينبغي أيضا أن تكون قابلة للعزل. ولذلك، من أجل توصيف أكثر دقة التركيب الجزيئي وظائف المرتبطة RC، أنشأنا طريقة جديدة لعزل كسور النووية الدقيقة المخصب مع RC. تحقيقا لهذه الغاية، ونحن على استعداد الكسور شبه النووي باستخدام تدرجات السرعة وسائد السكروز مماثلة إلى الإجراءات المستخدمة لعزل نويات 7 أو المجالات النووية الأخرى 6، وأنشأ نظام خالية من الخلايا التي تسمح للدراسة التركيب الجزيئي والأنشطة المرتبطة بهاRC. ولذلك ينبغي أن هذه التقنية تقدم فهم الفيروس في استضافة التفاعلات الخلية ويمثل أداة قوية التي ينبغي أيضا تسهيل تحليل مفصل لRC من الفيروسات الأخرى التي تحاكي في النواة ولحث على تشكيل حجرات تكرار أبعاد مماثلة لتلك التي تشكلت في adenovirus- الخلايا المصابة، مثل فيروس الهربس، الورم الحلمي أو polyomaviruses.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HFF خلية الثقافة والإعلان العدوى

  1. نشر فيروس Ad5 WT في الطبقات الوحيدة من HEK-293 الخلايا وعيار وحدات تشكيل الفلورسنت (FFU) على خلايا HFF كما هو موضح سابقا 8.
  2. تنمو الخلايا الليفية القلفة الإنسان (HFF) في 10 مل من DMEM / 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) في الثقافة العقيمة 100 ملم أطباق في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب. تحديد عدد الخلايا باستخدام غرفة نويباور عن طريق عد الخلايا في أربع مجموعات 16 مربعا. يتم الحصول على عدد الخلايا لكل مل عن طريق حساب متوسط ​​عدد الخلايا في أربع مجموعات 16 مربع، وضرب هذا الرقم بنسبة 10 4. في كل مرة بعد الإصابة المدرجة في الخطوة 1.3، استخدم 1 × 10 7 خلايا HFF.
  3. همية تصيب أو تصيب خلايا HFF مع نوع اتش 5 (Ad5) من النوع البري (WT) (H5pg4100 8) في 100 ملم أطباق زراعة الأنسجة باستخدام 1 مل من Ad5 في DMEM لكل طبق في وزارة الداخلية من 30 التركيز تشكيل وحدة، أو FFU ، لكل خلية. احتضان لمدة 2 ساعة في آهumidified حاضنة الثقافة خلية على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، هزاز بعناية الأطباق كل 15 دقيقة لضمان التوزيع المتجانس لقيحة الفيروس على الخلايا. بعد هذا الوقت، وإزالة المتوسطة وإضافة DMEM جديدة تستكمل مع 10٪ FBS واحتضان لمدة 16 أو 24 أو 36 ساعة في ترطيب حاضنة الثقافة خلية في 37 º C و 5٪ CO 2. انتقل إلى الخطوة 2.1.

2. إعداد الكسور النووي الفرعية المخصب مع اتش RC

  1. حصاد Ad5 المصابة أو الخلايا المصابة وهمية HFF مع المزيل الخلية وجمع الخلايا في أنابيب الطرد المركزي معقمة. تحديد عدد الخلايا كما في الخطوة 1.2. استخدام 1 × 10 7 خلايا في كل مرة بعد الإصابة المحدد في الخطوة 1.3.
  2. الطرد المركزي الخلايا في 220 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. resuspend الكرية خلية في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة (137 ملي كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4 و 1.8 ملي KH 2 PO 4). غسل بيليه الخليةالصورة 3 مرات باستخدام 5 مل من PBS الجليد الباردة في غسل. لهذا الغرض، الطرد المركزي الخلايا في 220 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، صب وتجاهل طاف (SN)، و resuspend بيليه الخلية من قبل pipetting لطيف.
  4. لتعطيل غشاء البلازما، resuspend الكرية الخلية في 700 ميكرون لتر من العازلة الجليد الباردة ناقص التوتر (10 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.9، 10 ملي بوكل، 1.5 ملي MgCl 2، 0.5 ملي DTT، 20 μ غ / مل phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF) ، وهي مزيج من السيستين، سيرين، مثبطات الأنزيم البروتيني ثريونين وaspartyl بما في ذلك 10 μ غ / مل البقري البنكرياس مثبط التربسين، 10 μ غ / مل pepstatin A و 10 μ غ / مل N -acetyl-L-لوسيل-L-لوسيل-L -argininal)، والسماح للخلايا تنتفخ على الجليد لمدة 3 ساعات.
  5. ليز الخلايا باستخدام الخالط مع فضفاضة-A مدقة نوع تفلون. أداء 80 dounce السكتات الدماغية ورصد عينات كل 20 السكتات الدماغية التي كتبها مشرق المجهري الميدان لضمان أن جميع الخلايا هي lysed تم، ولكن هذا نواة لديها نبعد التمديد تضررت أو تمزق.
  6. أجهزة الطرد المركزي لجناسة الخلية في 300 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تخزين SN كما الكسر حشوية في -20 درجة مئوية في أنبوب الطرد المركزي.
  7. لإزالة الحطام الخلوي من نوى، resuspend الكرية في 750 μ لتر من محلول 1 (S1) (0.25 M السكروز، 10 ملي MgCl 2 20 μ غ / مل PMSF، وهي مزيج من السيستين، سيرين، مثبطات ثريونين وaspartyl البروتيني بما في ذلك 10 μ غ / مل البقري مثبط التربسين البنكرياس، 10 μ غ / مل pepstatin A و 10 μ غ / مل N -acetyl-L-لوسيل-L-لوسيل-L-argininal) وطبقة فوق حجم مساو من حل 2 (S2) (0.35 M السكروز، 0.5 ملي MgCl 2، 20 μ غ / مل PMSF، وهي مزيج من السيستين، سيرين، مثبطات ثريونين وaspartyl البروتيني بما في ذلك 10 μ غ / مل البقري البنكرياس مثبط التربسين، 10 μ غ / مل pepstatin A و 10 μ ز / مل N -acetyl-L-لوسيل-L-لوسيل-L-argininal). CENTRifuge في 1400 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  8. تجاهل SN باستخدام micropipette. تجنب إزعاج بيليه.
  9. resuspend الكرية التي تحتوي على نواة معزولة في 750 μ لتر من S2.
  10. عزل كسور النووية الدقيقة المخصب مع اتش RC (التعاون الإقليمي)، يصوتن معلق نوى مع حمام بالموجات فوق الصوتية، وذلك باستخدام اثنين من 5 دقائق البقول، أو حتى هي lysed كل نوى كما لاحظ مشرق المجهري الميدان. استخدام الثلج في حمام بالموجات فوق الصوتية حسب الحاجة للحفاظ على العينات عند أو أقل من 4 درجات مئوية.
  11. طبقة نوى sonicated على حجم مساو من حل 3 (S3) (0.88 M السكروز، 0.5 ملي MgCl 2) وأجهزة الطرد المركزي في 3000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تخزين طاف 1.5 مل باعتبارها جزء النواة إلى الهيولى (القروض المتعثرة) في -70 درجة مئوية. Resuspend وبيليه في 700 μ لتر من S2 والمخزن كما التعاون الإقليمي في -70 درجة مئوية.

3. التحليلات الغربية وصمة عار في إطار التعاون الإقليمي

ملاحظة: للحصول على تحليل البقعة الغربية من القروض المتعثرة والتعاون الإقليمي الكسور الصورةوآخرون جانبا 640 ميكرون لتر بالنسبة القروض المتعثرة و 300 μ لتر لإطار التعاون الإقليمي من إجمالي حجم حصلت عليه في الخطوة 2.11.

  1. مزيج 15 μ لتر من كل جزء النووية الدقيقة في 2X العازلة Laemmli (4٪ SDS، 20٪ الجلسرين، و 10٪ 2-المركابتويثانول، 0.004٪ برموفينول الأزرق، 0.125 M تريس حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8)، ويغلي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحميل العينات في 10٪ من الصوديوم دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (SDS-PAGE) تغيير طبيعة جل والبروتينات منفصلة عن 1.5 ساعة، في 20 مل أمبير (مللي أمبير).
  2. نقل البروتينات التي electroblotting مقابل 1.5 ساعة عند 400 مللي أمبير على البولي difluoride (PVDF) الأغشية.
  3. منع الغشاء لمدة 2 ساعة على RT باستخدام 3٪ غير دهن الحليب الجاف في برنامج تلفزيوني.
  4. احتضان O / N عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد فيروسي E2A بروتين ملزمة الحمض النووي (B6-8 9) في 1: 500 التخفيف في برنامج تلفزيوني / 0.3٪ غير دهن الحليب الجاف.
  5. غسل غشاء 3 مرات مع PBS / 0.1٪ توين 20 لمدة 10 دقيقة.
  6. احتضان الغشاء مع الماوس المضادة مفتش والثانويtibody يقترن إلى الغلوثانيون الحصان الفجل (HRP) في 1: 10000 التخفيف في برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعة على RT.
  7. غسل غشاء 3 مرات مع PBS / 0.1٪ توين 20 لمدة 10 دقيقة.
  8. تطوير الغشاء باستخدام تعزيز التوهج وأفلام الأشعة السينية.

4. الفيروسية الكشف عن الحمض النووي في إطار التعاون الإقليمي

ملاحظة: للحصول على عزل الحمض النووي من كل القروض المتعثرة والتعاون الإقليمي الكسور، استخدم 210 μ لتر لالقروض المتعثرة و 100 μ لتر لإطار التعاون الإقليمي من إجمالي حجم حصلت عليه في الخطوة 2.11.

  1. احتضان الكسور الفرعية النووية لمدة 1 ساعة على 55 درجة مئوية مع 1 ملغ / مل من بروتين K وتوين 20 بنسبة 0.5٪.
  2. تعطيل بروتين K التي يحتضنها العينات لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية.
  3. الطرد المركزي العينات في 20000 x ج، في RT لمدة 2 دقيقة.
  4. جمع SN. ترسيب الحمض النووي مع 1/10 حجم 3M خلات الصوديوم ومجلد واحد من الأيزوبروبانول، O / N عند 4 درجات مئوية.
  5. الطرد المركزي العينات في 20000 x ج، في RT لمدة 10 دقيقة.
  6. تجاهل ش SNالغناء micropipette. غسل بيليه مع الايثانول 70٪ والطرد المركزي في 20000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  7. Resuspend والحمض النووي في 10 μ ل 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.4 درجة الحموضة
  8. تحديد الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي عن طريق قياس الكثافة الضوئية (OD) في 260 نانومتر.
  9. لتضخيم الحمض النووي الفيروسي، استخدم 100 نانوغرام من الحمض النووي من كل جزء النووية الدقيقة في تفاعل PCR قياسي باستخدام طق بوليميريز الحمض النووي في 25 μ لتر من حجم رد الفعل مع الاشعال التي تسمح التضخيم من منطقة داخل اللواء وحدة النسخ في وقت متأخر من النوكليوتيدات 7273 ل النوكليوتيدات 7353 (81 بي بي) (FW: GAGCGAGGTGTGGGTGAGC؛ رف: GGATGCGACGACACTGACTTCA). استخدام الشروط دورة التالية: تمسخ الأولي لمدة 3 دقائق في 95 درجة مئوية، تليها 20 دورات من التضخيم (1 دقيقة في 95 درجة مئوية، الصلب لمدة 1 دقيقة في 62 درجة مئوية والإرشاد لمدة 30 ثانية في 72 درجة مئوية) وخطوة التمديد النهائي ل 3 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
  10. تشغيل المنتج PCR في 2٪ الاغاروز المواد الهلامية، في 90 V. وصمة عار مع إيثيديومبروميد عند 0.5 μ غ / مل تركيز النهائي وتصور DNA لإثبات تخصيب الحمض النووي الفيروسي في إطار التعاون الإقليمي. التعامل مع بروميد إيثيديوم بحذر شديد، ودائما تأكد من ارتداء قفازات، وهذا المركب هو المغير قوية. التخلص من بروميد إيثيديوم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.

5. وقت متأخر الفيروسية الكشف مرنا في إطار التعاون الإقليمي

ملاحظة: للحصول على عزل الحمض النووي الريبي من كل القروض المتعثرة والتعاون الإقليمي الكسور، استخدم 640 μ لتر لالقروض المتعثرة و 300 μ لتر لإطار التعاون الإقليمي من إجمالي حجم حصلت عليه في الخطوة 2.11.

  1. عزل الحمض النووي الريبي من كسور النووية الدقيقة باستخدام Trizol وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. Resuspend والحمض النووي الريبي في 50 μ لتر من DEPC (diethilpyrocarbonate) المياه المعالجة بالإثير.
  2. قياس الحمض النووي الريبي باستخدام معمل لقياس OD في 260 نانومتر (ويتم الحصول على حوالي 3 μ ز). تخزين الحمض النووي الريبي في 50 نانوغرام / ميكرون قسامات لتر في -70 درجة مئوية.
  3. تحقق RNA المنقىلعدم وجود تلوث DNA عن طريق إجراء مراقبة PCR رد الفعل في حالة عدم وجود الناسخ العكسي (RT)، وذلك باستخدام 5 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع والشروط دورة هو موضح في الخطوة 4.9.
    1. إذا تلوث DNA غائب يجب أن تنتج أي amplicon. إذا تلوث DNA هو الحاضر، احتضان عينات مع 10 U الدناز I، 10 U من ريبونوكلياز المانع، 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.3، 0.5 M بوكل و 15 ملي MgCl 2 لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. الشروع في إعادة عزل-RNA كما في الخطوة 5.1.
  4. لتحليل مرنا الفيروسي يرتبط إلى التعاون الإقليمي، تضخيم 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي من كل جزء النووية الدقيقة التي RT-PCR باستخدام بادئات تهدف إلى الكشف عن مرنا الفيروسة الغدانية المتأخر من الأسر الجينات المختلفة (الجدول 1).
    1. لالنسخ العكسي (RT)، استخدم 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي، من كل جزء النووية الدقيقة في رد فعل RT قياسي باستخدام M-MuLV RT انزيم في 20 μ لتر من حجم رد الفعل لمدة 1 ساعة على 42 درجة مئوية و 10 دقيقة في 70 درجة مئوية.
    2. لتضخيم، استخدم 1μ لتر من كدنا] في تفاعلات PCR، كما في الخطوة 4.9. استخدام الشروط التالية دورة: تمسخ الأولي لمدة 3 دقائق في 95 درجة مئوية، تليها 25 دورات من التضخيم (1 دقيقة في 95 درجة مئوية، الصلب لمدة 1 دقيقة في درجة الحرارة المحددة في الجدول 1 والإرشاد لمدة 30 ثانية في 72 درجة مئوية) و خطوة التمديد النهائي لمدة 3 دقائق في 72 درجة مئوية.
  5. تشغيل المنتجات RT-PCR في 2٪ الاغاروز المواد الهلامية، في 90 الهلام V. وصمة عار مع بروميد إيثيديوم عند 0.5 μ غ / مل تركيز النهائي ووضع تصور لإثبات جمعية أواخر مرنا الفيروسية لإطار التعاون الإقليمي. التعامل مع بروميد إيثيديوم كما هو مبين في خطوة 4.10.

6. المناعي التصور إطار التعاون الإقليمي

ملاحظة:-إجراء هذا الإجراء في إطار مجلس الوزراء تدفق الصفحي لتجنب تلوث العينات مع أي جزيئات الغبار، وتصفية كل الحلول قبل الاستخدام.

  1. بقعة 5 ميكرون لتر من الكسر إطار التعاون الإقليمي حصلت عليه في الخطوة 2.10 المزريةctly على شريحة المغلفة سيلاني.
  2. السماح للبقعة جافة لمدة 5 دقائق على RT.
  3. إعادة هيدرات التي ببطء وبشكل غير مباشر pipetting لμ 500 لتر من PBS في قطرة بجانب بقعة إطار التعاون الإقليمي والسماح لها التدفق عن طريق إمالة الشريحة. استنزاف قبالة PBS الزائدة من الجانب.
  4. كتلة من خلال تغطية العينة مع 500 μ لتر من PBS / 5٪ ألبومين المصل البقري (BSA) لمدة 2 ساعة على RT.
  5. غسل الشريحة 3 مرات بلطف وبشكل غير مباشر pipetting ل500 لتر ميكرون من PBS على العينة. إمالة الشريحة لاستنزاف قبالة PBS الزائدة.
  6. احتضان العينة مع الأجسام المضادة الأولية ضد E2A الفيروسي بروتين ملزمة الحمض النووي (B6-8 9) في 1: 500 التخفيف في برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعة على RT. تغطية العينة رصدت مع 20 μ لتر من محلول الأجسام المضادة واحتضان في غرفة رطبة لتجنب الجفاف.
  7. غسل العينة 3 مرات مع PBS / 0.02٪ توين 20 بواسطة بلطف وبشكل غير مباشر pipetting لμ 500 لتر من PBS على العينة. إمالة الشريحة لتصريف السابقينسيس محلول الغسيل.
  8. احتضان هذه العينات مع الماوس المضادة مفتش الأجسام المضادة الثانوية بالإضافة إلى fluorophore التي هو متحمس في 488 نانومتر في 1: التخفيف 2000 في برنامج تلفزيوني، لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية. تغطية العينة رصدت مع 20 μ لتر من محلول الأجسام المضادة واحتضان في غرفة رطبة لتجنب الجفاف.
  9. غسل العينة 3 مرات مع PBS / 0.02٪ توين 20 بواسطة بلطف وبشكل غير مباشر pipetting لμ 500 لتر من PBS على العينة. إمالة الشريحة لتصريف الحل غسل الزائد.
  10. تغطية العينة رصدت على الشريحة مع ساترة باستخدام 2 μ ل PBS / 10٪ الجلسرين كما تصاعد المتوسط. ختم بطلاء الأظافر واضحة ومحل درجة مئوية -20.
  11. تحليل العينات باستخدام مجهر مضان، مع هدف 63X وفتحة 1.4 الرقمية (NA) في الطول الموجي من 488 نانومتر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منذ مقصورات تكاثر الفيروس (RC) هي هياكل الفيروسية التي يسببها النووية الدقيقة تتكون من البروتينات والأحماض النووية، على غرار المجالات النووية الأخرى، فإنها تبين أن تكون قابلة للعزل من قبل تدرجات السرعة على أساس الخصائص الكيميائية الحيوية. ويوضح الخطوات الحاسمة في البروتوكول تجزئة في الشكل 1. في كل خطوة تحتاج العينات التي سيتم رصدها من قبل مشرق المجهري الميدان لضمان سلامة الكسور شبه الخلوية المختلفة. على سبيل المثال، عندما تورم الخلايا، وفترة حضانة في المنطقة العاز...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل توضيح الآليات الجزيئية التي تحكم تنظيم الأنشطة الخلوية عن طريق العدوى الفيروسية ، سيكون فهم التكوين والأنشطة المرتبطة ب RC مفيدا. لذلك ، لإجراء تحليل مفصل ل RC ، أنشأنا نظاما خاليا من الخلايا يستفيد من الحجم والتركيب الكيميائي الحيوي لهذه الهياكل التي يسببها الفيروس ، لعزل الكسور دون النووية المخصبة ب RC باستخدام إجراء بسيط يعتمد على تدرجات السرعة مع وسائد السكروز. الخطوات الحاسمة للإجراء التي تتطلب التوحيد القياسي اعتمادا على نوع الخلية المستخدمة هي: أنا) توحيد الأوقات المستخدمة لتورم الخلايا لتجنب تعطيل النوى. ث...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بمنح من CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) و Promep-SEP ل R.A.G. ؛ حصل P.H. على منحة دراسية من CONACyT (447442).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMGibco12100-046دافئ في 37 & ordm; حمام مائي C قبل الاستخدام
مصل الأبقار الجنينيGibco12484-028
السكروز ، Ultra PureResearch Organics0928Sقم بإعداد محلول مخزون 2.55 متر وتخزينه في 4 & ordm ؛ C
Dounce الخالطKontess Glass Company884900-0000
برانسون 1800 حمام بالموجات فوق الصوتيةبرانسونZ769533  SIGMAقم بتشغيله قبل 15 دقيقة من الاستخدام.
المضاد الثانوي للماعز المضاد للفأر IgG1 ، Alexa Fluor 488 ConjugateLife TechnologiesA-21121استخدم عند تخفيف 1: 2,000 في PBS
Silane-Prep SlidesSigmaS4651-72EAافتح في خزانة تدفق رقائقي
SuperSignal West Pico Chemiluminescent SubstratePierce ThermoScientific34080
الجسم

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doucas, V., et al. Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure. Genes & Dev. 10, 196-207 (1996).
  2. Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J. Virol. 88, 1404-1420 (2014).
  3. Boon, J. A., Diaz, A., Ahlquist, P. Cytoplasmic viral replication complexes. Cell host microbe. 8, 77-85 (2010).
  4. Paul, D., Hoppe, S., Saher, G., Krijnse-Locker, J., Bartenschlager, R. Morphological and biochemical characterization of the membranous hepatitis C virus replication compartment. J. Virol. 87, 10612-10627 (2013).
  5. Busch, H., et al. Isolation of Nucleoli. Exp Cell Res. 24, Suppl 9. 150-163 (1963).
  6. Lam, Y. W., Lyon, C. E., Lamond, A. I. Large-scale isolation of Cajal bodies from HeLa cells. Mol. Biol. Cell. 13, 2461-2473 (2002).
  7. Lam, Y. W., Trinkle-Mulcahy, L., Lamond, A. I. The nucleolus. J Cell Sci. 118, 1335-1337 (2005).
  8. Groitl, P., Dobner, T. Construction of adenovirus type 5 early region 1 and 4 virus mutants. Methods Mol Med. 130, 29-39 (2007).
  9. Reich, N. C., Sarnow, P., Duprey, E., Levine, A. J. Monoclonal antibodies which recognize native and denatured forms of the adenovirus DNA-binding protein. Virology. 128, 480-484 (1983).
  10. Leppard, K. N. Selective effects on adenovirus late gene expression of deleting the E1b 55K protein. J Gen Virol. 74 (Pt 4), 575-582 (1993).
  11. Gonzalez, R., Huang, W., Finnen, R., Bragg, C., Flint, S. J. Adenovirus E1B 55-kilodalton protein is required for both regulation of mRNA export and efficient entry into the late phase of infection in normal human fibroblasts. J. Virol. 80, 964-974 (2006).
  12. Castillo-Villanueva, E., et al. The Mre11 Cellular Protein Is Modified by Conjugation of Both SUMO-1 and SUMO-2/3 during Adenovirus Infection. ISRN Virology. 2014, 14(2014).
  13. Morris, S. J., Scott, G. E., Leppard, K. N. Adenovirus late-phase infection is controlled by a novel L4 promoter. J. Virol. 84, 7096-7104 (2010).
  14. Wright, J., Leppard, K. N. The human adenovirus 5 L4 promoter is activated by cellular stress response protein p53. J. Virol. 87, 11617-11625 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Viral Replication CompartmentsAdenovirus infected CellsSub nuclear Fraction IsolationVelocity Gradient CentrifugationCell free SystemNuclear Lysate PreparationImmunofluorescence AnalysisE2A DNA Binding ProteinViral DNA EnrichmentHost cell Interactions

Related Articles