يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

واصفا تنظيم النسخ عامل تابع للالرنا الميكروي Transcriptome على

7.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53300

⸱

يونيو 15, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology, Davidoff Cancer Center, Rabin Medical Center, 2The Center of Nanoscience and Nanotechnology, Tel Aviv University, 3Experimental Therapeutics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

في هذه المقالة

ملخص

نقترح هنا استراتيجية لدراسة تأثير عامل النسخ ذي الأهمية على نسخ الحمض النووي الريبي الصغير باستخدام البيانات المتاحة للجمهور والموارد الحسابية وبيانات الإنتاجية العالية من مصفوفات الحمض النووي الريبي الصغير بعد نقل الخلايا ذات دبوس الشعر الصغير (sh) RNA الذي يستهدف عامل نسخ ذي أهمية.

الملخص

في حين تم دراسة تنظيم النسخ من البروتين الجينات الترميز على نطاق واسع، لا يعرف إلا القليل عن الكيفية التي تشارك عوامل النسخ في النسخ من الرنا غير الترميز، وتحديدا من microRNAs. هنا، نقترح استراتيجية لدراسة الدور المحتمل للعامل النسخ في تنظيم النسخ من microRNAs باستخدام البيانات المتاحة علنا ​​والموارد الحاسوبية والبيانات إنتاجية عالية. نحن نستخدم التوقيع جينية H3K4me3 لتحديد المروجين الرنا الميكروي والكروماتين مناعي (رقاقة) البيانات -sequencing من مشروع ترميز لتحديد المروجين الرنا الميكروي التي المخصب مع مواقع عامل النسخ ملزمة. قبل transfecting الخلايا في المصالح مع shRNA استهداف عامل النسخ من الفائدة وتعريض الخلايا لالرنا الميكروي مجموعة، ونحن ندرس تأثير هذا العامل النسخ على Transcriptome على الرنا الميكروي. كمثال توضيحي نستخدم دراستنا حول تأثير STAT3 على Transcriptome على الرنا الميكروي من لاي المزمنسرطان الدم mphocytic (CLL) الخلايا.

المقدمة

الرنا الميكروية هي الذاتية الرنا التنظيمية غير الترميز الصغيرة التي تعمل عادة المنظمين سلبية التعبير مرنا على مستوى posttranscriptional. ما يقرب من 1000 غير الترميز 20-25 النوكليوتيدات توجد الرنا الميكروية طويلة في الجينوم البشري 1،2. الرنا الميكروية تنظيم التعبير الجيني من خلال قاعدة الاقتران الكنسي بين تسلسل البذور من الرنا الميكروي ومكملة تسلسل مباراة بذوره، والذي يقع عادة في المنطقة غير مترجمة 3 '(UTR) من من mRNAs الهدف. بشكل جماعي، الرنا الميكروية تنظم أكثر من 30٪ من البروتين ترميز الجينات 3، ولكن لا يعرف سوى القليل عن النسخ من الحمض النووي من microRNAs. فقد قيل أن تنظيم الرنا الميكروي النسخ مماثلة لتلك التي من مرنا 4،5. على وجه الخصوص، على غرار نشاطها في تعزيز نسخ من جينات ترميز البروتين، ويعتقد أن عوامل النسخ لتفعيل النسخ من microRNAs 6. النسخ عامل متم الإبلاغ عن icroRNA التفاعل كعامل المغير في التعبير الجيني 7، ويمكن أن تشكل أيضا تغذية راجعة وحلقات التغذية إلى الأمام. على سبيل المثال، ذكرت Yamakuchi آخرون حلقة التغذية المرتدة التي البروتين p53 الحث على التعبير عن microRNA34a، وهذا بدوره يحول دون ترجمة سرت البروتين p53 كاظمة وبالتالي زيادة نشاط البروتين p53 8.

في حين تم الإبلاغ عن أمثلة محددة من عامل النسخ التعبير يعتمد من microRNAs، وهي طريقة مقبولة الذي يقدم معلومات عن كيف يمكن لعامل النسخ التي تهم ينظم التعبير عن الرنا الميكروي-Transcriptome على غير متوفرة. والغرض من هذا البروتوكول المقترح هنا هو تقديم وصف في عمق النسخ التي تعتمد على عامل تنظيم الرنا الميكروي-Transcriptome على. من خلال الجمع بين البيانات المتاحة علنا، وأدوات المعلوماتية الحيوية واستخدام تكنولوجيا متطورة، فإن الباحثين الذين يتابعون هذه الخوارزمية تكون قادرة على التقاط على نطاق الجينوم كيف يمكن لأيعامل النسخ في أي نوع من الخلايا في المصالح ينظم التعبير عن الرنا الميكروي-Transcriptome على ولاستكشاف مساهمة المفترضة من النسخ عامل مرنا في تنظيم التعبير الرنا الميكروي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تحديد النسخ عامل مواقع الربط في المروج من الجينات الرنا الميكروي عن طريق نهج استخراج البيانات

  1. استخدام جامعة كاليفورنيا سانتا كروز (UCSC) متصفح الجينوم لاستخراج لونين البيانات مناعي (رقاقة) تسلسل ولدت كجزء من موسوعة مشروع عنصر الحمض النووي (ترميز).
    1. فتح متصفح الجدول في متصفح الجينوم UCSC.
    2. استخدام المواصفات التالية لاستخراج الجدول: كليد: (الثدييات)، الجينوم: (الإنسان)، الجمعية: (Feb2009 (GRch37 / hg18))، مجموعة: (التنظيم)، المسار (TxnFactorChIP)، الجدول: (weEncoderesTFbsCo7steredv3)، والمنطقة : (الجينوم)، تنسيق الإخراج (كل الجينات من الجدول المحدد).
    3. حفظ الإخراج من 1.1.2 كملف .txt وفي جدول بيانات.
    4. ترتيب وتصفية للعامل النسخ من الفائدة (على سبيل المثال، STAT2).
  2. استخدام قائمة المروجين الرنا الميكروي على أساس H3K4me3 علم التخلق التوقيع متاحة في Baeer وآخرون. 9 . نسخ هذه القائمة في ملف txt.
  3. لمطابقة وفقا للإحداثيات على الجينوم البشري، خريطة البيانات من 1.1 و 1.2 (على سبيل المثال، STAT3 ملزمة على المروجين الرنا الميكروي المفترض) وتحديد متوسط ​​ملزمة تقارب باستخدام قانون مكتوب في C حاد على النحو المبين في تكميلية ملف 1 الترميز.

2. استخدام shRNA إلى أسفل تنظيم التعبير من النسخ عامل الاهتمام

  1. لوحة 1.5 × 10 6 خلايا من 293 خط خلية الكلى الجنينية البشرية في 10 سم لوحة في حوالي 50٪ التقاء (DMEM مع FBS 10٪).
  2. خلايا Transfect من 293 خط خلية الكلى الجنينية البشرية مع 5 ميكروغرام من الخضراء الفيروسة البطيئة البروتين مضان (GFP) التي تحتوي على shRNA موجهة إلى عامل النسخ من الفائدة ومع 5 ميكروغرام من ناقلات التعبئة والتغليف باستخدام كاشف ترنسفكأيشن لخلايا ملتصقة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  3. كعنصر تحكم، transfect الخلايا من 293 خط خلية الكلى الجنينية البشرية معتدافعت shRNA وناقلات التعبئة والتغليف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  4. حافظ على مزيج ترنسفكأيشن على الخلايا لمدة 16 ساعة (عند 37 درجة مئوية، CO 2 حاضنة)، ثم تغيير وسائل الإعلام إلى 10 مل الطازجة 10٪ DMEM وسائل الاعلام مع FBS 10٪.
  5. الانتظار لمدة 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، الطرد المركزي ثقافة خلية (300 x ج، 5 دقائق) وجمع طاف المعدية. تصفية طاف من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرون (25 ملم السطحي السليلوز الحرة خلات غشاء) لإزالة أي خلايا العائمة.
  6. تركيز طاف وجمع الفيروسة البطيئة باستخدام جهاز فلتر ultracentrifugal مع عتبة 100 كيلو دالتون. وكان 60 دقيقة حتى حجم التركيز إلى أقل من 250 ميكرولتر - تدور في 950 x ج لمدة 30 عاما. تخزين الفيروس تتركز في -80 درجة مئوية.
  7. Transfect الخلايا مع الفيروسة البطيئة. إزالة الفيروسة البطيئة المجمدة من الفريزر -80 درجة مئوية وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. نقل 100 ميكرولتر من طاف الفيروسي إلى الطازجة 1.5 مل microfuge أنبوب.
    1. برينز يصل حجم في أنبوب إلى 1 مل مع انخفاض المتوسطة المصل. إضافة بروميد hexadimethrine إلى 1 مل تعليق الفيروس لتركيز النهائي من 10 نانوغرام / مل، المزيج بلطف والسماح للخليط الوقوف لمدة 5 دقائق.
  8. الطرد المركزي 5 × 10 6 خلايا لكل التنبيغ وبلطف resuspend الكرية خلية في 0.5 مل من وسائل الاعلام التي تحتوي على الفيروس. السماح للخلايا البقاء في الحاضنة لمدة 4-24 ساعة، ثم يضاف 0.5 مل من المتوسط ​​مع 20٪ FBS إلى تركيز النهائي من 10٪ FBS.
  9. الانتظار لمدة 48 إلى 72 ساعة وصمة عار على الخلايا مع يوديد propidium (PI) وبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. حماية الخلايا من الضوء واستخدام فارز FACS لقياس معدلات GFP + / PI - الخلايا. منذ البقع PI الخلايا الميتة فقط، هذا المعدل هو تقدير الكفاءة ترنسفكأيشن في الخلايا الحية.
  10. فرز السكان الخلية إيجابي في التعبير GFP (GFP +) من قبل FACS فارز كما هو موضح سابقا (10).
  11. استخدام نمط غربي آسيالنشاف المناعة آكانيوز كما هو موضح سابقا 10 لتحديد مستويات عامل النسخ من الفائدة قبل وبعد اصابة الخلايا من الفائدة (على سبيل المثال، خلايا CLL) مع shRNA المعينة.

3. تحديد مستوى التعبير من الرنا الميكروي Transcriptome على في خلايا Transfected مع النسخ عامل-shRNA

  1. عزل الحمض النووي الريبي باستخدام طقم التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  2. تسمية الحمض النووي الريبي وهجن إلى الرنا الميكروي ميكروأري 11.
  3. تحديد الرنا الميكروي وأعرب تفاضلي في الخلايا transfected مع النسخ عامل shRNA أو مع وجود ضوابط ناقلات الفارغة 5.
  4. تحقق من صحة النتائج ميكروأري لالرنا الميكروية أكثر أعرب تفاضلي في الوقت الحقيقي باستخدام PCR 5.

4. تحديد التداخل بين المعلومات البيولوجية والنهج shRNA في وصف Transcriptome على المعالين النسخ عامل

  1. لديتفرو القاقم النسب المتوقعة والمرصودة للجينات الرنا الميكروي التي تأوي عامل النسخ المواقع في المروجين تجليدها وكانت downregulated في النسخ عامل shRNA الخلايا transfected، قم بما يلي:
    1. الحصول على نسبة من الجينات التي تأوي عامل النسخ من الفائدة في المروج / مجموع الرنا الميكروي الخاصة بهم من قائمة التي تم إنشاؤها في 1.3. هذه القائمة هي النسبة المتوقعة (على سبيل المثال، جينات الرنا الميكروي مع مواقع STAT3 ملزمة / مجموع جينات الرنا الميكروي اختبار = 0.25).
    2. تحديد عدد من الجينات التي تم downregulated في النسخ عامل shRNA الخلايا transfected من قائمة التي تم إنشاؤها في 3.3 ويوجد عامل النسخ من مواقع مصلحة ملزمة من قائمة التي تم إنشاؤها في 1.3. هذا الرقم / العدد الكلي للجينات downregulated هو النسبة المرصودة (على سبيل المثال، جينات الرنا الميكروي مع STAT3 مواقع الربط / عدد من microRNAs downregulated = 0.6).
  2. استخدام χ2 إحصاءات مقارنة نسب احظ ويتوقع التي تم إنشاؤها أعلاه وتحديد ما إذا كان يتم إثراء قائمة من الجينات التي تم downregulated في النسخ عامل shRNA الخلايا transfected مع مواقع عامل النسخ ملزمة في المروج لها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

STAT3 هو عامل النسخ الذي يدفع عادة نسخ من الجينات التي لديها لمكافحة أفكارك والآثار التكاثري 12. سواء STAT3 تؤثر أيضا على غير الترميز Transcriptome على RNA غير معروف حاليا. في جميع الخلايا CLL STAT3 غير فسفرته جوهري على سيرين 707 بقايا 10،13. المكوكات Phosphoserine STAT3 إلى النواة، يربط الحمض النووي، وينشط الجينات المعروف أن تفعيلها من خلال التيروزين pSTAT3 في أنواع الخلايا الأخرى 10. لأنه يتميز CLL من رفع القيود ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد تمت دراسة الآلية الكامنة وراء RNA البلمرة ثانيا: النسخ يعتمد على البروتين الجينات الترميز على نطاق واسع. في حين أن هذه العناصر تشكل سوى 1٪ - 2٪ من الجينوم البشري، والأدلة من مشروع ترميز تشير إلى أن أكثر من 80٪ من الجينوم البشري قد تخضع النسخ 17 وما ينظم النسخ من عناصر الحمض النووي غير الترميز لا يزال غير معروف إلى حد كبير 6 .

العديد من الدراسات، التي أشارت إلى أن بول الثاني هو مسؤول أيضا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذه الدراسة عن طريق منحة من مؤسسة الأبحاث العالمية CLL. ويدعم إم دي أندرسون في جزء من المعاهد الوطنية للصحة من خلال سرطان مركز دعم جرانت (P30CA16672).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Lipofectamin 2000Life Technologies11668027
0.45 & micro; مرشح حقنة mThermo Scientific (Nalgene)190-2545
جهاز تصفية الطرد المركزي الفائق Amicon مع عتبة 100 & nbsp ؛ كيلو داميرك ميليبور
بوليبرينميرك ميليبورTR-1003-G
كاشف تريزولتاختنايات الحياة (Invitrogen)15596-026
293 خط الخلية البشريسيجماألدريتش 85120602

المراجع

  1. Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
  2. Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
  3. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  4. Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences. Biol Direct. 6, 61(2011).
  5. Rozovski, U., et al. Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells. Mol Cancer. 12, 50(2013).
  6. Turner, M. J., Slack, F. J. Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding. RNA Biol. 6, 49-53 (2009).
  7. Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity. Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).
  8. Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop. Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).
  9. Baer, C., et al. Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).
  10. Hazan-Halevy, I., et al. STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells. Blood. 115, 2852-2863 (2010).
  11. Melo, S. A., et al. A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function. Nat Genet. 41, 365-370 (2009).
  12. Akira, S. Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice. Stem Cells. 17, 138-146 (1999).
  13. Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues. J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).
  14. Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).
  15. Consortium, E. P. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS biology. 9, e1001046(2011).
  16. Miranda, K. C., et al. A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes. Cell. 126, 1203-1217 (2006).
  17. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, 57-74 (2012).
  18. Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene. Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).
  19. Corcoran, D. L., et al. Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data. PLoS One. 4, e5279(2009).
  20. Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection. Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

H3K4me3 shRNA STAT3
واصفا تنظيم النسخ عامل تابع للالرنا الميكروي Transcriptome على
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.