نقوم بتفصيل بروتوكول لمراقبة سلوك العدلات والخلايا الوحيدة في الأوردة المساريقية في ظل الحالة المستقرة والظروف الالتهابية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر داخل الحيوية على الفئران المخدرة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير العدلات وحيدات في مساريقي الأوردة التي كتبها حيوي داخلي المجهري على الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
استجابة مناعية فعالة تعتمد على التعبئة السريعة من الكريات البيض في الدم إلى موقع العدوى أو الإصابة. التحقيق هجرة الكريات البيض في الجسم الحي أمر بالغ الأهمية لفهم الأساس الجزيئي للهجرة الكريات البيض transendothelial والتفاعل مع بطانة الأوعية الدموية. واحد طريقة فعالة ينطوي intravital المجهري على الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية في خلايا الفائدة.
هنا نقدم بروتوكول للحيدات التصوير والعدلات في 3 CX CR1 GFP / وزن الرابع الماوس حقن العدلات البرتقال المسمى صبغ مع مجهر متحد البؤر مقلوب. تجمع الأفلام مرور الزمن من 30 دقيقة إلى عدة ساعات من التصوير السماح للتحليل سلوك الكريات البيض في الأوردة المساريقي في ظل ظروف الدولة والتهابات ثابتة على حد سواء. نحن أيضا وصف الخطوات للحث محليا الأوعية الدموية التهاب مع TLR2 / TLR1 ناهض Pam3SK4 ورصد subsequeالتوظيف الإقليم الشمالي العدلات وحيدات.
ويمكن أيضا أن تقنية قدم استخدامها لرصد الشعوب الأخرى من الكريات البيض والتحقيق جزيئات المتورطين في تجنيد الكريات البيض أو الاتجار باستخدام المنبهات الأخرى أو الفئران المعدلة وراثيا.
المقدمة
العدلات وحيدات هي خلايا الجهاز المناعي الفطري التي تنتشر باستمرار في الدم. على الإصابة أو العدوى، وإشارات التهابات تحفز الكرية البيضاء انسلال إلى الأنسجة التالفة والمصابة، وبدء في هذه الوثيقة استجابة مناعية خلوية 1-3. سرعة تعبئة الكريات البيض تحدد نتيجة إيجابية من الاستجابات المناعية. هذه العمليات معقدة تعتمد على جزيئات محددة (على سبيل المثال، selectins، كيموكينات محددة البطانة) موجودة على البطانة الملتهبة التي تساعد على إقامة اتصالات بين لاصقة تعميم الكريات البيض والبطانة 1-3. لحصول على رؤى على جزيئات المتورطين في الكريات البيض سلسلة التوظيف، من المهم أن تصور حركية تجنيد خلية وتتبع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ الإجراءات الحيوانية وفقا للجنة الأخلاقية المؤسسية رعاية الحيوان في جنيف، سويسرا والمكتب البيطري كانتون: ملاحظة. إذن عدد GE / 63/14.
1. إعداد تعليق خلية واحدة من نخاع العظام
- الماوس التضحية (8-12 اسبوع) خلع عنق الرحم. تعقيم رجليه الخلفيتين مع 70٪ من الإيثانول. إزالة الجلد من رجليه الخلفيتين.
- تشريح خارج عظام الفخذ الماوس وtibias وإزالة الأنسجة من الساقين مع مشرط. شطف الساقين مع 90٪ من الإيثانول ومكان في صحن الثقافة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يصف المخطوطة بروتوكول الأمثل لمراقبة بسهولة سلوك حيدات والعدلات في عروق المساريقي الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي. استخدام الغرفة 37 درجة مئوية thermostated هو إلزامي للحفاظ على درجة حرارة الماوس، وكذلك نتيجة لحركة تعتمد درجة حرارة من الكريات البيض. يتم عرض إعداد الماوس في الشكل 1. الشكل 2 يوضح كل منطقة المشاهدة تحت المجهر. الضوء المرسل يسمح بتحديد الأوردة المساريقي (السهم الأحمر) والشرايين (السهم الأزرق).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
المنهجيات وصفها في هذه المخطوطة توفر نهجا ثابتا لدراسة الوحيدات والسلوك العدلة بكفاءة في عروق المساريقي في ظل ظروف الدولة والتهابات ثابتة.
الخطوة الحاسمة لإعداد هو الشلل في الأمعاء مع الأنسجة PBS المبللة. إذا أجريت بشكل صحيح، تتعرض الأوعية المساريقي لطيف على ساترة عن الحصول على الصور. وهذا يتيح اختيار العديد من المجالات التي تهم مراقبة سلوك الكريات البيض في الأوردة المساريقي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل EMBO (إلى Y.E.) و Foundation Machaon (إلى Y.E.) و SNSF (إلى BAI). نشكر مرفق التصوير الحيوي الأساسي على توفر مجهر نيكون A1r والمساعدة الفنية. نشكر السيدة كلاريسا بارتلي على تصحيح اللغة الإنجليزية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 5 مل أنابيب القاع المستديرة من البوليسترين ؛ | بيكتون ديكنسون | 352058 | |
| خطة CFI 10x Apochromat 0.45 DT: 4 مم ؛ | خطة نيكون | ||
| 20x CFI Apochromat VC 0.75 DT:1mm | نيكون | ||
| خلية المقتفي البرتقالي CMRA صبغ | الحياة تكنولوجيز | C34551 | |
| EasySep تقنيات الخلايا الجذعية المغناطيسية | 18000 | ||
| EasySep Mouse Genetrophil Enrichement Kit | تقنيات الخلايا الجذعية | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| زيت الغمر نوع A | نيكون | أي زيت لزج ; | |
| نظام التحكم في درجة الحرارة Life Box | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R مجهر متحد البؤر Nikon | A1R | مجهر مقلوب نيكون A1R ، مرحلة x / y / z بمحركات ، برنامج عناصر | |
| NIS PBS | Life Technologies | D8537 | |
| أحمر الفينول الحر DMEM / F12 | Life Technologies | 21041-025 | أي وسط خال من الفينول الأحمر مناسب |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | |
| الجذعية | لمصل الفئران | المدرجة في مجموعة أدوات إثراء العدلات EasySep | |
| طبق زراعة الأنسجة 100 | TPP | 93100 |
المراجع
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
