يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR) للكشف عن مرنا محددة الخلايا السرطانية تمثل ورم خبيث في الأنسجة الماوس الرئة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقييم الرئة الانبثاث في ماوس الثديية ورم المجموعات بواسطة الكمي في الوقت الحقيقي PCR
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
المرض المنتشر هو انتشار الخلايا السرطانية الخبيثة من موقع السرطان الأساسي لجهاز بعيد وهو السبب الرئيسي لسرطان الوفيات المرتبطة 1. وتشمل المواقع المشتركة للانتشار النقيلي الرئة، العقدة الليمفاوية والمخ، والعظام 2. الآليات التي تدفع الانبثاث هي مناطق مكثفة لأبحاث السرطان. ونتيجة لذلك، المقايسات فعالة لقياس العبء المنتشر في مواقع بعيدة الانبثاث هي مفيدة لأبحاث السرطان. تقييم الانبثاث الرئة في نماذج ورم الثدي تتم عادة عن طريق الملاحظة النوعية الإجمالية للأنسجة الرئة بعد تشريح. الأساليب الكمية لتقييم ورم خبيث تقتصر حاليا لخارج الحي وتقنيات التصوير مقرها الجسم الحي والتي تتطلب المعلمات التي يحددها المستخدم. العديد من هذه التقنيات هي في مستوى الحي كله وليس على المستوى الخلوي 3-6. على الرغم من أن وسائل التصوير الجديدة استخدام متعدد الفوتون المجهر قادرة على تقييم metastasis على المستوى الخلوي 7، هذه الإجراءات أنيقة للغاية هي أكثر ملاءمة لتقييم آليات نشر بدلا من التقييم الكمي للعبء النقيلي. هنا، يتم تقديم طريقة بسيطة في المختبر لتقييم كمي لورم خبيث. باستخدام كمية الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR)، ويمكن الكشف عن مرنا الخلايا السرطانية معين داخل أنسجة الرئة الماوس.
المقدمة
ويقترح تحليل QRT-PCR كوسيلة لتقييم الورم ورم خبيث. ويقترح هذا الأسلوب كبديل للمستخدمين الذين يرغبون في تقييم ورم خبيث ولكن قد لا يكون الحصول على معدات معينة مثل في الجسم الحي معدات التصوير أو مضان المجسام قادرة. وتقدم يتبع مناقشة الأساليب المستخدمة عادة من قبل مظاهرة لكيف يمكن استخدام تحليل QRT-PCR إما منفصلة أو كوسيلة مصاحب لتقييم ورم خبيث. هذا الإجراء لديه القدرة على تقديم تحليل كمي لعبء النقيلي.
الطرق المعيارية لتحليل الإجمالي، بما في ذلك التصور من الرئتين تحت stereomicroscope وكذلك باجتزاء المسلسل تليها الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ من أنسجة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
بروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية والمعايير رعاية الحيوان من كلية الطب بجامعة ولاية كارولينا الجنوبية (MUSC) ورعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC).
1. الرئة تشريح
- الثديية تشريح الورم (اختياري اعتمادا على أهداف الدراسة وعما إذا تم إجراء تحليل الورم الرئيسي أو الوريد الذيل حقن).
- الموت ببطء الماوس باستخدام جرعة قاتلة من التخدير الأيزوفلورين وفقا لIACUC وتنظيم الجامعة. تأكيد euthanization بواسطة ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ما وراء الوقت المستغرق لأداء التلقيح الأولي من الخلايا السرطانية في حيوانات التجارب وإذا المنفذ، والابتدائي في تحليل الورم الجسم الحي، وحصاد الأنسجة والعزلة RNA، وتحليل QRT-PCR هو إجراء 1-2 يوم (الشكل 1) .
مثال على التحليل الإجمالي هو التصوير إضاءة الحيوية لتقييم الخلايا السرطانية داخل أنسجة الرئة. هنا، تم إجراء ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول استخدام QRT-PCR لتقييم الثديية ورم خبيث الخلايا السرطانية إلى الرئة باستخدام نموذج طعم أجنبي الماوس. ومن المسلم به أن التقنيات الأخرى، بما في ذلك التصوير إضاءة الحيوية، متاحة وفعالة للكشف عن ورم خبيث الرغم من وجود قيمهم والقيود أيضا. البيانات المقدمة توحي بأن QRT-PCR يوفر تدبيرا فعالا لكشف مرنا المستمدة من ورم داخل أنسجة الرئة لتحديد الكميات من إجمالي ورم خبيث. يقترح هذا التحليل QRT-PCR يوفر طريقة الثانوي التي يمكن أن تكمل أو أن يقوم بدلا من هذه التقنيات التصوير.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا يعملون ESY وMAA التي كتبها FirstString البحوث وشركة لا يحملون أي مصلحة مالية في الشركة. قدمت FirstString أبحاث شركة البيانات التصوير luciferase المراسل الذي قدم في هذه المخطوطة. GSG هو الرئيس والرئيس التنفيذي لشركة أبحاث FirstString. CLG هو موظف للبحوث FirstString. GSG وCLG ديك خيارات الأسهم الصادرة عن أبحاث FirstString.
شكر وتقدير
يتم اعتماد مختبر يه بواسطة تمويل البحوث من الجمعية الأمريكية للسرطان المؤسسية منحة بحثية (IRG-97-219-14) منحت لمركز هولينغ السرطان في MUSC، من خلال تمويل البحوث من منحة وزارة الدفاع (W81XWH-11-2- 0229) في MUSC، وجائزة من القلق مؤسسة (لESY).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| DNAse | Thermo Scientific | EN0521 | |
| GeneJet RNA Isolation | Kit Thermo Scientific | K0732 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix ل QRT-PCR | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix ؛ | بيو راد | 172-5121 | |
| اختبار PrimePCR SYBR الأخضر: ERBB2 ، Human ؛ | بيو راد | 100-25636 | |
| قالب PrimePCR لمقايسة SYBR الخضراء: ERBB2 ، Human ؛ | بيو راد | 100-25716 | |
| تسلسل التمهيدي | ل-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG |
المراجع
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. Modeling metastasis in the mouse. Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).
- Kim, I. S., Baek, S. H.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
